一种阿魏酸糖酯组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于阿魏酸糖酯技术领域，具体涉及一种阿魏酸糖酯组合物及其制备方法和应用。

背景技术

阿魏酸糖酯(Feruloylated glycosides，FGs)是阿魏酸羧基与糖中不同位置上的糖羟基酯化而形成的一类化合物。全谷物进入消化道后，可经由后肠道微生物发酵产生FGs。研究发现FGs具有比游离阿魏酸(Ferulic acid，FA)更强的抗氧化能力，并且具有促进双歧杆菌增殖、抑制红细胞溶血和抵抗糖尿病的作用。

阿魏酸糖酯可以通过酸法或酶法处理玉米、小麦、燕麦等谷物得到不同聚合度的FGs。如Allerdings等在文献(Isolation and structural identification of complexferuloylated heteroxylan side-chains from maize bran.Phytochemistry 2006,67(12):1276-1286)报道了用酸水解法从玉米麸中可获得α-D-吡喃型半乳糖基-(1,3)-α-L-吡喃型半乳糖基-(1,2)-β-吡喃型木糖-(1,2)-O-(5-O-(反式-阿魏酰)-L-呋喃型阿拉伯糖(F-Ara-(1,2)-Xyl-(1,2)-Gal-(1,3)-Gal)。Wang和Lequart等在文献(On-lineseparation and structural characterisation of feruloylated oligosaccharidesfrom wheat bran using HPLC-ESI-MS n.Food Chemistry 2009,115(4):1529-1541；Hydrolysis of wheat bran and straw by an endoxylanase:production andstructural characterization of cinnamoyl-oligosaccharides.CarbohydrateResearch 1999,319(1-4):102.)报道了从小麦麸皮中用酶法可获得O-(5-O-(反式-阿魏酰)-α-L-呋喃型-阿拉伯糖基)-(1,3)-O-β-吡喃型木糖(F-Ara-(1,3)-Xyl)，O-β-D-吡喃型木糖基-(1,4)O-(5-O-(反式-阿魏酰)-α-L-呋喃型阿拉伯糖基-(1,3))-O-β-D-吡喃型木糖基-(1,4)-吡喃型木糖基-(1,4)-吡喃型木糖基(Xyl-(1,4)-(F-Ara-(1,3)-Xyl-(1,4))-Xyl)和O-β-D-吡喃型木糖基-(1,4)-O-(5-O-阿魏酰-α-L-呋喃型阿拉伯糖基-(1,3))-O-β-D-吡喃型木糖基-(1,4)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1,4)–D-吡喃型木糖(F-Ara-(1,3)-Xyl-(1,4)-Xyl-(1,4)-Xyl)。

研究者认为，阿魏酸糖酯中各单体的组成，即糖基部分的单糖组成、比例、聚合度以及酚酸含量等对其生物活性和均有显著的影响，但并未给出发挥较好生物活性的具体的结构及配比，特别是改善肠道功能紊乱方面尚未有技术报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阿魏酸糖酯组合物及其制备方法和应用，具体地提供了一种以阿魏酸糖酯为活性成分的组合物及其制备方法，该组合物可以显著改善肠道功能紊乱。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种阿魏酸糖酯组合物，由以下活性成分组成：

5-O-(反式一阿魏酰)-α-L-阿拉伯糖(FA)；

O-[5-O-(反式-阿魏酰)-α-L-呋喃型阿拉伯糖基]-(1→3)-O-β-D-吡喃型木糖

(FAX)；

O-β-D-吡喃型木糖基-(1→4)-O-[5-O-(反式-阿魏酰)-α-L-呋喃型阿拉伯糖基]-(1→3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1→4)-D-吡喃型木糖(FAX3)

O-β-D-吡喃型木糖基-(1→4)-O-[5-O-阿魏酰-α-L-呋喃型阿拉伯糖基]-(1→

3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃型木糖-(1→4)-D-吡喃型木糖(FAX4)。

本发明中的FA，其结构式如下：

本发明中的FAX，其结构式如下：

本发明中的FAX3，其结构式如下：

本发明中的FAX4，其结构式如下：

优选地，所述阿魏酸糖酯组合物，按质量分数100％计，由以下的活性成分组成：

5-O-(反式一阿魏酰)-α-L-阿拉伯糖5-20％；

O-[5-O-(反式-阿魏酰)-α-L-呋喃型阿拉伯糖基]-(1→3)-O-β-D-吡喃型木糖30-90％；

O-β-D-吡喃型木糖基-(1→4)-O-[5-O-(反式-阿魏酰)-α-L-呋喃型阿拉伯糖基]-(1→3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1→4)-D-吡喃型木糖5-20％；

O-β-D-吡喃型木糖基-(1→4)-O-[5-O-阿魏酰-α-L-呋喃型阿拉伯糖基]-(1→3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃型木糖-(1→4)-D-吡喃型木糖1-10％。

本发明中活性成分FA、FAX、FAX3和FAX4均可以采用常规文献公开的制备方法得到(如FA可参考McCallum等，FAX可参考Smith等，FAX3可参考Ralet、Rhdoes和袁小平等、FAX4可参考Lequan、袁小平等)。

优选地，所述阿魏酸糖酯的组合物可以通过以下制备方法获得。

具体地，所述阿魏酸糖酯的组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1：将谷物麸皮浸于离子液体中加热处理后，洗去离子液体，得残渣液；

S2：将步骤S1得到的残渣液用木聚糖酶酶解，得酶解液；

S3：将步骤S2得到的酶解液过大孔树脂柱层析，层析液旋蒸浓缩，冷冻干燥，得所述阿魏酸糖酯组合物。

优选地，步骤S1中所述谷物包括玉米、小麦和燕麦中的至少一种；所述离子液体为质量百分数5-20％的1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐([EMIM]OAc)。

优选地，步骤S1中所述谷物麸皮和离子液体的质量体积比(kg/L)为1:10-20。

优选地，步骤S1中所述加热处理为：60-120℃下处理3-5h。

优选地，所述步骤S1的替代方案为：谷物麸皮经121℃高压蒸汽处理灭酶后，依次经耐温α-淀粉酶、中性蛋白酶和精制糖化酶处理，去除谷物麸皮中的淀粉和蛋白质，将酶解液离心并用蒸馏水洗涤后得麸皮不溶性膳食纤维。

优选地，步骤S2中所述木聚糖酶的添加量为残渣液或麸皮不溶性膳食纤维体积的0.5-2.0％，酶活力为30-120U/mL；所述酶解为：在55-65℃下酶解0.5-1.5h。

本发明还提供了前述阿魏酸糖酯组合物在制备改善肠道功能紊乱的产品中的应用。

优选地，所述肠道功能紊乱包括便秘和/或屏障功能损伤。

优选地，所述产品为药品、食品或保健品。

优选地，所述应用中所述阿魏酸糖酯组合物的日给药剂量为10-100mg/kg。

本发明还提供了一种改善肠道功能紊乱的产品，包括前述阿魏酸糖酯组合物。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的阿魏酸糖酯组合物可以显著上调TNF-α引起的单层细胞屏障损伤后的TEER值，恢复受损Caco2细胞上皮单层的完整性。

(2)本发明的阿魏酸糖酯组合物，以阿魏酸糖酯为唯一活性成分，通过不同聚合度的阿魏酸糖酯单体的配合，可以显著改善小鼠便秘和肠道屏障功能损伤。

(3)本发明提供的阿魏酸糖酯组合物的制备方法，相对现有技术，其工艺简单、成本低，为阿魏酸糖酯的应用提供了新的方向。

附图说明

图1为阿魏酸糖酯组合物对Caco-2细胞单层跨膜电阻的影响；其中，*指与造模组相比呈显著性关系，p<0.05，**指与造模组相比呈显著性关系，p<0.01，***指与造模组相比呈显著性关系，p<0.001。

图2为酚酸糖酯组合物对便秘小鼠胃内容物残留率和小肠推进率的影响；其中，不同的小写字母代表同一指标不同组间存在显著性差异，c表示该组的数值最大，b表示该组的数值次之，c表示该组的数值最小，ab表示该组的数值介于a和b之间，bc该组的数值介于b和c之间，显著水平p＜0.05。

图3为阿魏酸糖酯组合物对便秘小鼠胃内容物残留率和小肠推进率的影响，其中，不同的小写字母代表同一指标不同组间存在显著性差异，c表示该组的数值最大，b表示该组的数值次之，c表示该组的数值最小，ab表示该组的数值介于a和b之间，bc该组的数值介于b和c之间，显著水平p＜0.05。

图4为阿魏酸糖酯组合物对血清胃动素的影响，其中，不同的小写字母代表同一指标不同组间存在显著性差异，c表示该组的数值最大，b表示该组的数值次之，c表示该组的数值最小，显著水平p＜0.05。

图5为阿魏酸糖酯组合物对乙酰胆碱酯酶水平的影响，其中，不同的小写字母代表同一指标不同组间存在显著性差异，c表示该组的数值最大，b表示该组的数值次之，c表示该组的数值最小，ab表示该组的数值介于a和b之间，显著水平p＜0.05。

图6为阿魏酸糖酯组合物对小鼠肠上皮通透性的影响，其中，*指与正常对照组相比呈显著性关系，p<0.05；#指与模型组相比呈显显著性关系，p<0.05。

图7为阿魏酸糖酯组合物对小鼠DAI的影响，其中，***指与正常对照组相比呈显著性关系，p<0.001；#指与模型组相比呈显著性关系，p<0.05；##指与模型组相比呈显著性关系，p<0.01；###指与模型组相比呈显著性关系，p<0.001。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详述。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例1：阿魏酸糖酯组合物

所述阿魏酸糖酯组合物，按100％质量分数计，由以下的活性成分组成：FA8.42％、FAX 70.62％、FAX3 15.5％和FAX4 5.46％。

实施例2：阿魏酸糖酯组合物

所述阿魏酸糖酯组合物，按100％质量分数计，由以下的活性成分组成：FA5％、FAX89％、FAX3 5％和FAX4 1％。

实施例3：阿魏酸糖酯组合物

所述阿魏酸糖酯组合物，按质量分数100％计，由以下的活性成分组成：FA20％、FAX 50％、FAX3 20％和FAX4 10％。

一、不同单体比例对阿魏酸糖酯组合物对TNF-a诱导Caco-2细胞上皮屏障完整性的影响

1、实验方法：Caco-2细胞在Transwell板的上室形成连续且致密的单层屏障模型，分别用TNF-α及A1、A2、A3、A4和A5孵育24h，利用电阻仪测定单层细胞TEER值：

其中，A1组为本发明实施例1提供的阿魏酸糖酯组合物；A2组为本发明实施例2提供的阿魏酸糖酯组合物；A3组为本发明实施例3提供的阿魏酸糖酯组合物；A4组为对比例1提供的阿魏酸糖酯组合物，具体为：按100％质量分数计，FA30.48％、FAX 17.96％、FAX332.66％和FAX4 18.9％；

A5组为对比例2提供的阿魏酸糖酯组合物，具体为：按100％质量分数计，FA0.98％、FAX 0.56％、FAX3 16.82％和FAX4 81.64％。

2、实验结果

如图1所示，相比模型组，A1组、A2组和A3组的TEER值均显著提高(P小于0.01)，表明本发明提供的阿魏酸糖酯组合物可以恢复肠道屏障损伤，其中，实施例1可以显著上调TNF-α引起的单层细胞屏障损伤后的TEER值，恢复程度超过80％，可以较好的恢复受损Caco2细胞上皮单层的完整性。而相比模型组，A4和A5组的TEER值无显著变化，表明对比例1和对比例2提供的阿魏酸糖酯组合物对恢复上皮屏障完整性无明显效果。

二、阿魏酸糖酯组合物改善便秘的功效验证

1、实验方法

随机取6周龄健康C57BL/6雄性小鼠60只，平均分为六组，每组10只，分别为正常对照组(灌胃生理盐水)、便秘模型组(灌胃盐酸洛哌丁胺)、干预便秘A1、A2和A3组(灌胃盐酸洛哌丁胺和3mg/10g体重/天阿魏酸糖酯组合物)，其中A1组、A2组和A3组分别采用实施例1、2和3提供的阿魏酸糖酯组合物，连续给药10天，于第10天记录首粒排黑便时间；第10天禁食禁水，于第11天灌胃营养半固体糊，30min后处死动物并计算胃内容物残留率、小肠推进率，分析血清胃动素和血清乙酰胆碱酯酶水平。

由图2可知，本发明实施例1提供的阿魏酸糖酯组合物，可以显著缩短了便秘小鼠首次排便时间，而且效果优于实施例2和3提供的阿魏酸糖酯组合物。

由图3可知，本发明的实施例1提供的阿魏酸糖酯组合物，可以显著减少胃内容无残留率，提高小肠推进率，且效果优于实施例2和3提供的阿魏酸糖酯组合物。

盐酸咯哌丁胺主要通过抑制平滑肌收缩使得小鼠发生便秘，血清胃动素可以兴奋胃肠平滑肌，乙酰胆碱酯酶促进胃的收缩及增加胃酸分泌，促进小肠、结肠的活动，促进肠内容排出。如图4和5可知，本发明实施例1的阿魏酸糖酯组合物能够通过提高血清胃动素和乙酰胆碱酯酶水平来促进胃排空和小肠蠕动，从而发挥改善小鼠便秘的功能，且效果优于实施例2和3提供的阿魏酸糖酯组合物。三、阿魏酸糖酯组合物维持DSS诱导肠炎小鼠上皮屏障功能并减轻肠道炎症

1、实验方法：

随机取6周龄健康C57BL/6雄性小鼠50只，适应性饲养1周后，随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、DSS诱导肠炎模型组、阿魏酸糖酯组合物干预肠炎A1组(给予2％DSS饮水和1mg/10g体重/天阿魏酸糖酯组合物)、阿魏酸糖酯组合物干预肠炎A2组(给予2％DSS饮水和1mg/10g体重/天阿魏酸糖酯组合物)和阿魏酸糖酯组合物干预肠炎A3组(给予2％DSS饮水和1mg/10g体重/天阿魏酸糖酯组合物)，其中，A1组、A2组和A3组分别采用实施例1、2和3提供的阿魏酸糖酯组合物。正常对照组全程自由饮用纯净水，模型组、A1组、A2组和A3组在0-7天饮用2％DSS溶液，8-14天更换为饮用正常水7天，然后15-21天继续饮用2％DSS溶液。饲养期间隔日记录小鼠体重，观察鼠粪便性状、毛发、活动及死亡情况并检测大鼠粪便隐血，计算大鼠疾病活动指数(DAI)。

于第22天，在禁食6小时后，测定小鼠肠道通透性：小鼠灌胃4kDa的FITC葡聚糖(5mg/10g)，灌胃4h后下颌下静脉血样。灌胃后1小时和4小时采集下颌下静脉血样(每只小鼠100微升)，将血样离心5min(4℃，10000g)后收集血清。血清用PBS按1:3比例稀释，随后用荧光分光光度计在激发波长480mm、发射波长520mm的条件下测量荧光强度。

2、实验结果

由图6所示，肠炎模型组肠炎小鼠由于肠上皮损伤而进入血清的FITC是正常小鼠的2.13倍，而相比肠炎模型组，A1组、A2组和A3组小鼠的血清FITC显著降低(P＜0.05)，仅为肠炎模型组的0.55，表明本发明提供的阿魏酸糖酯组合物可以显著改善肠炎小鼠上皮屏障损伤。如图7所示，在缓解结肠炎小鼠的疾病活动指数方面，本发明的阿魏酸糖酯组合物可以显著缓解结肠炎小鼠的疾病状态，且实施例1提供的阿魏酸糖酯组合物的效果最佳。

同时，现有的FA、FAX、FAX3和FAX4的制备方法复杂，成本高，不利于规模化推广应用。基于此，本发明还提供了一种上述阿魏酸糖酯组合物的制备方法。

本发明提供了上述实施例1提供的阿魏酸糖酯组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将小麦麸皮以1：15的质量体积比浸于15％的[EMIM]OAc离子液体中，100℃加热处理4h后，洗去离子液体，得残渣液；

(2)向残渣液中加入残渣液体积0.5％的80U/mL的木聚糖酶，在60℃下酶解1h，离心后，得酶解液；

(3)将酶解液过Amberlite XAD-2大孔树脂柱层析，收集50％甲醇水溶液洗脱液后旋蒸浓缩冷冻干燥，得阿魏酸糖酯组合物。

本发明还提供了上述实施例2提供的阿魏酸糖酯组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)小麦麸皮经121℃高压蒸汽处理灭酶后，NaOH溶液调pH至6.5加入120KNU/100g的耐温α-淀粉酶于60℃酶解40min后，用NaOH溶液调pH至10.0，再加入0.5AU/100g碱性蛋白酶于60℃酶解30min，然后用HCl调pH至4.5再加入1200AGU/100g糖化酶于60℃酶解30min，离心并用蒸馏水洗涤后得麦麸不溶性膳食纤维；

(2)向麦麸不溶性膳食纤维中加入麦麸不溶性膳食纤维体积1％的120U/mL的木聚糖酶，在60℃下酶解1h，离心后，得酶解液；

(3)将酶解液过Amberlite XAD-2大孔树脂柱层析，收集50％甲醇水溶液洗脱液后旋蒸浓缩冷冻干燥，得阿魏酸糖酯组合物。

本发明还提供了上述实施例3提供的阿魏酸糖酯组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)小麦麸皮经121℃高压蒸汽处理灭酶后，NaOH溶液调pH至6.5加入120KNU/100g的耐温α-淀粉酶于60℃酶解40min后，用NaOH溶液调pH至10.0，再加入0.5AU/100g碱性蛋白酶于60℃酶解30min，然后用HCl调pH至4.5再加入1200AGU/100g糖化酶于60℃酶解30min，离心并用蒸馏水洗涤后得麦麸不溶性膳食纤维；

(2)向麦麸不溶性膳食纤维中加入麦麸不溶性膳食纤维体积1％的70U/mL的木聚糖酶，在60℃下酶解1h，离心后，得酶解液；

(3)将酶解液过Amberlite XAD-2大孔树脂柱层析，收集50％甲醇水溶液洗脱液后旋蒸浓缩冷冻干燥，得阿魏酸糖酯组合物。

经质谱确认，实施例1-3制备得到的阿魏酸糖酯组合物的峰面积如下表所示：

本发明提供的阿魏酸糖酯组合物的制备方法，相对现有技术，其工艺简单、成本低，为阿魏酸糖酯的应用提供了新的方向。

需要强调的是，本发明所述的实施例是说明性的，而不是限定性的，因此本发明包括并不限于具体实施方式中所述的实施例，凡是由本领域技术人员根据本发明的技术方案得出的其他实施方式，同样属于本发明保护的范围。