一种生产3-羟基丁酸的氮氢单胞菌T1及其应用

技术领域

本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及一种生产3-羟基丁酸的氮氢单胞菌T1及其应用。

背景技术

3HB（3-羟基丁酸，以下简称3HB）是一种酮体，在人体内，3HB是在肝脏中通过3-羟基丁酸脱氢酶催化乙酰辅酶A合成的，在血糖过低的情况下可作为人体（特别是大脑）的能量来源。目前已证实该物质具有预防和治疗骨质疏松、直肠癌、高血糖、抗衰老等作用，在保健品、生物医药领域具有巨大的市场潜力

3HB的生产主要有化学合成法和生物发酵法两种。其中化学催化法是工业化合成3HB的常用方法，然而该方法成本昂贵，且难以控制产物的旋光性。生物发酵法具有环境友好、产物光学纯度高、合成路线灵活可调控等优点，受到国内外广泛关注。利用合成生物技术，在微生物底盘细胞中构建3HB的生物合成途径，进一步通过代谢调控、发酵工艺优化等策略提高产量、产率，可实现低成本规模化生产3HB，且环境友好。然而，目前生物法尚无大规模的生产线，原因在于其成本较化学催化法没有显著优势，且基因工程菌合成的3HB原料尚未通过美国食品药监局批准。

目前，一些可用作发酵生产PHB的天然微生物菌株已被报道，例如：Cupriavidusnecator、Azohydromonas lata

发明内容

针对上述技术问题，本申请提供了一种可以生产3HB的氮氢单胞菌T1，所述菌株相比于基因工程改造的可生产3HB的菌株，利用天然菌株发酵更为安全，且更容易通过食品安全相关法规。

本申请具体技术方案如下：

1. 一种氮氢单胞菌T1（

2. 项1所述的氮氢单胞菌T1在发酵生产3-羟基丁酸(3HB)领域中的应用。

3. 含有项1所述的氮氢单胞菌T1的培养物。

4. 项3所述的培养物在制备3-羟基丁酸(3HB)中的应用。

5. 一种发酵生产3-羟基丁酸的方法，包括：

利用保藏编号为CGMCC NO: 25679的氮氢单胞菌T1发酵生产3-羟基丁酸。

6. 根据项5所述的方法，其中，所述方法包括：

将所述氮氢单胞菌T1进行活化后接种到种子培养基中进行培养得到种子液；

将种子液接种到发酵培养基中进行发酵以生产3-羟基丁酸。

7. 根据项6所述的方法，其中发酵培养基中含有碳源和氮源，每1L发酵培养基中含有1-20g的氮源和20-40g的碳源；

优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、糖蜜、玉米淀粉、麦芽提取物中任一种或两种或三种，所述氮源为蛋白胨、尿素、硫酸铵、氨水中任一种或两种或三种。

8. 根据项6或7所述的方法，其中，所述发酵培养基中碳源以补料方式加入，优选地，当所述碳源低于5g/L时进行补料。

9. 根据项6-8中任一项所述的方法，其中，将种子液接种到发酵培养基中进行发酵，然后进行静置培养得到3HB，优选地，静置培养4h以上。

10. 根据项9所述的方法，其中所述的发酵或者静置培养过程中pH为4 -6。

11. 一种发酵组合物，其包含保藏编号为CGMCC NO: 25679的氮氢单胞菌T1和发酵液，所述发酵液中3HB的浓度在10 g/L以上，优选在15 g/L以上。

12. 一种组合物，其包含项3所述的培养物、利用项5-10任一项所述的方法制备得到的3-羟基丁酸或项11所述的发酵组合物。

发明的效果

本申请所述的菌株是一种可以生产3HB的氮氢单胞菌，本申请通过分阶段发酵方法，可实现野生菌株天然生产3HB。相较传统的化学法，通过发酵技术生产的3HB产量可达20g/L，得率接近理论得率，且产品具有100%的光学纯度，生产方式环境友好，绿色低碳。此外，该菌为天然分离的野生菌（非致病菌），相较于基因工程菌具有生物安全性高等优点，更容易通过食品安全法规。

附图说明

图1是发酵培养基中不同蛋白胨含量对3HB产量影响的示意图。

图2是发酵培养基中不同葡萄糖含量对3HB产量影响的示意图。

图3是静置培养阶段不同pH对3HB产量影响的示意图。

图4是静置培养阶段不同温度对3HB产量影响的示意图。

图5是静置培养阶段不同静置时间对3HB产量影响的示意图。

图6是摇瓶发酵阶段分批补料对3HB产量影响的示意图。

图7是5L发酵罐发酵阶段补料分批发酵对3HB产量影响的示意图。

图8是菌种系统进化树。

菌株保藏信息

本申请所述的氮氢单胞菌T1（

具体实施方式

下面结合所描述的实施方式对本申请做以详细说明。虽然显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本申请提供了一种氮氢单胞菌T1（

本申请所述的菌株是从大兴北臧村镇马村小麦土地的根际土壤分离得到，所述菌株可天然生产3HB，所述的菌株在摇瓶发酵阶段产生的3HB的浓度为10g/L，在进行静置发酵后产生的3HB的浓度可达20 g/L，得率接近理论得率，且产品具有100%的光学纯度，生产方式环境友好，绿色低碳。

在一些实施方式中，所述氮氢单胞菌T1（

本申请提供了保藏编号为CGMCC NO: 25679的氮氢单胞菌T1在发酵领域中的应用，优选在发酵生产3-羟基丁酸(3HB)领域中的应用。

本申请所述的菌株可实现野生菌株天然生产3HB，其相较于基因工程菌具有生物安全性高等优点，更容易通过食品安全法规。

本申请提供了一种含有上述所述的氮氢单胞菌T1的培养物。

本申请提供了上述所述的培养物在制备3-羟基丁酸(3HB)中的应用。

本申请提供了一种发酵生产3-羟基丁酸的方法，包括：

利用保藏编号为CGMCC NO: 25679的氮氢单胞菌T1发酵产3-羟基丁酸。

本申请所述的方法发酵生产3HB，所得到的3HB的浓度高，接近于理论产率，并且所得到的3HB光学纯度较纯，100 %为（R）-3-羟基丁酸且在产量、得率方面具有很强优势，在工业应用中具有较大潜质。

在本申请中，对于理论产率的计算方法，本申请不作任何限制，其可以采用本领域常规的方法进行测定，例如可以根据3HB的代谢途径得到，例如根据1mol的葡萄糖可以生成1mol 3HB，由m=M*n计算得到理论产率约为0.5，其中，n为1mol，M为葡萄糖或3HB的相对分子质量，m

在一些实施方式中，所述方法包括：

将所述氮氢单胞菌T1进行活化后接种到种子培养基中进行培养得到种子液；

将种子液接种到发酵培养基中进行发酵以生产3-羟基丁酸。

在本申请中，将所述氮氢单胞菌T1接种到活化培养基中进行活化，在本申请中，对于活化培养基，本申请不作任何限制，例如活化培养基可以包含牛肉浸膏，蛋白胨和琼脂。在一些实施方式中，每1L所述活化培养基中可以包含2.5-3.5g的牛肉浸膏、4.5-5.5g的蛋白胨以及10-20g的琼脂。

在本申请中，对于活化培养基，在使用前需要进行灭菌，例如可以在121℃下灭菌20min。

在一些实施方式中，在活化培养基中在温度为25-35℃下培养40-60h。

在本申请中，对于种子培养基，本申请不作任何限制，其可以根据需要进行常规选择，例如，所述种子培养基包含牛肉浸膏和蛋白胨。在一些实施方式中，每1L的种子培养基可以包含1-5g的牛肉浸膏和2-10g的蛋白胨。

在一些实施方式中，将活化后的氮氢单胞菌T1接种到种子培养基中在温度为25-40℃下培养20-26h。

例如，将活化后的氮氢单胞菌T1接种到种子培养基中在25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等下培养20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h等。

在本申请中，对于种子培养基，在使用前需要进行灭菌，例如可以在121℃灭菌20min。

在一些实施方式中，所述发酵培养基含有碳源和氮源，每1L发酵培养基中含有1-20g的氮源和20-40g的碳源；碳源可以为糖类、油脂、有机酸和低碳醇，优选为葡萄糖、蔗糖、果糖、糖蜜、玉米淀粉和麦芽提取物中的任一种或两种或三种；氮源可以为有机氮源和无机氮源，优选为尿素、硫酸铵，蛋白胨和氨水中的任一种或两种或三种。

更优选地，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为蛋白胨。

例如，每1L发酵培养基中可以含有1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、11g、12g、13g、14g、15g、16g、17g、18g、19g或20g的氮源和20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g或40g的碳源。

在一些实施方式中，所述发酵培养基还含有酵母提取物、MgSO

在一些实施方式中，每1L发酵培养基中含有150-350mg的酵母提取物、100-300mg的MgSO

在一些实施方式中，将种子液以1-5%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵。

在一些实施方式中，将碳源以分批补料的方式加入到发酵培养基中。

例如，当1L发酵培养基中的碳源低于5g时补充碳源。

在本申请中，通过测糖仪测定发酵培养基中的残糖。对于1L发酵培养基中的碳源低于5g时是基于发酵过程中一般残糖量在5g/L时需要补充碳源。

在一些实施方式中，将种子液接种到发酵培养基中进行发酵，然后进行静置培养得到3HB。

在本申请中，将种子液接种到发酵培养基中进行发酵，然后进行静置培养得到3HB，即在第一阶段进行发酵培养，然后在第二阶段进行静置培养得到3HB。

在一些实施方式中，在温度为20-40℃下，在200-250rpm下摇瓶发酵，优选发酵32-56h。

例如在温度为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等下，在200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm等下摇瓶发酵，例如发酵32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h、50h、52h、54h、56h等。

在一些实施方式中，所述静置培养是将摇瓶发酵后得到的发酵液离心去上清，并重悬培养；

优选地，使用pH为3-6的无菌水进行重悬；

优选地，在30-45℃下培养4h以上。

例如，使用pH为3、4、5、6等的无菌水去除上清的沉淀进行重悬；并在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等下培养4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h等。

在本申请中，所述无菌水中不含有1,3-丁二醇。

在一些实施方式中，所述方法包括将保藏编号为CGMCC NO: 25679的氮氢单胞菌T1进行发酵得到。在一些实施方式中，所述方法包括：

将所述氮氢单胞菌T1进行活化后接种到种子培养基中进行培养得到种子液；将种子液接种到发酵培养基中进行发酵得到3HB。在一些实施方式中，所述发酵培养基含有碳源和氮源，每1L发酵培养基中含有1-20g的氮源和20-40g的碳源；优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、糖蜜、玉米淀粉、麦芽提取物中任一种或两种或三种，所述氮源为蛋白胨、尿素、硫酸铵、氨水中任一种或两种或三种。在一些实施方式中，所述发酵培养基中碳源以补料方式加入，优选地，当所述碳源低于5g/L时进行补料。在一些实施方式中，将种子液接种到发酵培养基中进行发酵，然后进行静置培养得到3HB。在一些实施方式中，在温度为20-40℃下，在200-250rpm下摇瓶发酵，优选发酵46-56h。在一些实施方式中，所述静置培养是将摇瓶发酵后得到的发酵液离心去上清，并重悬培养；优选地，使用pH为3-6的无菌水进行重悬；优选地，在30-45℃下培养4h。在一些实施方式中，所述静置培养是发酵罐发酵完成后直接静置培养；优选地，所述pH为4-6；优选地，在30-45℃下培养4h以上。例如，在pH为4.0、4.5、5、5.5、6条件下并在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等下培养4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h、50h等。

本申请提供了一种组合物，其包含保藏编号为CGMCC NO: 25679的氮氢单胞菌T1和发酵液，所述发酵液中3HB的浓度在10 g/L以上，优选在15 g/L以上。在一些实施方式中，用于生产发酵液的发酵培养基含有碳源和氮源，每1L发酵培养基中含有1-20g的氮源和20-40g的碳源；优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、糖蜜、玉米淀粉和麦芽提取物中任一种或两种或三种，所述氮源为蛋白胨、尿素、硫酸铵和氨水中任一种或两种或三种。

本申请提供了一种食品或者药品，其包含上述所述的培养物、上述所述的方法制备得到的3-羟基丁酸或者上述所述的组合物。

本申请采用补料的方法进行发酵，所得到的3HB产量较高，产量约为19.8g/L，并且葡萄糖的得率为0.34g/g葡萄糖，发酵成本较低。

实施例

本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1 菌株的筛选

从大兴北臧村镇马村小麦土地的根际土壤中分离出一株可生产3HB的菌种。其形态特征如下：菌落形态呈圆形，表面光滑、略有凸起；菌落初期呈淡黄色，生长后期菌落中心微红。经北京擎科生物科技有限公司鉴定确定为氮氢单胞菌（Azohydromonas lata），其系统进化树见图8。将该菌株于2022年09月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO: 25679，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

实施例2 菌株发酵条件的优化

活化：将实施例1所得到的菌株在活化培养基中进行活化，活化温度30℃，培养约48h，所述活化培养基中包含牛肉浸膏 3g/L，蛋白胨5g/L，琼脂15g/L，并在使用前在121℃下灭菌20min。

制备种子液：挑取活化培养基平板上的单菌落接种到种子培养基中，于30℃培养24h后得到种子液，所述种子培养基中包含牛肉浸膏 3g/L，蛋白胨5g/L，所述种子培养基在使用前在121℃下灭菌20min。

发酵：将种子液以1 %（v/v）的接种量接种至发酵培养基中进行两阶段发酵，第一阶段是摇瓶发酵，第二阶段是静置培养，并测定发酵液中的3HB的含量，测定发酵液中的3HB的方法如下：

取静置5h后的发酵液13000×g离心1min，吸取1mL上清液用0.22μm滤头过滤，使用岛津高效液相色谱（HPLC）进行检测，色谱柱为Xtimate Sugar-H，流动相为5mM H

其中，发酵培养基中含有酵母提取物 250mg/L，MgSO

（1）发酵培养基中的氮源的含量对3HB产量的影响

发酵培养基以20g/L葡萄糖作为碳源，蛋白胨添加量分别为1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L，第一阶段摇瓶发酵48h，第二阶段静置培养5h，随后按照上述的方法测量发酵液中3HB产量，其结果如图1所示。

从图1可以看出，当蛋白胨添加量在15g/L时，3HB产量最高；蛋白胨含量超过15 g/L后，3HB产量不再相应提高。

（2）发酵培养基中的碳源的含量对3HB产量的影响

发酵培养基以15 g/L蛋白胨作为氮源，葡萄糖添加量分别为20g/L、30g/L、40g/L，第一阶段摇瓶发酵约48h，第二阶段静置培养5h，随后按照上述的方法测量发酵液中3HB产量，其结果见图2所示。

从图2可以看出，当蛋白胨添加量在15g/L时，以30g/L葡萄糖作为碳源发酵，3HB产量最高；葡萄糖浓度大于30 g/L时，3HB产量不再相应提高。

（3）pH对产3HB的影响

发酵培养基中碳源为20g/L葡萄糖、氮源为10g/L蛋白胨，第一阶段发酵48h，取10mL菌液离心，用无菌水洗涤菌体沉淀，随后加入2mL pH分别为3、4、5、6的无菌水将菌体重悬，于37℃静置5h后按照上述的方法测量3HB产量，其结果见图3所示。

从图3可以看出，pH<5时，3HB的产量很低（小于1 g/L）；当pH为5时，3HB产量最高，达到4 g/L；当pH为6时，3HB产量迅速降低至2 g/L。

（4）温度对产3HB的影响

发酵培养基中碳源为20g/L葡萄糖、氮源为10g/L蛋白胨，第一阶段发酵48h，取10mL菌液离心，用无菌水洗涤菌体，随后加入2mL pH为5的无菌水将菌体重悬，分别于30℃、35℃、37℃、45℃下静置5h。取样按照上述的方法测量3HB终产量，其结果如图4所示。

从图4可以看出，反应温度对3HB产量影响不大，37℃为最佳反应温度。

（5）反应时间对产3HB的影响

发酵培养基中碳源为30g/L葡萄糖、氮源为20g/L蛋白胨，第一阶段发酵培养48h，第二阶段分别静置培养0h、1h、5h、23h、30h后按照上述的方法检测3HB产量，其结果如图5所示。

从图5可以看出，在0-4小时之间，3HB浓度逐渐上升；在第4小时时，产量达到最高，此后，静置时间的延长对3HB产量的提高没有影响。

（6）菌株摇瓶发酵

使用上述优化后的发酵条件对菌株进行摇瓶发酵。其中，发酵培养基中碳源为30g/L葡萄糖、氮源为15g/L蛋白胨。第一阶段发酵培养48h，第二阶段调节pH为5后，在37℃条件下静置培养5h。按照上述方法检测3HB产量，其结果如图6所示，其中优化前的发酵条件为：碳源为20g/L葡萄糖、氮源为10 g/L蛋白胨的发酵培养基中进行发酵，发酵结束未调节pH直接静置。

从图6可以看出，在摇瓶的发酵条件下，3HB产量达10g/L左右，而使用优化前的发酵条件进行发酵时，3HB产量仅有3g/L。

实施例3补料分批发酵对3HB产量的影响

从-80℃冰箱取出含有实施例1菌株的甘油管，通过划线的方式转接到活化培养基（活化培养基于实施例1相同）上，30℃静置培养48h，至平板上长出清晰可见的单菌落。用接种环从平板上挑取一个单菌落到发酵培养基（发酵培养基中的组分与实施例2相同）中作为种子摇瓶，30℃、230rpm条件下培养22h后接种至发酵罐（组分与实施例2中的相同）中培养，此时种子摇瓶OD600约为10.5。

5L发酵罐发酵装液量为2L，接种量为10%，培养温度为30℃，用2.5 M NaOH控制pH在6.8。初始搅拌转速为200 rpm，初始溶氧控制在60%左右，发酵后期溶氧控制在30%左右。初始葡萄糖为20g/L、蛋白胨为15g/L，当碳源（葡萄糖）低于5g/L时进行补料操作，通过计算耗糖速率一次性补入一定量的60%（W/W）的葡萄糖，直至48h后发酵结束。发酵过程中每两小时取样检测残糖和菌浓的变化情况，发酵后期取样检测3HB产量。发酵液样品直接用1M 盐酸缓冲液将pH调节至5，放置于37℃培养箱5h后检测，其结果如图7所示，其中，残糖的测定使用S-10生物传感器分析仪。取1mL菌液13000×g离心1min，将上清液稀释十倍后测量发酵液中剩余的葡萄糖含量。

从图7可以看出，该批次发酵前期由于溶氧较高，利于菌株生长，菌株耗糖较快，发酵9h时，发酵液残糖含量仅剩7.5g/L，随后补入13g/L葡萄糖，菌株继续快速生长。发酵约18h，控制溶氧在20%-30%，后期随着葡萄糖的消耗，分别于18h、20h、24h、28h、32h、42h补入了一定量的葡萄糖以维持菌株的生长，发酵终点3HB产量约为19.8g/L。期间总耗糖量58g/L，得率：0.34 g /g葡萄糖（理论得率0.5 g/g）。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

参考文献：

1. Peña C, Castillo T, García A, Millán M, Segura D. Biotechnologicalstrategies to improve production of microbial poly-(3-hydroxybutyrate): areview of recent research work. Microb Biotechnol. 2014 Jul;7(4):278-93。