一种阻断CD47信号通路的鞭毛敲除细菌

一、技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种阻断CD47信号通路的鞭毛敲除细菌作为治疗药物的制备和应用。

二、背景技术

癌症仍然是人类难以克服的一种主要疾病。目前越来越多的研究者开始从化药方向转变到免疫治疗，聚焦于肿瘤微环境中细胞与细胞之间相互作用、以及免疫细胞分泌的细胞因子对肿瘤免疫的激活作用。

巨噬细胞长期以来被认为是一种进化上古老的细胞类型，参与组织稳态和对病原体的免疫防御，现在作为包括癌症在内的多种疾病的调节因子正在被重新发现。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)代表了肿瘤微环境(TME)中最丰富的先天免疫群体，具有从抗致瘤到促致瘤的异质性特性。抗肿瘤性TAMs保留了抗原提呈细胞的特性，包括MHCII的高表达、吞噬作用和肿瘤杀伤活性。抗肿瘤性TAMs分泌促炎细胞因子，支持和激活适应性免疫细胞。相比之下，致瘤性TAMs具有免疫抑制作用，其特征是MHCII的低表达和抑制分子如PD-1、PD-L1、VISTA、B7-H4和Tim3的表达。

肿瘤细胞能够上调CD47表达，与巨噬细胞抑制受体信号调节蛋白α(SIRPα)相互作用，传递“别吃我”信号，从而避免巨噬细胞吞噬。因此，当CD47-SIRPα轴被抑制时，巨噬细胞的吞噬功能可以恢复，并能发挥抗肿瘤作用。

CD47是免疫球蛋白超家族中的一种I型跨膜糖蛋白，广泛表达于红细胞、血小板、淋巴细胞等正常细胞上。它与SIRPα相互作用，触发“别吃我”的信号，以防止巨噬细胞或其他吞噬细胞的吞噬作用。CD47也参与肿瘤进展，并与肿瘤预后不良有关。与CD47的广泛表达不同，SIRPα的表达相对局限于髓系细胞，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。SIRPα，它是一种I型跨膜蛋白，参与调节细胞的迁移和吞噬作用。

目前针对CD47靶点已有临床或临床前研究，包括小分子药物、基因治疗等。但小分子抑制剂无法精准靶向肿瘤部位，进入机体后会随着血液循环遍布全身，能够引起一系列毒副作用。基因治疗如mRNA等核酸药物主要存在的是递送问题，核酸药物携带负电荷，无法很好地与同样呈负电荷的细胞膜结合后被内吞。目前主流的核酸药物递送利用阳离子脂质体，但脂质体有两点主要的副作用，其一是对细胞具有毒作用，其二是进入机体后在肝脏富集，难以精准靶向。

本研究采用减毒沙门氏菌作为载体，在沙门氏菌内导入表达CD47拮抗蛋白的质粒，并且在前端插入信号肽使其成为分泌蛋白。沙门氏菌进入细胞后，由于其敲除鞭毛蛋白，能够失去对宿主细胞的杀伤性，成为一个“蛋白质工厂”，不断分泌CD47拮抗蛋白，阻断CD47-SIRPα轴以达到阻断肿瘤细胞“别吃我”信号的目的。同时，由于沙门氏菌为厌氧菌，进入机体后能够在肿瘤部位富集，达到精准靶向的目的，对机体的毒副作用相对较小，是一种理想的递送方式。

三、发明内容

1.发明目的

本发明构建一种阻断CD47信号通路的鞭毛敲除细菌，利用减毒沙门氏菌表达CD47拮抗蛋白，在肿瘤部位特异性阻断CD47-SIRPα轴以达到阻断肿瘤细胞“别吃我”信号的目的，且沙门氏菌能够精准靶向肿瘤部位并在肿瘤内聚集，是一种理想的肿瘤治疗药物。

2.技术解决方案

2.1.鞭毛基因flhD敲除载体制备

本研究中用作细菌载体的菌株采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，已在文献中证明其安全性。

将VNP20009于液体培养基中震荡培养过夜(37℃，150rpm)，离心收集后，利用Red同源重组法将鞭毛基因flhD敲除，通过电镜能够直观地看到VNP20009不表达鞭毛蛋白。

2.2表达CD47拮抗蛋白质粒制备

蛋白序列在金斯瑞公司合成，收到后设计引物将目的片段aCD47进行PCR扩增，通过同源重组整合到线性化的质粒载体pUC19(带有Amp抗性)，导入大肠杆菌内扩增培养，提取的质粒即为目的质粒pUC19-aCD47。

2.3目的质粒导入细菌载体制备

将2.2所述目的质粒pUC19-aCD47利用电转化法导入2.1所述细菌载体中，通过Western Blot验证CD47拮抗蛋白表达情况，将能够正常表达蛋白的菌种扩增后计数，保藏于25％甘油中，于-80℃冰箱贮存。

2.4小鼠肿瘤模型药效验证

将2.3制备的减毒菌株分别稀释至1×10^

在安全范围内选取最佳药效剂量，与CD47小分子抑制剂对照比较阻断CD47-SIRPα轴的药效，通过流式细胞术等验证免疫细胞激活及浸润情况。

3.技术效果

本研究利用沙门氏菌作为细菌载体，在肿瘤部位特异性阻断CD47-SIRPα轴以达到阻断肿瘤细胞“别吃我”信号的目的。同时，沙门氏菌为厌氧菌，进入机体后能够在肿瘤部位富集，达到精准靶向的目的，对机体的毒副作用相对较小，是一种理想的递送方式。

四、具体实施方式

实施例1.表达CD47拮抗蛋白的质粒载体制备

1.1目的基因扩增

目的片段在金斯瑞公司合成，设计上下游引物p1、p2。将含有目的质粒的菌液于10ml LB培养基中，37℃摇床过夜，用质粒小提试剂盒裂解菌体提取质粒。将质粒测定浓度后进行高保真PCR扩增，体系如下：高保真酶25μl；去离子水17μl；引物p1、p2各2μl；模板(目的质粒)4μl；总体积50μl。PCR循环参数：98℃预变性5min；98℃10s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，其余产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒或快速PCR产物回收试剂盒回收纯化，最后溶于适量去离子水中并测定回收DNA浓度。

1.2 pUC19质粒载体线性化

将pUC19质粒载体利用PstI内切酶进行酶切线性化，反应体系：载体质粒10μg；10×酶切缓冲液10μl；PstI内切酶2μl；去离子水补齐至100μl。37℃水浴酶切2h，加入1μl快速CIP试剂去磷酸化，37℃水浴30min防止切开的载体环化。用琼脂糖凝胶回收试剂盒或快速PCR产物回收试剂盒回收纯化，最后溶于适量去离子水中并测定回收DNA浓度。

1.3 pUC19质粒载体与目的片段同源重组连接

采用同源重组试剂盒，将目的片段浓度与载体比例为3∶1同源重组连接，反应体系：pUC19酶切载体50ng；目的片段150ng；缓冲液4μl；同源重组反应酶2μl；去离子水补齐至20μl。37℃水浴30min，立即冰浴5min，转化大肠杆菌DH5α。

1.4大肠杆菌E.coli DH5α转化

将连接产物10μl、5×KCM试剂10μl、去离子水30μl混匀冰浴，加入50μL感受态E.coli DH5α冰浴30min，42℃热激90s，加入1mL LB培养基于37℃培养1h，5000rpm离心5min，留部分液体重悬涂板。

1.5菌落PCR及测序验证

将涂板后的单菌落挑取至LB液体培养基中振荡培养8h，设计引物p3、p4进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测目的片段连接情况，取部分菌液送至南京擎科生物进行测序，序列比对无误后保藏于25％甘油中，于-80℃冰箱贮存。

实施例2.鞭毛基因flhD敲除的减毒沙门氏菌VNP20009载体制备

将VNP20009于液体培养基中震荡培养过夜(37℃，150rpm)，离心收集后，利用Red同源重组法将鞭毛基因flhD敲除，通过电镜能够直观地看到VNP20009不表达鞭毛蛋白。

实施例3.构建表达连接质粒的减毒沙门氏菌VNP20009

将实施例1所述含有正确连接质粒的大肠杆菌扩增培养，用质粒小提试剂盒提取质粒后测定浓度，采用电转化法导入实施例2所述鞭毛基因敲除的减毒沙门氏菌VNP20009中，用western blot检测分泌蛋白表达情况。选取表达较好的菌株，扩增培养后计数，保藏于25％甘油中，于-80℃冰箱贮存。

实施例4.减毒沙门氏菌肿瘤疫苗动物药效验证

本实施例采用Balb/c小鼠构建CT26结直肠癌模型验证，实验用鼠购自集萃药康，饲养于南京大学实验动物中心洁净屏障内，饲养室温度约25℃，湿度40％～70％，新引入的实验动物在实验前适应1～3天。

将实施例3制备的减毒菌株分别稀释至1×10^

在安全范围内选取最佳药效剂量，与CD47小分子抑制剂对照比较阻断CD47-SIRPα轴的药效，通过流式细胞术等验证免疫细胞激活及浸润情况。

结果表明减毒沙门氏菌VNP20009能够在肿瘤内部持续表达CD47拮抗蛋白，阻断CD47-SIRPα轴，药效良好，安全性评价显示安全性较好，表明本发明制备的细菌载体表达CD47拮抗蛋白治疗肿瘤具有较好的疗效以及较高的安全性。