一种半固态发酵合成ε-聚赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种半固态发酵合成ε-聚赖氨酸的方法，具体是采用具有阳离子交换特性的多孔石料吸附液态发酵培养基，再在其表面接种小白链霉菌，在通风环境下采用喷雾补料的方式进行发酵合成ε-聚赖氨酸的方法，属于工业生物技术领域。

背景技术

ε-PL(ε-poly-l-lysine，ε-PL)是一种绿色天然的生物抑菌剂，其由25-35个L-赖氨酸残基经α-ε酰胺键聚合而成，是由小白链霉菌、麦角真菌或部分芽孢杆菌分泌的一种次级代谢产物。ε-PL在中性pH环境下带正电，能够自发接近带负电的微生物细胞，从而破坏细胞膜结构并导致微生物细胞死亡。其抑菌谱广泛，对细菌、酵母、霉菌乃至一些病毒均有抑制效果。ε-PL几乎不被人体肠道吸收，少量吸收后能够被人体分解为赖氨酸，其高安全性受到了美国FDA和我国卫计委的认可，被认为是一种GRAS化合物并被允许作为食品防腐剂在食品加工过程中使用。ε-PL作为食品防腐剂在日本、美国、韩国、欧盟已应用了多年，此外，其还可作为药物载体、高吸水性生物材料、乳化剂、食疗剂，具有广阔的应用价值与市场需求。

微生物液态发酵是ε-PL合成的主要途径，基于液态发酵环境，研究人员提出了多种可有效提升ε-PL合成的有效策略，如高产菌株的定向选育、发酵培养基优化、发酵过程精密调控、产物的原位提取等。虽然以上方法能够提高ε-PL发酵水平，但是因液态发酵体系带来的以下故有问题一直未得到解决：(1)氧气在水中的溶解度非常低，液态发酵中的“气-液-菌”氧传递方式效率低；(2)为维持发酵液中的溶解氧水平，需要持续进行高速搅拌，其不仅损伤菌丝还造成了大量能量消耗；(3)发酵结束后，经固液分离的上清液中产物含量低(约3-4％)，其余成分作为高浓度有机发酵废水对后续环保处理构成了压力。

如若采用固态发酵方法合成ε-PL，虽可减少发酵废水、降低搅拌能耗，但在传氧、传质上仍然存在以下缺陷：(1)固体发酵培养基堆放致密，通风不畅，传氧效果差；(2)发酵体系混合效果差，传热、传质受到阻碍；(3)固体培养基混合效果差，碳、氮源补料后营养成分分布不均匀。

发明内容

为解决液态发酵和固态发酵中的故有问题，本发明提供了一种半固态发酵合成ε-聚赖氨酸的方法。本方法以小白链霉菌为生产菌，以具有阳离子交换特性的多孔石料作为载体，吸附液体培养基及ε-PL产生菌，采用恒温通风方式进行控温，采用喷雾补料方式进行营养成分的补充，以此进行补料分批发酵ε-PL。

本发明立足于构建一种新型发酵体系以解决以上液态及固态发酵的故有问题。发明人筛选了具有阳离子交换特性的多孔石料，将其作为半固态培养单元吸附液态发酵培养基，再作为发酵载体承接小白链霉菌在其表面生长，在恒温通风环境下采用喷雾补料的方式进行补料分批发酵合成ε-PL。此方法有以下优势：(1)固体石料疏松多孔，比表面积大，能够吸附液态培养基并给小白链霉菌提供生长位点；(2)固体石料具有一定的粒径，石料之间存在较大的空隙，无菌空气能够在石料间的气道中通过，将氧气直接传递给石料表面的菌体，大幅提高了氧气传递效率；(3)采用恒温空气对体系控温，借助喷雾补料、气体传输体系对空气湿度及石料营养进行均匀控制；(4)石料选用具有阳离子交换特性的沸石，其具有NH

本发明半固态发酵合成ε-聚赖氨酸的方法，包括如下步骤：

步骤1：石料的预处理及铵型改性

将石料在马弗炉中500℃煅烧2h以除去有机质并对石料进行活化，待温度降至常温后，在超声波清洗器的辅助下，将石料用去离子水浸泡、洗涤4次，每次浸泡时间为4h，再依次以5倍石料体积的1mol/L的NH

所述石料选自火山岩、珍珠岩、硅藻土、高岭石或绿沸石等具有吸附或阳离子交换作用的多孔石料，优选绿沸石。改性目的在于用高温灼烧的方式去除石料中的有机质、洗涤以去除飘浮及微通道中粉尘、铵型改性以使其处于可进行阳离子交换的状态，未改性的石料因粉尘较多、通道不通畅、数据极不稳定，用于发酵的效果差。

步骤2：半固体发酵前处理

以石料对液体吸附饱和度为基准，向预制备的铵型改性石料中加入20-40％吸附饱和度体积的去离子水，然后添加到生物反应器中121℃高温灭菌20min。

步骤3：发酵种子培养

在成熟小白链霉菌平板上刮2环(约1×10

步骤4：半固体补料分批发酵

在无菌环境下将预灭菌的M3G改进发酵培养基与ε-PL半固体发酵种子液混合，混合液再加入步骤2高温灭菌后的石料中拌匀进行接种；将接种完成的石料放入固体生物反应器，调节空气温度28-32℃(优选为30℃)，调节转子流量计至通气量0.5-5vvm(优选为2vvm，按照吸附的液体培养基总体积计算)。发酵时间至12-24h开启补水，即将无菌水在雾化器中雾化，并与无菌空气混合后进入发酵罐内，以空气湿度70-90％范围为基准调整雾化补水的速度；发酵时间至24-48h开启补料，即将5-10％的葡萄糖或甘油，以及硫酸铵或氯化铵在雾化器中雾化，并与无菌空气混合后进入发酵罐内，以空气湿度范围70-95％、碳源浓度10-30g/L、游离铵氮浓度0.2-0.5g/L为基准调整雾化补料的速度；每隔12h从反应器中取出部分石料进行碳源浓度、铵氮浓度的测定；发酵持续7天，发酵结束后停止雾化补水补料(当产物产量不再上升时结束)，加大风量至10vvm风干过夜，获得吸附有聚赖氨酸的干燥石料。

步骤4中，所述M3G改进发酵培养基的构成如下(g·L

进一步地，所述M3G改进发酵培养基的构成如下：葡萄糖40g/L，甘油10g/L，液化淀粉10g/L，酵母提取物2g/L，牛肉浸膏1g/L，鱼粉蛋白胨2g/L，(NH

步骤4中，M3G改进发酵培养基的添加体积为石料吸附饱和度体积的30-80％(优选为60％)，ε-PL半固体发酵种子液的接种量应控制在10-20％范围内(添加的种子液占被石料吸附的液体培养基的10-20％)(优选为15％)。

步骤5：产物提取

以5倍石料体积的1mol/L的NH

本方法的特点在于：

(1)以阳离子交换特性的多孔石料作为载体，吸收液体培养基，并将发酵种子液与石料混合进行接种，ε-PL产生菌生长在石料表面及多孔缝隙中，朝内可吸收石料中的营养物质，朝外可直接接收石料缝隙中的氧气，获得生长并合成产物ε-PL；

(2)空气通过升温后进入半固体发酵罐，可透过石块与石块的空隙以及石块自身孔洞进行流动，期间可将氧气直接传递给菌体并带走二氧化碳，不存在液体传氧阻力；

(3)空气湿度和碳源、氮源补料采用喷雾方式进行，即将预灭菌的水、碳源溶液、氮源溶液喷雾雾化，再经空气的推动力下流经石料与石料的空隙以及石料自身孔洞，获得均匀的补水补料效果；

(4)石料具有阳离子交换特性，预先进行铵型改性，在发酵过程中能够结合发酵中产生的H

本方法能够有效提高ε-PL的生物合成水平，并解决了液态发酵和固态发酵中的故有问题，在工业上具有重要的应用价值。

具体实施方式

一、半固态发酵合成ε-PL

本发明的生物反应器包括9cm培养皿、250mL三角瓶、2L三角瓶、50L固体生物反应器(偶联喷雾补料装置)。

(一)菌种：

小白链霉菌IFO14147(Streptomyces albulus IFO 14147，StreptomycesalbulusCICC 11022)。(二)培养基配方：

1、固体贝塔纳培养基(g·L

2、M3G培养基(g·L

3、M3G改进培养基(g·L

(三)具体步骤：

1、阳离子交换特性的石料预处理及铵型改性

将具有阳离子交换能力的石料在马弗炉中500℃灼烧2h以除去有机质对沸石进行活化，待温度降至常温后，在超声波清洗器的辅助下，将具有阳离子交换能力的石料用去离子水浸泡、洗涤4次，每次浸泡时间为4h，再依次以5倍石料体积的1mol/L的NH

2、半固体发酵前处理

以石料对液体吸附饱和度为基准，向预制备的铵型改性石料中加入20-40％吸附饱和度体积的去离子水，然后添加到生物反应器中121℃高温灭菌20min。

3、发酵种子培养

在成熟小白链霉菌平板上刮2环(约1×10

4、半固体补料分批发酵

在无菌环境下将预灭菌的M3G改进发酵培养基(优选为，葡萄糖40g/L，甘油10g/L，液化淀粉10g/L，酵母提取物2g/L，牛肉浸膏1g/L，鱼粉蛋白胨2g/L，(NH

5、石料取样及产物提取

以12h为跨度对半固态发酵中的石料进行取样，取出的样品按照同等质量分成两份，其中一份称取质量后置于鼓风干燥箱中干燥至恒重，再次称重以获取石料含水量；另一份用去离子水进行浸泡，辅以超声波振荡以加快碳源和铵氮的扩散，最终获得浸泡液，其中的碳源(葡萄糖/甘油)浓度采用液相色谱检测，铵氮水平采用靛酚蓝比色法测定。

以5倍石料体积的1mol/L的NH

6、样品检测

石料浸出液中葡萄糖浓度检测：将300μL发酵液和700μL无水乙醇混合，静置1h后离心取上清，过0.45μm滤膜后进行HPLC检测。使用有机酸测试柱(Aminex HPX-87H,300×7.8mm；Hercules,USA)，流动相设定为5mM硫酸，柱温控制为60℃，进样量10μL。

石料浸出液铵氮浓度检测：溶液A：35g·L

解吸液中ε-PL浓度检测：将解吸液0.45μm滤膜后滤膜过滤，清液用0.2mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)适当稀释，取出2mL稀释液与2mL 1mM甲基橙水溶液混合，置于30℃反应30min，4000rpm离心15min，上清液用与9mL甲醇混合，于超声波清洗器中振荡提取20min，4500g离心10min，上清液用0.2mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)稀释20倍后于分光光度计465nm处测定吸光度，并代入ε-PL浓度标准曲线中计算出实际ε-PL浓度。

二、实施例

实施例1：适合ε-PL半固态发酵合成的石料的筛选

以9cm培养皿为初级生物反应器，选择硅藻土、火山岩、高岭石、珍珠岩、绿沸石为备选石料，在无菌环境下将预灭菌的M3G培养基以石料饱和度60％为基准与步骤3获得的成熟的ε-PL半固体发酵种子液混合(接种量10％)，并与石料拌匀，置于30℃恒温培养箱中静置5天。培养结束后，采用步骤5中的方式对石料进行提取，测定其中ε-PL的浓度，并按照培养基总吸附量进行换算。其结果分别为0.2g/L(硅藻土)、0.6g/L(火山岩)、0.7g/L(高岭石)、0.3g/L(珍珠岩)、0.8g/L(绿沸石)。其中，火山岩、高岭石经水泡后成为泥浆，无法达到承载微生物在具有一定空间结构的石料表面生长的要求，故不适用于ε-PL半固态发酵。比较其余几种石料，绿沸石的效果最为显著，即绿沸石是最适合ε-PL半固态合成的载体。

实施例2：ε-PL半固态发酵营养条件优化

以250mL三角瓶为小型生物反应器，选择绿沸石为吸附剂，在无菌环境下将预灭菌的M3G改进培养基以石料饱和度60％为基准与步骤3获得的成熟的ε-PL半固体发酵种子液混合(接种量10％)，并与石料拌匀，置于30℃恒温培养箱中静置5天。M3G改进培养基成分优化分为A(碳源优化)、B(有机氮源优化)、C(无机氮源优化)3组，A组设置5种碳源组成，即葡萄糖60g/L、甘油60g/L、葡萄糖50g/L+甘油10g/L、葡萄糖50g/L+液化淀粉10g/L、葡萄糖40g/L+甘油10g/L+液化淀粉10g/L，其结果分别为0.8g/L(葡萄糖60g/L)、0.5g/L(甘油60g/L)、1.2g/L(葡萄糖50g/L+甘油10g/L)、1.1g/L(葡萄糖50g/L+液化淀粉10g/L)、1.4g/L(葡萄糖40g/L+甘油10g/L+液化淀粉10g/L)，可知碳源组合中葡萄糖40g/L+甘油10g/L+液化淀粉10g/L最适用；B组设置5种有机氮源组合，即酵母提取物5g/L、牛肉浸膏5g/L、鱼粉蛋白胨5g/L、酵母提取物3g/L+牛肉浸膏2g/L、酵母提取物3g/L+鱼粉蛋白胨2g/L、牛肉浸膏3g/L+鱼粉蛋白胨2g/L、酵母提取物2g/L+牛肉浸膏2g/L+鱼粉蛋白胨1g/L、酵母提取物2g/L+牛肉浸膏1g/L+鱼粉蛋白胨2g/L，其结果分别为0.8g/L(酵母提取物5g/L)、0.6g/L(牛肉浸膏5g/L)、1.1g/L(鱼粉蛋白胨)、0.9g/L(酵母提取物3g/L+牛肉浸膏2g/L)、1.3g/L(酵母提取物3g/L+鱼粉蛋白胨2g/L)、1.5g/L(酵母提取物2g/L+牛肉浸膏1g/L+鱼粉蛋白胨2g/L)，可知有机氮源组合中酵母提取物2g/L+牛肉浸膏1g/L+鱼粉蛋白胨2g/L组合最适用；C组设计5组无机氮源组合，即(NH

实施例3：ε-PL半固态发酵培养条件优化

以250mL三角瓶为小型生物反应器，选择绿沸石为吸附剂，在无菌环境下将预灭菌的M3G培养基与步骤3获得的成熟的ε-PL半固体发酵种子液混合，并与石料拌匀，置于30℃人工气候箱中静置5天。本部分旨在于优化发酵温度、湿度、接种量、石料中初始培养基饱和度及石料重复使用次数，其中发酵温度设置5个梯度，分别为28℃、29℃、30℃、31℃、32℃；发酵湿度设置5个，分别为50％、60％、70％、80％、90％；接种量设置5个，分别为5％、10％、15％、20％、25；石料中初始培养基饱和度设置8个梯度，分别为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％；石料重复使用次数分别为2次、3次、4次、5次、6次。当对以上参数进行优化时，按照发酵温度30℃、80％空气湿度、15％接种量、70％初始石料培养基饱和度设置其他参数。培养结束后，采用步骤5中的方式对石料进行提取，测定其中ε-PL的浓度，并按照培养基总吸附量进行换算。其结果分别为：(1)发酵温度优化实验：0.7g/L(28℃)、0.8g/L(29℃)、1.0g/L(30℃)、0.9g/L(31℃)、0.5g/L(32℃)，可知最优发酵温度可设置为30℃；(2)空气湿度优化实验：0.5g/L(50％)、0.6g/L(60％)、0.8g/L(70％)、0.8g/L(80％)、0.8g/L(90％)，可知适合半固态发酵的空气湿度在70-90％范围内；(3)接种量优化实验：0.6g/L(5％)、0.9g/L(10％)、1.0g/L(15％)、0.9g/L(20％)、0.7g/L(25％)，可知最优接种量为15％；(4)初始石料培养基饱和度优化实验：1.3g/L(30％)、1.2g/L(40％)、1.1g/L(50％)、1.1g/L(60％)、0.9g/L(70％)、0.8g/L(80％)、0.7g/L(90％)，可知30％-60％均能够获得较高的产物产率，考虑到培养基饱和度太低将减少总产物量，故综合判断后选择60％为最适初始石料培养基饱和度；(5)石料重复使用次数优化实验：0.9g/L(首次)、0.9g/L(2次)、0.9g/L(3次)、0.9g/L(4次)、0.7g/L(5次)、0.5g/L(6次)，可知发酵使用过后的石料经灼烧去除有机质后，在2-4次重复使用中，仍然能够获得较高的产物产率。对以上结果进行总结，可知发酵温度30℃、空气湿度70％-90％、15％接种量、60％初始石料培养基饱和度为最优发酵条件，其中石料能够重复利用至少4次。

实施例4：2L三角瓶中ε-PL半固态雾化补料分批发酵

以2L三角瓶为生物反应器，选择绿沸石为吸附剂，在无菌环境下将预灭菌的M3G改进培养基(葡萄糖40g/L，甘油10g/L，液化淀粉10g/L，酵母提取物2g/L，牛肉浸膏1g/L，鱼粉蛋白胨2g/L，(NH

实施例5：2L三角瓶中ε-PL半固态重复雾化补料分批发酵

依照实施例4的方式进行2L三角瓶中ε-PL半固态重复雾化补料分批发酵，即第一次发酵7天结束后，不进行干燥处理，取出其中90％石料，剩余约10％石料作为种子，加入预灭菌的M3G改进培养基浸泡混匀后，再补充预灭菌的二次石料至此前的总石料体积水平，并与培养基混合。再次加入的石料为二次石料，即如步骤1中所述经过2-4次重复使用的石料。由此进行重复补料分批发酵，总共完成6个批次，各批次发酵时间分别为7天(1批次)、5天(2批次)、6天(3批次)、7天(4批次)、8天(5批次)、8天(6批次)，各批次最终总产量为21.6g/kg石料合产率67.4g/L(1批次)、23.0g/kg石料合产率71.9g/L(2批次)、22.2g/kg石料合产率69.3g/L(3批次)、20.5g/kg石料合产率64.0g/L(4批次)、17.4g/kg石料合产率54.4g/L(5批次)、13.2g/kg石料合产率41.4g/L(6批次)。由此说明，采用最优发酵参数，并使用二次石料，此半固态发酵能够进行重复雾化补料分批发酵，最终获得较高的发酵产率。

实施例6：50L固体反应器中ε-PL半固态雾化补料分批发酵

如步骤1、2进行沸石活化、改性工作，并置于50L固体发酵罐中以121℃灭菌30min。灭菌结束冷却后，将步骤3获得的成熟ε-PL半固体发酵种子液按照15％接种量与预灭菌的M3G改进发酵培养基(葡萄糖40g/L，甘油10g/L，液化淀粉10g/L，酵母提取物2g/L，牛肉浸膏1g/L，鱼粉蛋白胨2g/L，(NH

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。