LY2922470在制备预防或治疗肾脏疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及LY2922470在制备预防或治疗肾脏疾病中的应用。

背景技术

LY2922470由礼来公司(Eli Lily and Company)开发，作为GPR40小分子激活剂治疗2型糖尿病。结构如下：

GPR40属于GPCR家族。GPR40的激活已被证明可诱导胰腺β细胞分泌葡萄糖刺激的胰岛素(GSIS)以及肠道内分泌细胞分泌肠促胰岛素。因此，GPR40已成为2型糖尿病的可行且有前景的治疗靶点，且无低血糖风险，因此作为T2DM的治疗药物靶点引起了相当大的关注，目前已经开发和研究了许多GPR40配体的抗糖尿病作用。其中，TAK-875作为一种GPR40激活剂，已在II期临床试验中成功进行测试。

专利WO2015105786A1中首次提出LY2922470化合物结构的通式，并提出该化合物可用于治疗2型糖尿病。

肾功能衰竭(renal failure)又简称肾衰竭，是各种原因导致的慢性肾脏疾病引起的肾小球滤过率(GFR)下降及与此相关的代谢紊乱和临床症状组成的综合征。它的特点是肾小球滤过率的持续和进行性下降。我国慢性肾衰发生率为总人口的万分之五以上，治疗手段除了昂贵的血液透析和肾移植外,目前尚缺少有效的治疗药物,因此寻求治疗肾脏疾病的新药物具有重大意义。

肾纤维化被认为是几乎所有类型的慢性肾脏疾病(CKD)的共同途径，对肾小球、肾小管、肾脏血管等均有影响。纤维化也是CKD的标志，其特征是上皮-间充质过渡(EMT)、过多的细胞外基质(ECM)沉积以及间质细胞和炎症细胞积累，通过EMT，管状上皮细胞成为肌成纤维细胞，具有增强的细胞增殖、运动、收缩和过量ECM沉积的能力，从而导致纤维化。缺血再灌注(IR)、肾毒素、化疗药物、糖尿病、高血压和输尿管阻塞的伤害都可导致肾脏纤维化的出现。

转化生长因子-β1(TGF-β1)可通过调节TGF-β/Smad通路来发挥功能，使其成为纤维化的总调节剂。因此可使用TGF-β1诱导体外纤维化模型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供LY2922470药物一类新的适应症。LY2922470作为肾脏疾病的药物，能有效改善肾功能，为肾损伤、慢性肾脏疾病及肾衰竭的预防和治疗提供了一种新的备选药物。

本发明的技术方案为：LY2922470在制备预防或治疗肾脏疾病中的应用，所述LY2922470的结构式为：

进一步地，所述肾脏疾病为肾损伤、慢性肾脏疾病或肾衰竭。

进一步地，所述肾脏疾病为肾纤维化导致的肾病。

进一步地，所述肾脏疾病包括缺血再灌注(IR)、肾毒素、化疗药物、高血压或输尿管阻塞引起的肾病或糖尿病肾病。

进一步地，所述药物中LY2922470以化合物或其药学上可接受的盐的形式存在。

进一步地，所述药物为口服或注射给药剂型，所述口服或注射给药剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、乳剂或混悬剂。

进一步地，所述药物还包含辅料或肾脏保护或血管保护药物。

进一步地，所述药物还含有药学上可接受的载体，所述载体包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

在本发明，所述药物含有有效剂量的LY2922470。有效剂量为单位给药剂量形式(如一片、一针、一丸或一剂的药物中的含量)或治疗的患者的单位剂量(如单位体重剂量)。在本发明中，药物治疗对象范围为哺乳动物类，包括人、犬科、啮齿类动物等。不同动物有效剂量换算可根据本领域实验动物与人的等效剂量换算关系(通常可参见FDA、SFDA等药品管理机构的指导意见，也可参见“黄继汉等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算。中国临床药理学与治疗学，2004Sep；9(9)：1069-1072”)，即可从实验动物的剂量推导出人的单位体重剂量。例如，对于常用的实验动物小鼠而言，根据上述文献，其与成人的换算关系约为12:1。

在本发明中，8周龄的C57BL/6N小鼠中，明显治疗腺嘌呤诱导肾衰竭中的有效剂量(以含量计)为20～100mg/kg，优选为30～60mg/kg。

优选的，根据小鼠与成人有效剂量换算关系，将成人体重标准设置为60kg，则成人有效剂量为每天100～500mg，优选为150mg～300mg。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过采用腺嘌呤诱导肾衰竭动物模型评价LY2922470、TAK875对肾损伤和肾衰的治疗效果，实验结果显示LY2922470具有治疗肾衰竭的作用，且治疗作用与GPR40靶点无直接关系。采用肾纤维化体外模型证实LY2922470对肾纤维化具有抑制作用。本发明证实了LY2922470作为肾脏疾病药物的重大潜力，首次公开了LY2922470有效改善肾功能，为肾损伤、慢性肾脏疾病及肾衰竭的治疗提供了有效的新型潜在备选药物，扩展了LY2922470的适应证，极大的提高了LY2922470的应用潜力及市场前景。

附图说明

图1持续3周以含腺嘌呤0.25％的模型饲料喂养进行造模的小鼠肾小球滤过率。

图2腺嘌呤诱导小鼠肾衰模型血肌酐(CREA)变化(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001)。

图3LY2922470治疗腺嘌呤诱导小鼠肾衰的生存曲线。

图4LY2922470治疗持续腺嘌呤诱导肾衰小鼠肾小球滤过率。

图5LY2922470治疗腺嘌呤诱导两周肾衰小鼠肾小球滤过率。

图6LY2922470治疗腺嘌呤诱导肾衰小鼠的肾纤维化程度统计图(MASSON染色半定量分析)。

图7LY2922470处理TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化标志物RT-PCR定量结果。

图8LY2922470处理高糖诱导的HK-2细胞纤维化标志物RT-PCR定量结果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可从商业渠道购买得到。

实施例1腺嘌呤诱导小鼠肾损伤及肾衰竭模型构建成功

一、实验材料

1.实验动物：C57BL/6N，8周龄，SPF级，雄性，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供。

二、肾损伤及肾衰小鼠模型造模方法(腺嘌呤诱导)

除对照组外，其余小鼠以含腺嘌呤0.25％的模型饲料喂养进行造模，空白对照组食用正常饲料，小鼠自由进食，持续三周，在第三周结束时进行肾小球滤过率检测及相关肾功能指标检测。

三、实验结果与结论

对照组和腺嘌呤诱导肾衰模型组小鼠肾小球滤过率如图1所示，与正常饲料饲养的小鼠相比，喂养含腺嘌呤0.25％的饲料的小鼠肾小球滤过率显著下降(P<0.001)，肾小球滤过功能基本丧失。血清肌酐(CREA)的浓度变化主要由肾小球的滤过能力(肾小球滤过率)来决定。滤过能力下降，肌酐浓度升高。血肌酐能较准确的反应肾实质受损的情况，对照组和模型组的CREA如图2所示。与对照组相比，模型组小鼠的CREA显著上调(P<0.001)。符合肾衰小鼠的生理病理表现，肾衰模型构建成功。

实施例2LY2922470有效降低肾衰所致小鼠死亡率

一、实验材料

1.实验动物：C57BL/6N，8周龄，SPF级，雄性。

2.实验药物：LY2922470(上海陶术生物有限公司)、TAK875(上海陶术生物有限公司)。

1)TAK875配制方法：精密天平称取27mg TAK875粉末，溶于9ml的0.8％ CMC-Na溶液中，超声5min，配成3mg/ml的白色混悬液，置于4℃条件下保存，备用。

2)LY2922470配制方法：80mg LY2922470黄色结晶物加入200μl DMSO溶液，配成黄色透明状溶液。然后分批加入至10ml的0.8％ CMC-Na溶液中，加热超声5小时后配成8mg/ml的LY2922470白色混悬液。均置于4℃条件下保存，备用。

二、实验分组及给药

P.o：口服给药，QD：每天1次。

三、实验步骤

选择8周龄C57BL/6N雄鼠适应性饲养1周，随机分为6组，除空白对照组外，其余小鼠以含腺嘌呤0.25％的模型饲料喂养小鼠进行造模，空白对照组食用正常饲料。小鼠自由进食。造模1周后，按实验分组给各组小鼠灌胃给药，每日下午1次，空白对照组和模型组在同等条件下给予溶剂。给药期间继续用腺嘌呤饲料喂养造模，记录小鼠生存情况，直至实验结束。

四、实验结果及结论

表1为LY2922470对腺嘌呤诱导的小鼠肾衰模型的生存率统计表，图3为对应的生存曲线图。小鼠在腺嘌呤喂养后19天均未出现死亡，但各组体重均出现下降，小鼠体型逐渐瘦弱。含腺嘌呤饲料饲养第20天起开始出现小鼠死亡，到第27天LY-10mg/kg组全部死亡截止，对照组生存率为100％，模型组生存率仅14.3％，TAK875治疗组生存率46.20％，LY-60mg/kg组与TAK875组生存率接近，为50％，LY2922470在30mg/kg剂量时对肾脏保护作用最强，小鼠最终生存率达100％，比TAK875组高一倍。

从表中数据可知，LY2922470在30mg/kg/d～60mg/kg/d剂量时均具治疗效果，在30mg/kg/d对肾衰具有最好的治疗效果，但不排除剂量<30mg/kg/d剂量(如：20～30mg/kg)对肾脏的保护作用，也不排除>60mg/kg/d的剂量如60～100mg/kg对肾衰的治疗作用。

表1

实施例3LY2922470对肾损伤和肾衰竭的治疗作用

一、实验材料

1.实验动物：C57BL/6N，8周龄，SPF级，雄性。

2.实验药物：LY2922470、TAK875(均购于上海陶术生物有限公司)。

二、实验分组

a)对照组：使用不含腺嘌呤饲料喂养，其余操作同模型组

b)模型组(Model)：含0.25％腺嘌呤的饲料喂养进行造模

c)LY-10mg/kg组：Model+LY2922470(10mg/kg，p.o，QD)

d)LY-30mg/kg组：Model+LY2922470(30mg/kg，p.o，QD)

e)LY-60mg/kg组：Model+LY2922470(60mg/kg，p.o，QD)

f)TAK875组：Model+TAK875(30mg/kg，p.o，QD)

p.o：口服给药，QD：每天1次。

三、实验方法

1.实验步骤

造模除空白对照组外，其余小鼠以含腺嘌呤0.25％的模型饲料喂养小鼠进行造模，空白对照组食用正常饲料，小鼠自由进食。造模1周后，按不同分组分别灌胃给药，每日下午1次，连续2周，空白对照组和模型组在同等条件下给予溶剂。给药期间继续用腺嘌呤饲料喂养造模，直至实验结束。实验过程中观察小鼠状态，每周称体重并记录。分别于饲料造模后1周及3周(给药2周)取材时眼底采血，分离血清，测量血清CRE及BUN。于给药2周时采用TGFR肾功能监测及智能分析系统对各组小鼠进行肾功能测试，测试结束后，对小鼠进行取材检测，确认药效。

2.数据采集和统计分析

采用GraphPad software,Prism 8.0统计学软件进行统计学分析，计量资料各组数据以mean±SD表示，多组比较采用ANOVA单因素方差分析，两组之间比较采用t检验进行统计分析，p＜0.05认为有统计学意义差异。计数资料各组之间比较采用卡方检验进行统计分析，p＜0.05认为有统计学意义差异。

四、实验结果及结论

1.肾小球滤过率

图4为持续使用0.25％腺嘌呤饲喂小鼠，1周后给予LY2922470或TAK875治疗，给药期间继续用腺嘌呤饲料喂养造模，腺嘌呤喂养3周(给药两周)后使用TGFR肾功能监测及智能分析系统检测小鼠肾小球滤过率。

如图4所示，与对照组相比，模型组小鼠肾小球滤过率明显降低，肾小球滤过功能几乎完全消失。与模型组相比，口服GPR40激动剂TAK875后小鼠肾小球滤过率有提高，口服不同剂量LY2922470后，小鼠肾功能均有改善，使用30mg/kg LY2922470的小鼠改善最为明显。

上述连续饲喂0.25％腺嘌呤饲料造模方式的小鼠模型肾衰情况过重，导致肾功能损伤严重，因此重新设计造模方式再次实验验证LY2922470对肾衰的治疗作用(腺嘌呤饲料喂养2周后改为正常饲料，其余均不变)，结果见图5。与模型组小鼠相比，使用LY2922470药物组的小鼠肾功能明显提高，且具有统计学意义(NS：无统计学差异，*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001)。结果显示LY2922470对肾损伤及肾衰竭具有治疗作用。

2.肾脏功能相关指标血肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)

使用0.25％腺嘌呤饲喂小鼠，1周后给予LY2922470或TAK875治疗，给药期间继续用腺嘌呤饲料喂养造模，腺嘌呤喂养3周(给药两周)后采集小鼠血液，分离血清检测CREA和BUN，各组小鼠肾功能指标CREA和BUN结果如表2、3所示。

腺嘌呤喂养一周各组小鼠肾功能无明显差异。造模三周(给药两周)后，与空白组小鼠相比，模型组小鼠CREA和BUN均上调(与空白组比较#p<0.05，##p<0.01)。与模型组小鼠相比，口服GPR40激动剂TAK875后CREA和BUN未见明显下降(与模型对照组比较*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001)。口服不同剂量LY2922470后，小鼠肾功能指标血肌酐和尿素氮均下调。与模型组小鼠相比，使用30mg/kg和60mg/kg LY2922470药物组的小鼠血清CREA显著下降，30mg/kg LY2922470药物组的小鼠血清BUN下调且具有统计学意义。结果显示LY2922470对肾损伤和肾衰竭具有治疗作用，且此治疗作用不与GPR40靶点直接关联。

从表中数据可知，LY2922470在30mg/kg/d～60mg/kg/d剂量时均具治疗效果，在30mg/kg/d具有最好的治疗效果，但不排除剂量<30mg/kg/d剂量(如：20～30mg/kg)对肾脏的保护作用，也不排除>60mg/kg/d的剂量如60～100mg/kg对肾病的治疗作用。

表2各组小鼠肾功能指标CREA

表3各组小鼠肾功能指标BUN

实施例4LY2922470对肾纤维化的抑制作用

一、实验材料

同实施例3

二、实验分组

同实施例3

三、实验方法

1.实验步骤

按照实施例3方式造模及给药，于给药2周后，对小鼠进行安乐死，对肾脏进行固定、切片、MASSON染色并进行分析。

2.数据采集和统计分析

使用宁波江丰生物信息技术有限公司的全自动数字病理切片扫描仪KF-PRO-120将玻片整张进行扫描。利用HALO软件Area Quantification模块，对Masson染色图片进行分析。选取胶原纤维染色的蓝色作为阳性的统一标准，对图片进行分析，并计算出蓝色胶原纤维占组织的百分比。

采用GraphPad software,Prism 8.0统计学软件进行统计学分析，计量资料各组数据以mean±SD表示，多组比较采用ANOVA单因素方差分析，两组之间比较采用t检验进行统计分析，p＜0.05认为有统计学意义差异。计数资料各组之间比较采用卡方检验进行统计分析，p＜0.05认为有统计学意义差异。

四、实验结果及结论

结果如图6所示，造模三周(给药两周)后，与空白组小鼠相比，模型组小鼠肾脏纤维化程度明显上调。与模型组小鼠相比，口服GPR40激动剂TAK875后纤维化程度未见明显下降。小鼠口服30mg/kg/d剂量LY2922470后，胶原蛋白沉积量下降，抑制了ECM沉积，肾纤维化程度缓解。实验结果显示LY2922470可抗肾脏纤维化，且抗纤维化可与GPR40靶点独立作用。

实施例5LY2922470对肾纤维化的抑制作用(TGF-β1诱导纤维化)

一、实验材料

二、实验分组

A：Control；

B：TGF-β1(10ng/ml)

C：TGF-β1(10ng/ml)+LY(10nM)；

D：TGF-β1(10ng/ml)+LY(50nM)；

E：TGF-β1(10ng/ml)+LY(500nM)；

三、实验方法

HK-2细胞培养基：MEM+10％FBS+1％(Penicillin-Streptomycin Solution)。将HK-2细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到含有3mL培养基的离心管中，离心收集细胞，室温1000rpm离心5min，弃上清；用含10％胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃、5％ CO

取处于对数生长期，生长状态良好的HK-2细胞，以1×10

四、实验结果

使用TGF-β1诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2细胞模型来确认LY2922470的抗纤维化作用。RT-PCR实验结果显示(图7)：相比Control组，加入TGF-β1处理显著增加纤维化标志物Fibronectin和α-SMA的表达水平；相比TGF-β1组，，加入不同浓度的LY处理会不同程度地降低Fibronectin和α-SMA的表达水平，且与加入浓度呈剂量依赖性(*：与Control组比较，0.01

实施例6LY2922470对肾纤维化的抑制作用(高糖诱导纤维化)

一、实验材料

1.D-葡萄糖(上海国药)。

2.其余与实施例5相同。

二、实验分组

A：Control；

B：HG(25mM)

C：HG(25mM)+LY(10nM)；

D：HG(25mM)+LY(50nM)；

E：HG(25mM)+LY(500nM)；

三、实验方法

HK-2细胞培养基：MEM+10％FBS+1％(Penicillin-Streptomycin Solution)。将HK-2细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到含有3mL培养基的离心管中，离心收集细胞，室温1000rpm离心5min，弃上清；用含10％胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃、5％ CO

待细胞达到40％-50％密度后，按照上述分组对细胞进行处理：A组HK-2正常培养；B组加入25mM的D-葡萄糖高糖处理；C组加入25mM的D-葡萄糖高糖和100nM的TAK处理；D组加入25mM的D-葡萄糖高糖和10nM的LY处理；E组加入25mM的D-葡萄糖高糖和50nM的LY处理；F组加入25mM的D-葡萄糖高糖和500nM的LY处理；各组别均培养48h后收样进行RT-PCR检测。

四、实验结果

使用高糖培养基诱导HK-2损伤模型来确认LY2922470的抗纤维化作用。RT-PCR实验结果显示(图8)：相比Control组，加入高糖处理显著增加Fibronectin和α-SMA的表达水平；相比高糖组，加入不同浓度的LY处理会不同程度地降低Fibronectin和α-SMA的表达水平，且与加入浓度呈剂量依赖性(*：与Control组比较，0.01

本发明通过采用腺嘌呤诱导肾损伤、肾衰竭动物模型及肾纤维化体外模型评价LY2922470、TAK875对肾脏疾病治疗的效果，实验结果显示LY2922470具有保护肾功能、治疗肾损伤、慢性肾脏疾病、肾衰等疾病的作用，且治疗作用与GPR40靶点无直接关系。采用TGF-β1诱导纤维化和高糖诱导纤维化的体外模型证实LY2922470具有抗纤维化作用。因此本发明证实了LY2922470作为肾脏疾病药物的重大潜力，LY2922470具有治疗肾病的作用，在临床上具有广阔的应用前景。