固定化酶、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及应用。

背景技术

酶是由活细胞产生的具有催化作用的生物催化剂，由于其高效的催化机制、独特的底物选择性以及反应的可控性，使其在化学、生物工程学及药品生产等领域具有广阔的应用前景。而且生物催化剂本质为无毒，对环境友好的蛋白质，已经替代了许多传统的化学催化剂。相较于传统的游离酶，固定化酶具有稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产等优点，所以，固定化酶已经逐渐取代游离酶在工业生产、化学分析和医药等方面被广泛应用。

传统的固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法等，这些方法都需要其他载体的参与，把酶分子在不同的原理下结合在载体上，从而实现回收方便的特性。而无载体酶固定化的方法CLEAs(Cross-Linking Enzyme Aggregates)是使用戊二醛作为交联剂把处于沉淀状态的酶分子固定下来，所得到的固定化酶显示了良好的催化活性，具有成本低，高比表面积，高活性与耐受性高等优点。

但是传统无载体固定化酶具有颗粒大小不均匀，机械稳定性差，回收困难等缺点，面对这些难题，国内外对磁性交联酶聚集体M-CLEAs(Magnetic-CLEAs)的研发兴趣日益浓厚。磁性交联酶聚集体是一种新型的固定化酶，能够借助外部磁场进行分离、回收，可克服无载体固定化酶的缺陷。目前大部分磁性交联酶聚集体都是以磁性铁氧化物颗粒进行硅烷化或者进行其他的基团修饰后再固定，应用于海藻糖合酶、β-半乳糖苷酶、磷脂酶等酶的固定化，提高了酶的使用效率。

目前，磁性高分子微球为磁性交联酶聚集体制备所需的热门磁性材料。磁性高分子微球的性质取决于无机磁性物质、高分子材料及其相互作用方法。无机磁性物质应用最广泛的为四氧化三铁(Fe

以上方式得到的磁性高分子微球虽然功能性强但是制备工艺复杂，使用的高分子材料多，相应地很大程度上提高了生产成本。

发明内容

本发明旨在提供一种固定化酶、其制备方法及应用，以解决现有技术中磁性交联酶聚集体制备工艺复杂、成本高的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，向待固定的酶中加入PEI，然后加入无官能团修饰的Fe

进一步地，PEI的分子量为600～70000Da；优选的，PEI的pH值在8～11之间；优选的，PEI的浓度(质量浓度)在0.5％～2.5％之间。

进一步地，Fe

进一步地，蛋白沉淀剂为无水乙醇、丙酮、乙腈、硫酸铵或聚乙二醇；优选的，聚乙二醇的分子量为2～8KDa；优选的，聚乙二醇的浓度(质量浓度)为20％～50％，更优选为30％。

进一步地，以待固定的酶的酶液体积计，蛋白沉淀剂为2～8倍体积无水的乙醇、2～8倍体积的丙酮、2～8倍体积的乙腈和终浓度(质量浓度)为40％～80％的硫酸铵；优选的，蛋白沉淀剂为7倍体积的无水乙醇、5倍体积的丙酮、3倍体积的乙腈，或终浓度为60％的硫酸铵。

进一步地，交联剂为1％～10％的戊二醛、乙二醛、硼酸、三氯聚氰、京尼平、环氧氯丙烷或缩水甘油醚类交联剂。

进一步地，S1的反应温度为2～8℃；S2的反应温度为2～8℃；S3的反应温度为2～8℃；优选的，S3的产物用纯化水清洗，用磁铁分离得到磁性交联酶聚集体。

根据本发明的另一方面，提供了一种固定化酶。该固定化酶通过上述任一种制备方法制备得到。

进一步地，固定化酶为转氨酶、嘧啶核苷磷酸化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、酮还原酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶或环己酮单加氧酶的固定化酶；优选的，固定化酶为Aspergillus fumigatus来源的转氨酶、Thermus thermophiles来源的嘧啶核苷磷酸化酶、Geobacillus stearothermophilus来源的嘌呤核苷磷酸化酶、Acetobacter sp.CCTCCM209061来源的酮还原酶、Saccharomyces cerevisiae来源的烯还原酶、Streptomyces sp.来源的亚胺还原酶、Bacillus cereus来源的氨基酸脱氢酶或Brachymonaspetroleovorans来源的环己酮单加氧酶的固定化酶。

根据本发明的再一方面，提供了一种上述固定化酶在水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系中的应用。

应用本发明的技术方案，采用无官能团修饰的四氧化三铁作为磁性载体添加到游离酶中，引入聚乙烯亚胺直接通过机械搅拌方式包覆磁性颗粒与蛋白，再以蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，以交联剂进行交联，制备磁性交联酶聚集体，具有结构性质稳定，粒径分布均匀，磁性好的优点，而且对于制备工艺来说，制备简单、生产成本低、工艺重现性好、可操作性强、放大生产简单等。且此磁性交联酶应用于转氨酶与核苷磷酸化酶等反应中，具有活力回收高，重复使用稳定性好的优点，对于有机溶剂的耐受性能也比普通交联酶强，也解决了对于非均相反应体系中酶的分离问题。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

针对现有技术中磁性交联酶聚集体制备工艺复杂、成本高的技术问题，本申请提出了下列技术方案。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种固定化酶的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，向待固定的酶中加入PEI(聚乙烯亚胺)，然后加入无官能团修饰的Fe

在本发明中，采用无官能团修饰的四氧化三铁作为磁性载体添加到游离酶中，引入聚乙烯亚胺直接通过机械搅拌方式包覆磁性颗粒与蛋白，再以蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，以交联剂进行交联，制备磁性交联酶聚集体，制备方法简化，且提高了磁性交联酶的活性和稳定性。

其中，高度支化的聚乙烯亚胺(PEI)拥有高密度表面氨基，可以被用来稳定Fe

本申请中，PEI的分子量可以为600Da～70000Da，即在600Da～70000Da之间均可，例如600Da、700Da、800Da、900Da、1000Da、1100Da、1120Da、1200Da、1300Da、1400Da、1500Da、1600Da、1700Da、1800Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da、7000Da、8000Da、9000Da、10000Da、20000Da、30000Da、40000Da、50000Da、60000Da、70000Da等等均可；PEI的pH值在8～11之间，例如pH为8、9、10或11等；PEI的浓度在0.5％～2.5％之间，例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.7％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.4％、2.5％等等。

为了能够使聚乙烯亚胺很好的包覆Fe

在本申请一实施方式中，蛋白沉淀剂可以为本领域常规的蛋白沉淀剂，优选的，本申请中采用的蛋白沉淀剂为无水乙醇、丙酮、乙腈、硫酸铵或聚乙二醇；更优选的，聚乙二醇的分子量为2～8KD，聚乙二醇的浓度为20％～50％，进一步优选为30％。

在本申请一优选的实施例中，以待固定的酶的酶液体积计，蛋白沉淀剂为2～8倍体积无水的乙醇、2～8倍体积的丙酮、2～8倍体积的乙腈和终浓度为40～80％的硫酸铵；更优选的，蛋白沉淀剂为7倍体积的无水乙醇、5倍体积的丙酮、3倍体积的乙腈，或终浓度为60％的硫酸铵。

根据本申请一典型的实施方式，交联剂为1％～10％的戊二醛、乙二醛、硼酸、三氯聚氰、京尼平、环氧氯丙烷或缩水甘油醚类交联剂。

根据本申请一典型的实施方式，S1的反应温度为2～8℃；S2的反应温度为2～8℃；S3的反应温度为2～8℃；优选的，S3的产物用纯化水清洗，用磁铁分离得到磁性交联酶聚集体。

根据本申请一优选的实施方式，磁性交联酶聚集体的制备方法包括：酶液中缓慢滴加终浓度为0.5％～2.5％的PEI溶液，PEI的分子量为600Da、1800Da、10KDa或70KDa，PEI的pH值为8～11，搅拌10min，使其混合均匀。再加入2％～10％的Fe

此方法应用于转氨酶、核苷磷酸化酶、酮还原酶等，均表现出优良的活性与重复使用稳定性，应用于转氨酶转化率＞90％，可重复使用5次以上，应用于核苷磷酸化酶，活力回收高于普通交联酶，重复使用4次以上，转化率无降低趋势，应用于其他酶，依然可以表现其优势。

根据本申请一的实施方式，提供一种固定化酶。该固定化酶通过上述任一种制备方法制备得到。

其中，固定化酶为转氨酶、嘧啶核苷磷酸化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、酮还原酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶或环己酮单加氧酶的固定化酶；优选的，固定化酶为Aspergillus fumigatus来源的转氨酶、Thermus thermophiles来源的嘧啶核苷磷酸化酶、Geobacillus stearothermophilus来源的嘌呤核苷磷酸化酶、Acetobacter sp.CCTCCM209061来源的酮还原酶、Saccharomyces cerevisiae来源的烯还原酶、Streptomyces sp.来源的亚胺还原酶、Bacillus cereus来源的氨基酸脱氢酶或Brachymonaspetroleovorans来源的环己酮单加氧酶的固定化酶。

根据本申请一的实施方式，提供一种上述固定化酶在水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系中的应用。

以下将结合实施例进一步说明本申请的有益效果。

下列实施例中的PB代表磷酸缓冲液。

以表1中的酶制备的磁性交联酶

表1:实施例中用到的酶及其来源

实施例1：转氨酶磁性交联酶制备

m-CLEAs制备方法：在机械搅拌且冰浴条件下，10mL转氨酶酶液(见表2)中加入50mg磷酸吡哆醛，冰浴搅拌30min。之后缓慢滴加终浓度为0.5％的PEI(70KDa，pH 11.0，5％水溶液)，搅拌10min，使其混合均匀，再缓慢加入2％(0.2g)Fe

CLEAs制备方法：在机械搅拌且冰浴条件下，10mL转氨酶酶液中加入50mg磷酸吡哆醛，冰浴搅拌30min。之后缓慢加入6g硫酸铵(终浓度60％)，进行蛋白的沉淀，搅拌1h。之后再向此体系中缓慢滴加终浓度为2％的戊二醛，搅拌1h。过滤，滤饼用纯化水清洗2次，过30目筛板。按照收率折合游离酶的质量比投反应。投反应方法同磁性交联酶的方法。

磁性交联转氨酶活性及重复使用性测试结果如表2：

表2：

实施例2：核苷磷酸化酶磁性交联酶制备

此反应中共有两个核苷磷酸化酶的参与，包括嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)与嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，两种酶均采用以下相同的磁性交联酶制备方法。

在机械搅拌且冰浴条件下，10mL核苷磷酸化酶酶液中缓慢滴加终浓度为0.5％的PEI(600Da，pH 8.0，5％水溶液)，搅拌10min，使其混合均匀，再缓慢加入5％(0.5g)Fe

磁性交联核苷磷酸化酶活性及重复使用性测试结果如表3：

表3：

实施例3：酮还原酶(KRED)磁性交联酶制备

在机械搅拌且冰浴条件下，10mL酮还原酶酶液中缓慢滴加终浓度为2.5％的PEI(10KDa，pH 9.0，5％水溶液)，搅拌10min，使其混合均匀，再缓慢加入10％(1g)Fe

磁性交联酮还原酶活性及重复使用性测试结果如表4：

表4：

实施例4：烯还原酶(ERED)磁性交联酶制备

在机械搅拌且冰浴条件下，向10mL烯还原酶酶液中缓慢滴加终浓度为2％的PEI(1.8KDa，pH＝10，5％水溶液)，搅拌10min，使其混合均匀，再缓慢加入4％(0.4g)Fe

磁性交联烯还原酶活性及重复使用性测试结果如表5：

表5：

实施例5：亚胺还原酶(IRED)磁性交联酶制备

在机械搅拌且冰浴条件下，向10mL亚胺还原酶酶液中缓慢滴加终浓度为0.5％的PEI(70KDa，pH＝11，5％水溶液)，搅拌10min，使其混合均匀，再缓慢加入5％(0.5g)Fe

磁性交联亚胺还原酶活性及重复使用性测试结果如表6：

表6：

实施例6：氨基酸脱氢酶(AADH)磁性交联酶制备

在机械搅拌且冰浴条件下，向10mL氨基酸脱氢酶酶液中缓慢滴加终浓度为0.5％的PEI(70KDa，pH＝11，5％水溶液)，搅拌10min，使其混合均匀，再缓慢加入5％(0.5g)Fe

磁性交联氨基酸脱氢酶活性及重复使用性测试结果如表7：

表7：

实施例7：单加氧酶(CHMO)磁性交联酶制备

制备方法同实施例6(交联剂改为终浓度1％的戊二醛)。

磁性交联单加氧酶活性及重复使用性测试结果如表8：

表8：

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：采用无官能团修饰的四氧化三铁作为磁性载体添加到游离酶中，引入聚乙烯亚胺直接通过机械搅拌方式包覆磁性颗粒与蛋白，再以蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，以交联剂进行交联，制备磁性交联酶聚集体，具有结构性质稳定，粒径分布均匀，磁性好的优点，而且对于制备工艺来说，制备简单、生产成本低、工艺重现性好、可操作性强、放大生产简单等。且此磁性交联酶应用于转氨酶与核苷磷酸化酶等反应中，具有活力回收高，重复使用稳定性好的优点，对于有机溶剂的耐受性能也比普通交联酶强，也解决了对于非均相反应体系中酶的分离问题。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。