一种用于构建真核多顺反子的基因间隔区表达元件及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于构建真核多顺反子的基因间隔区表达元件及其应用。

背景技术

天然产物是现代药物创制的重要来源。利用合成生物学的方法进行异源生物合成是获得活性天然产物的重要策略之一。酿酒酵母具有遗传背景清楚、遗传操作较为简单、容易成功表达真核生物基因等特点，已成为合成生物学研究中应用广泛的底盘细胞之一。目前，利用酿酒酵母已完成青蒿素前体青蒿酸、抗癫痫药物大麻素、阿片类药物氢可酮、止咳药物那可丁以及治疗神经肌肉疾病的药物东莨菪碱等重要活性天然产物在细胞工厂中的生产。

复杂结构天然产物的合成途径通常含有10个以上的基因。目前，在酿酒酵母中异源合成这些产物需要为每一个基因提供单独的启动子和终止子，在可供选择的启动子数量有限的情况下，这些基因的表达常常需要重复使用同样的启动子和终止子，从而致使实验操作繁复、目标DNA片段过长，并极大的增加了转化子内部基因同源重组的概率。为了解决这一问题，科学家试图寻找能够用于构建类似原核生物多顺反子的表达元件来实现一个启动子控制多个基因的表达。目前报道较多的为内部核糖体进入位点（internal ribosomeentry site, IRES）和2A自裂解肽序列。

2021年，徐玉泉等鉴定了2个可用于构建多顺反子的基因间隔区表达元件（intergenic gap,

发明内容

本发明的目的是提供一种用于构建真核多顺反子的基因间隔区表达元件（intergenic gap,

本发明通过对序列5’-CAATCAAAC-3’进行点突变后，将其置于2个基因之间，连接上游基因的终止密码子和下游基因的起始密码子，构建双顺反子，检测其介导的下游基因的表达水平，获得了1个高效的基因间隔区表达元件、2个中等效率的基因间隔区表达元件和1个低效的基因间隔区表达元件。

因此，本发明提供一种基因间隔区表达元件，其序列为：

（A）5’-CAATCAAAT-3’；

（B）5’-CTATCAAAT-3’；

（C）5’-CAATCTAAC-3’；

或者（D） 5’-AATCAAA-3’。

所述的基因间隔区表达元件适用于构建多顺反子，因此，本发明还提供一种多顺反子，其采用所述表达元件置于2个基因之间，连接上游基因的终止密码子和下游基因的起始密码子；

优选地将多个基因进行串联表达，具体地由一个启动子和一个转录终止子来控制多个基因的协同表达或抑制，其中由所述（A）、（B）或（C）构建多顺反子用于协同表达；由（D）构建多顺反子用于

所述的多顺反子中开放阅读框的数量为2个及以上，优选为2、3、4个。

本发明还提供含有所述基因间隔区表达元件，或所述多顺反子的重组细胞。所述的重组细胞是真菌或植物细胞，其中真菌具体为酵母、丝状真菌，如酿酒酵母。

本发明还提供一种含有所述多顺反子的重组菌或重组植株。

同时，本发明还提供所述基因间隔区表达元件或所述多顺反子在异源表达中的应用。

所述的应用，所述异源表达是在真菌或植物中进行的；其中真菌具体为酵母、丝状真菌，如酿酒酵母。

本发明的基因间隔区元件可用于真菌、植物等真核生物基因的异源表达，对于利用合成生物学进行天然产物的挖掘、产量的提高以及非天然化合物的创造等方面具有较高的实际应用价值。

本发明的基因间隔区元件可对多个基因进行串联表达，实现通过一个启动子和一个转录终止子来控制多个基因的协同表达或抑制，从而缩短外源多基因目标DNA片段的长度，提高工作效率。另外，不同效率的基因间隔区元件也为实现对目标基因表达的精确控制提供了工具。

附图说明

图1 基因间隔区元件（

图2

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

载体pJET1.2/blunt Cloning Vector：购自Thermo Scientific公司。

载体pUC19：购自NEB公司。

酿酒酵母BJ5464：

酶与试剂盒：

高保真DNA扩增MIX、无缝克隆试剂盒购自诺唯赞公司；

DNA loading buffer和DNA marker购自康为世纪公司；

DNA纯化胶回收试剂盒购自Thermo公司；

冷冻酵母转化试剂盒购自ZYMO RESEARCH生物公司；

大肠杆菌DH5α感受态购自康为世纪公司；其它试剂均为国产分析纯产品。

培养基：

大肠杆菌培养基为LB培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0）。SC-

实施例1、基因间隔区序列的筛选

1.实验目的

以营养缺陷型酿酒酵母BJ5464-NpgA为底盘细胞，以组成型基因

2.实验方法

（1）

根据专利序列5’-CAATCAAAC-3’的信息，设计一系列含有点突变或碱基缺失的特异性引物，通过PCR对

（2）酵母转化

按照冷冻酵母转化试剂盒说明书，将

（3）GFP荧光强度测试

将阳性转化子在SC-

3.实验结果及分析

通过GFP荧光强度测试发现，不同基因间隔区元件介导的下游基因的表达水平不同，即影响到相应酵母转化子中GFP的荧光强度（图1）。与转入

实施例2、利用

1.实验目的

以营养缺陷型酿酒酵母BJ5464-NpgA为底盘细胞，以组成型基因

2.实验方法：

（1）BbBEAS异源表达盒的构建。

根据

（2）酵母转化

同实施例1中酵母转化步骤。

（3）发酵培养

采取二步法发酵技术，首先将适量的酵母转化子菌体接种至10 Ml SC-

（4）LC-MS检测

取1 mL上述所得发酵产物经高速离心和0.22 µm滤膜过滤后，用UPLC-MS检测。

液相色谱分析仪器为Agilent公司1290高效液相色谱，色谱柱为Agilent ZORBAXEclipse Plus C18 RRHD column (1.8 µm, 50 mm x 2.1 mm)；流动相总流速为0.35 mL/min；流动相为流动相A和流动相B的混合物，流动相A为0.1%（体积比）甲酸水溶液、流动相B为0.1%（体积比）甲酸乙腈；总洗脱时间为10分钟；洗脱过程为：0～4 min，流动相B占流动相的体积比由10%线性上升至50%，4～8 min流动相B占流动相的体积比由50%线性上升至95%，8～9.5 min流动相B占流动相的体积比为95%，9.5～10 min流动相B占流动相的体积比由95%线性下降至10%；柱温40℃，样品的进样量为2 μL，柱后流出液不经分流直接进入质谱检测。

3.实验结果及分析

通过LC-MS在表达BbBEAS的酵母阳性转化子中成功检测到白僵菌素（图2），说明