一种间充质干细胞体外培养基及其培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种间充质干细胞体外培养基及其培养方法。

背景技术

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在适宜的培养条件下可分化成多种组织细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。

目前的间充质干细胞都是从身体中提取出来后经过使用培养基进行培养，使得间充质干细胞能够离开人体后能够存活下来，并通过使用营养补给使得间充质干细胞继续生长，目前培养间充质干细胞的培养基培养出来的间充质干细胞品质及存活率都比较低。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种间充质干细胞体外培养基及其培养方法，解决了目前培养间充质干细胞的培养基培养出来的间充质干细胞品质及存活率都比较低的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种间充质干细胞体外培养基，包括以下成分：氯化钙140-200mg/L、氯化钾350-400mg/L、无水硫酸镁72-97.67mg/L、磷酸二氢钾32-60mg/L、氯化钠6800-8000mg/L、无水磷酸二氢钠25-47mg/L、L-丙氨酸12-25mg/L、L-精氨酸盐53-70mg/L、L-天门冬氨酸11-30mg/L、L-胱氨酸盐8-26mg/L、L-谷氨酸56-75mg/L、D-葡萄糖650-1000mg/L、谷胱甘肽0.01-0.05mg/L、盐酸鸟嘌呤0.15-0.30mg/L、次黄嘌呤0.12-0.30mg/L、酚红5-20mg/L、D-核糖0.23-0.50mg/L、乙酸钠26-50mg/L、胸腺嘧啶0.09-0.30mg/L、尿嘧啶0.17-0.30mg/L、黄嘌呤0.12-0.30mg/L、维生素0.02-0.05mg/L、维生素0.005-0.010mg/L、维生素H0.003-0.010mg/L、维生素D20.05-0.010mg/L、L-谷氨酰胺37-100mg/L、甘氨酸16-50mg/L、L-组氨酸盐7.28-21.88mg/L、L-异亮氨酸21-40mg/L、L-蛋氨酸9-15mg/L、硫磺腺嘌呤2-10mg/L、胆固醇0.08-0.20mg/L、脱氧核糖0.12-0.50mg/L、维生素A醋酸酯0.08-0.14mg/L、烟酰胺0.014-0.025mg/L和牛血清650-1500mg/L。

优选的，培养基的制备方法如下：

S1：选择10cm培养皿作为细胞的培养板，并对培养皿进行消毒杀菌的操作、随后放到无菌环境下备用；

S2：将制作培养基的成分依次加入培养皿中，并加入生理盐水进行稀释，同时低速进行搅拌15mi n，得到培养基。

一种间充质干细胞体外培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞提取出来放到牛血清中进行过渡，并观察干细胞的活性；

S2：挑选活性高的间充质干细胞从牛血清中转移到培养基中，隔15-20mi n观察一次间充质干细胞的活性；

S3：将培养基转移到培养箱中进行存放，培养箱中的空气含量为95％、二氧化碳的含量为5％；

S4：将培养完成的间充质干细胞放入单细胞悬液中并计算细胞的总数，随后细胞悬液800～1000r/mi n离心5mi n，去上清液得细胞沉淀物，并且向其中加入细胞冻存液进行冻存。

优选的，所述S3中的牛血清为胎牛血清，胎牛血清的浓度为10％，血清的溶解需要在温度为4℃的环境下进行。

优选的，所述S2中将间充质干细胞转移到培养基中后，需要将培养基的PH值维持在7.2-7.4。

(三)有益效果

本发明提供了一种间充质干细胞体外培养基及其培养方法。具备以下有益效果：

通过添加D-葡萄糖、谷胱甘肽、盐酸鸟嘌呤、次黄嘌呤、酚红、D-核糖、维生素H、维生素D组成间充质干细胞的生长因子制作的培养基，可以有效地提高间充质干细胞培养的品质，进而有利于提高间充质干细胞的成活率，进而降低间充质干细胞的培养成本，保证间充质干细胞的供应。

具体实施方式

本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

本发明实施例提供一种间充质干细胞体外培养基，包括以下成分：氯化钙160mg/L、氯化钾380mg/L、无水硫酸镁75mg/L、磷酸二氢钾48mg/L、氯化钠7200mg/L、无水磷酸二氢钠36mg/L、L-丙氨酸15mg/L、L-精氨酸盐62mg/L、L-天门冬氨酸18mg/L、L-胱氨酸盐13mg/L、L-谷氨酸66mg/L、D-葡萄糖780mg/L、谷胱甘肽0.02mg/L、盐酸鸟嘌呤0.18mg/L、次黄嘌呤0.16mg/L、酚红8mg/L、D-核糖0.28mg/L、乙酸钠29mg/L、胸腺嘧啶0.13mg/L、尿嘧啶0.23mg/L、黄嘌呤0.14mg/L、维生素0.03mg/L、维生素0.008mg/L、维生素H0.006mg/L、维生素D20.08mg/L、L-谷氨酰胺40mg/L、甘氨酸21mg/L、L-组氨酸盐13mg/L、L-异亮氨酸25mg/L、L-蛋氨酸12mg/L、硫磺腺嘌呤8mg/L、胆固醇0.15mg/L、脱氧核糖0.36mg/L、维生素A醋酸酯0.09mg/L、烟酰0.018mg/L和牛血清960mg/L。

培养基的制备方法如下：

S1：选择10cm培养皿作为细胞的培养板，并对培养皿进行消毒杀菌的操作、随后放到无菌环境下备用；

S2：将制作培养基的成分依次加入培养皿中，并加入生理盐水进行稀释，同时低速进行搅拌15mi n，得到培养基。

一种间充质干细胞体外培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞提取出来放到牛血清中进行过渡，并观察干细胞的活性；

S2：挑选活性高的间充质干细胞从牛血清中转移到培养基中，隔15mi n观察一次间充质干细胞的活性；

S3：将培养基转移到培养箱中进行存放，培养箱中的空气含量为95％、二氧化碳的含量为5％；

S4：将培养完成的间充质干细胞放入单细胞悬液中并计算细胞的总数，随后细胞悬液950r/mi n离心5mi n，去上清液得细胞沉淀物，并且向其中加入细胞冻存液进行冻存。

S3中的牛血清为胎牛血清，胎牛血清的浓度为10％，血清的溶解需要在温度为4℃的环境下进行。

S2中将间充质干细胞转移到培养基中后，需要将培养基的PH值维持在7.2-7.4。

实施例二：

一种间充质干细胞体外培养基，包括以下成分：氯化钙160mg/L、氯化钾380mg/L、无水硫酸镁75mg/L、磷酸二氢钾48mg/L、氯化钠7200mg/L、无水磷酸二氢钠36mg/L、L-丙氨酸15mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-酪氨酸40mg/L、L-胱氨酸盐13mg/L、三磷酸腺苷二钠1mg/L、对氨基苯甲酸0.05、D-葡萄糖780mg/L、谷胱甘肽0.02mg/L、盐酸鸟嘌呤0.18mg/L、次黄嘌呤0.16mg/L、酚红8mg/L、D-核糖0.28mg/L、乙酸钠29mg/L、胸腺嘧啶0.13mg/L、尿嘧啶0.23mg/L、黄嘌呤0.14mg/L、维生素0.03mg/L、维生素0.008mg/L、维生素H0.006mg/L、维生素D20.08mg/L、L-谷氨酰胺40mg/L、甘氨酸21mg/L、L-组氨酸盐13mg/L、L-异亮氨酸25mg/L、L-蛋氨酸12mg/L、硫磺腺嘌呤8mg/L、胆固醇0.15mg/L、脱氧核糖0.36mg/L、维生素A醋酸酯0.09mg/L、烟酰0.018mg/L和牛血清960mg/L。

培养基的制备方法如下：

S1：选择10cm培养皿作为细胞的培养板，并对培养皿进行消毒杀菌的操作、随后放到无菌环境下备用；

S2：将制作培养基的成分依次加入培养皿中，并加入生理盐水进行稀释，同时低速进行搅拌15mi n，得到培养基。

一种间充质干细胞体外培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞提取出来放到牛血清中进行过渡，并观察干细胞的活性；

S2：挑选活性高的间充质干细胞从牛血清中转移到培养基中，隔15mi n观察一次间充质干细胞的活性；

S3：将培养基转移到培养箱中进行存放，培养箱中的空气含量为95％、二氧化碳的含量为5％；

S4：将培养完成的间充质干细胞放入单细胞悬液中并计算细胞的总数，随后细胞悬液950r/mi n离心5mi n，去上清液得细胞沉淀物，并且向其中加入细胞冻存液进行冻存。

S3中的牛血清为胎牛血清，胎牛血清的浓度为10％，血清的溶解需要在温度为4℃的环境下进行。

S2中将间充质干细胞转移到培养基中后，需要将培养基的PH值维持在7.2-7.4。

实施例三：

一种间充质干细胞体外培养基，包括以下成分：氯化钙160mg/L、氯化钾380mg/L、无水硫酸镁75mg/L、磷酸二氢钾48mg/L、氯化钠7200mg/L、无水磷酸二氢钠36mg/L、L-丙氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸25mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-胱氨酸盐13mg/L、L-丝氨酸25mg/L、D-葡萄糖780mg/L、谷胱甘肽0.02mg/L、盐酸鸟嘌呤0.18mg/L、次黄嘌呤0.16mg/L、酚红8mg/L、D-核糖0.28mg/L、乙酸钠29mg/L、胸腺嘧啶0.13mg/L、尿嘧啶0.23mg/L、黄嘌呤0.14mg/L、维生素0.03mg/L、维生素0.008mg/L、维生素H0.006mg/L、维生素D20.08mg/L、L-谷氨酰胺40mg/L、甘氨酸21mg/L、L-组氨酸盐13mg/L、L-异亮氨酸25mg/L、L-蛋氨酸12mg/L、硫磺腺嘌呤8mg/L、胆固醇0.15mg/L、脱氧核糖0.36mg/L、维生素A醋酸酯0.09mg/L、烟酰0.018mg/L和牛血清960mg/L。

培养基的制备方法如下：

S1：选择10cm培养皿作为细胞的培养板，并对培养皿进行消毒杀菌的操作、随后放到无菌环境下备用；

S2：将制作培养基的成分依次加入培养皿中，并加入生理盐水进行稀释，同时低速进行搅拌15mi n，得到培养基。

一种间充质干细胞体外培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞提取出来放到牛血清中进行过渡，并观察干细胞的活性；

S2：挑选活性高的间充质干细胞从牛血清中转移到培养基中，隔15mi n观察一次间充质干细胞的活性；

S3：将培养基转移到培养箱中进行存放，培养箱中的空气含量为95％、二氧化碳的含量为5％；

S4：将培养完成的间充质干细胞放入单细胞悬液中并计算细胞的总数，随后细胞悬液950r/mi n离心5mi n，去上清液得细胞沉淀物，并且向其中加入细胞冻存液进行冻存。

S3中的牛血清为胎牛血清，胎牛血清的浓度为10％，血清的溶解需要在温度为4℃的环境下进行。

S2中将间充质干细胞转移到培养基中后，需要将培养基的PH值维持在7.2-7.4。

在不同培养基下间充质干细胞的生长、存活和直径变化的数据表：

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。