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新的丝氨酸蛋白酶变体

文献发布时间：2023-06-19 18:32:25

技术领域

本申请涉及新的丝氨酸蛋白酶变体。

背景技术

蛋白酶参与各种功能，例如生物体内的消化、吸收和防御，并且根据活性位点的结构分为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。在这些酶中，丝氨酸蛋白酶(或丝氨酸内肽酶)的特征在于在它们的活性位点中共同地具有切割蛋白中肽键的活性丝氨酸残基，其中丝氨酸在蛋白酶的活性位点作为亲核氨基酸(Hedstrom,2002.Chem Rev 102:4501-4524)。

丝氨酸蛋白酶已经在多种应用中使用。除了治疗人类疾病(例如，溶解血凝块)的治疗应用之外，丝氨酸蛋白酶不仅用作洗衣除垢剂和隐形眼镜清洁剂的组分，而且还用于乳蛋白的改性、蚕丝脱胶、皮革浸泡、脱毛、寡肽的合成、从肺X射线胶片中回收银、饲料和食品的生产和改进等(韩国专利公开号10-2005-0068750)。

发明内容

技术问题

本领域需要开发具有改进的热稳定性、增加的活性等的丝氨酸蛋白酶，以获得更高的工业成本效益和效率。

技术方案

本申请的一个目的是提供丝氨酸蛋白酶变体。

本申请的另一个目的是提供编码丝氨酸蛋白酶变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体。

本申请的另一个目的是提供包含丝氨酸蛋白酶变体、编码丝氨酸蛋白酶变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体中的至少一者的微生物。

本申请的另一个目的是提供包含丝氨酸蛋白酶变体和表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物中的至少一者的饲料组合物。

有益效果

与现有的丝氨酸蛋白酶相比，本申请的丝氨酸蛋白酶变体具有优异的活性，因此可以在工业上使用。

附图简要说明

图1展示了来源于Thermobifida fusca的丝氨酸蛋白酶变体的三级结构中引入突变的残基位置。

发明详细描述

下文详细描述本申请的内容。同时，在本申请中公开的每处描述和实施方案可以在本文应用于不同的描述和实施方案。换言之，本申请中公开的各种组分的所有组合都包括在本申请的范围内。此外，本申请的范围不应受下文提供的描述的限制。

此外，本领域普通技术人员可以认识到或能够使用不超过常规实验来确认本申请的具体实施方案的多种等同方案。这种等同方案旨在包含在本申请的范围内。

本申请的一个方面提供了丝氨酸蛋白酶变体。

本文所用术语“丝氨酸蛋白酶”是指属于蛋白酶亚组并具有蛋白水解活性的酶。具体而言，丝氨酸蛋白酶可以是通过水解肽键而降解蛋白并且基本上在其活性位点具有活性丝氨酸残基的酶，并且更具体而言，是具有组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的氨基酸残基的空间排列(可以被称为催化三联体)的酶，但不限于此。

根据本申请的丝氨酸蛋白酶可以来源于Thermobifida属，拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)属，Actinorugispora属或Spinactinospora属的微生物，但不限于此。具体而言，在本申请中，野生型丝氨酸蛋白酶可以是来源于以下的丝氨酸蛋白酶：Thermobifidafusca,Thermobifida celulosilytica,Thermobifida halotolerans,Actinorugisporaendohytica,Spinactinospora alkalitolerans,堆肥拟诺卡氏菌(Nocardiopsiscomposta)或Nocardiopsis potens，但不限于此。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶可以是多肽，其包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列组成，但不限于此。在一个实施方案中，SEQ ID NO:31的氨基酸序列可以是来源于SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但不限于此。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶可以包括SEQ ID NO:49至54中任一氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:49至54中任一氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:49至54中任一氨基酸序列组成，但不限于此。在一个实施方案中，SEQ ID NO:49至54的氨基酸序列可以来源于SEQ ID NO:67至72中任一氨基酸序列，但不限于此。

本申请的丝氨酸蛋白酶可以包括与上文描述的氨基酸序列具有相同活性的任何序列，但不限于此。此外，丝氨酸蛋白酶可以包含下述序列，或基本上由下述序列组成，或由下述序列组成：SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列或与SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列具有至少60％同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体而言，氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:31和49至54所示的氨基酸序列中的任一个或与SEQ ID NO:31和49至54所示的氨基酸序列中的任一个具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的的同源性或同一性的氨基酸序列。另外，能够清楚理解的是，对于在部分序列内具有包括缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白而言，只要该氨基酸序列具有上述同源性或同一性以及与蛋白的效果等同的效果，其落入本申请的范围内。

换言之，尽管在本申请中使用的表述是“具有预定的SEQ ID NO：所示的氨基酸序列的蛋白或多肽”和“包含预定的SEQ ID NO：所示的氨基酸序列的蛋白或多肽”，但是能清楚判断的是，在本申请中也可以使用具有在部分序列中包括缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白，只要该蛋白具有与由相应氨基酸序列组成的多肽相同或等同的活性。例如，“包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的多肽”显然属于“由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成的多肽”，只要前者具有与后者相同或等同的活性。

本文所用术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性程度，并且可以显示为百分比。术语同源性和同一性可以互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以一起使用由要使用的程序建立的默认缺口罚分。基本上，同源或相同的序列通常可以沿着整个序列或整个序列的至少约50％、60％、70％、80％或90％在中等或高度严格条件下彼此杂交。在杂交中，也考虑含有简并密码子代替密码子的多核苷酸。

任何两个给定多核苷酸或多肽之间的序列同源性、相似性或同一性可以使用已知的计算机算法，如“FASTA”程序，通过使用Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的默认参数来确定。或者，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)，其在欧洲分子生物学开放软件套件(EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))包的Needleman程序中进行(Rice etal.,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0版或其后的版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.,et al.,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994和CARILLO et al.(1988)SIAM JApplied Math 48:1073)。例如，可以使用来自国家生物技术信息中心数据库(NationalCenter for Biotechnology Information database)的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如GAP计算机程序比较序列信息来确定，例如Needleman et al.,(1970),J Mol Biol.48:443，如Smith andWaterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482所公开的程序。简言之，GAP程序将相似性定义为通过将相似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短序列中符号的总数而获得的值。用于GAP程序的默认参数可以包括：(1)二进制比较矩阵(包含相同的值1和不相同的值0)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，公开于Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,NationalBiomedical Research Foundation,pp.353–358(1979)(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)；(2)每个缺口的罚分为3.0，并且每个缺口中的每个符号的额外的0.10罚分(或缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5)；(3)端部缺口无罚分。

此外，任何两个给定的多核苷酸或多肽之间的序列同源性、相似性或同一性可以通过在限定的严格条件下、通过Southern杂交测试比较它们的序列来确认，并且限定的适当杂交条件在本申请的范围内并且可以通过本领域普通技术人员熟知的方法来确定。

在上文描述的具有丝氨酸蛋白酶的蛋白的一个实施方案中，本申请中提供的丝氨酸蛋白酶变体可以指这样的变体：在该变体中，在具体位置上的氨基酸被取代，从而与突变前的蛋白相比具有超过100％的酶活性。

在一个具体的实施方案中，本申请提供的变体可以具有与包括SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列的野生型酶相比，超过100％的酶活性，特别是约110％，约120％，约130％，约140％，约150％，约160％，约170％，约180％，约190％，或约200％或更高的增加的酶活性，但不限于此。

术语“约”是包括所有±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围，并且包括在等于或类似于术语“约”之后的数值的范围内的所有数值，但不限于此。

本文所用术语“变体”是指通过保守取代和/或修饰所述序列的至少一个不同氨基酸、同时保留蛋白质的功能或特性而获得的多肽。由于数个氨基酸的取代、缺失或添加，变体具有与所鉴定的序列不同的氨基酸序列。这种变体通常可以通过修饰上述多肽序列之一并评价修饰的多肽的性质来鉴定。也就是说，相对于天然蛋白，变体的能力可以增强、不改变或减弱。

此外，一些变体可以包括其中至少一部分(如N末端前导序列或跨膜结构域)被去除的变体。其它变体可以包括从成熟蛋白的N末端和/或C末端去除一部分或向成熟蛋白的N末端和/或C末端添加一部分的变体。

术语“变体”也可以与其它术语互换使用，例如修饰/突变的蛋白质，修饰，修饰的多肽，突变体，突变蛋白和发散体(divergent)，并且也可以使用用于指示变异的任何术语，对此没有限制。

与天然野生型或未修饰的蛋白质相比，变体可具有增强的活性，但不限于此。

本文所用的术语“保守型取代”是指一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代。例如，变体可以具有一个或多个保守型取代，同时仍然保留一项或多项生物活性。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性而发生。例如，在具有侧链的带电氨基酸中，带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸，带负电的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；在具有侧链的不带电荷的氨基酸中，非极性氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和脯氨酸，极性或亲水性氨基酸包括丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺；在氨基酸中，芳香氨基酸包括苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。变体还可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，以共翻译的方式或翻译后方式，多肽可以与参与蛋白质转移的蛋白质的N末端的信号(或前导)序列缀合。所述多肽也可以与不同的序列或接头缀合，以鉴定、纯化或合成多肽。

本文所用术语“丝氨酸蛋白酶变体”是指包括在具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的取代的多肽。

根据本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括在对应于SEQ ID NO:31的氨基酸序列自N末端起的第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代。具体而言，丝氨酸蛋白酶变体可以包括对应于SEQ ID NO:31的第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的氨基酸的取代，并且可以包括与SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列具有至少60％且小于100％同源性或同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括在对应于SEQ ID NO:31的第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸的取代，并且可以与SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列具有至少60％且具有小于100％(例如，61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％。71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)的同源性或同一性，但不限于此。

同时，由于SEQ ID NO:31的自N末端起的第12位氨基酸和第116位氨基酸对应于SEQ ID NO:49至54的自N末端起的第12位氨基酸和第116位氨基酸，因此对基于SEQ ID NO:31的氨基酸的位置的描述同样可应用于SEQ ID NO:49至54中任一氨基酸序列的第12位氨基酸和第116位氨基酸。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括在对应于SEQ ID NO:54的第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸的取代，并且可以包括与SEQ IDNO:52至54中任一氨基酸序列具有至少60％且小于100％(例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)的同源性或同一性的氨基酸序列。具体而言，丝氨酸蛋白酶变体可以包括在对应于SEQ ID NO:54的第12位氨基酸的位置上的氨基酸的取代，并且可以与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少60％且小于100％(例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％。75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)的同源性或同一性，但不限于此。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以是这样的蛋白：SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列中的自N末端起的第12位，第116位，或第12和116位相对应的氨基酸全部被其它氨基酸取代。“其它氨基酸”是指与取代前的氨基酸不同的氨基酸，并且不受限制，只要它们是取代前的氨基酸以外的氨基酸即可。

在一个实施方案中，根据本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以是这样的变体：SEQ IDNO:31和49至51中任一氨基酸序列中第12位的苯丙氨酸被甘氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，色氨酸、缬氨酸，甲硫氨酸或苏氨酸取代；和/或第116位的天冬酰胺被甘氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸或苏氨酸取代，但不限于此。

在一个实施方案中，根据本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以是这样的变体：SEQ IDNO:52至54中任一氨基酸序列中第12位的脯氨酸被苯丙氨酸，甘氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，丝氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，色氨酸、缬氨酸，甲硫氨酸或苏氨酸取代；和/或第116位的天冬酰胺被甘氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸或苏氨酸取代，但不限于此。

具体而言，变体可以是这样的蛋白：对应于SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列中的第12位的氨基酸被酪氨酸(Y)，丝氨酸(S)，丙氨酸(A)或精氨酸(R)取代；对应于第116位的氨基酸被天冬氨酸(D)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)或甘氨酸(G)取代；或者SEQ ID NO:31的氨基酸序列中第12和116位的氨基酸分别被酪氨酸(Y)和天冬氨酸(D)，酪氨酸(Y)和丝氨酸(S)，丝氨酸(S)和天冬氨酸(D)，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，或丙氨酸(A)和甘氨酸(G)取代，但不限于此。在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶变体可以是这样的变体：SEQ ID NO:52至54中任一氨基酸序列中的第12位的脯氨酸被酪氨酸、丙氨酸、丝氨酸或精氨酸取代，但不限于此。

能够清楚理解的是，SEQ ID NO:31和49-54中任一氨基酸序列中的第12位和/或第116位氨基酸被其它氨基酸取代的变体包括其中对应于所述位置的氨基酸被其它氨基酸取代的变体。

另外，变体还包括这样的变体：对应于SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列的自N末端起的第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被上述选自SEQ IDNO:31和49至54中任一氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:31和49至54的任一氨基酸序列具有至少60％(60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％,88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)同源性或同一性的氨基酸序列中的其它氨基酸取代。

在变体的一个实施方案中，SEQ ID NO:31的氨基酸序列中对应于第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代的变体可以包含SEQ ID NO:32至39中任一氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:32至39中任一氨基酸序列组成，或由SEQ IDNO:32至39中任一氨基酸序列组成，但不限于此。

在变体的一个实施方案中，SEQ ID NO:49的氨基酸序列中对应于第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代的变体可以包含SEQ ID NO:55或56的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:55或56的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:55或56的氨基酸序列组成，但不限于此。

在变体的一个实施方案中，SEQ ID NO:50的氨基酸序列中对应于第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代的变体可以包含SEQ ID NO:57或58的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:57或58的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:57或58的氨基酸序列组成，但不限于此。

在变体的一个实施方案中，SEQ ID NO:51的氨基酸序列中对应于第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代的变体可以包含SEQ ID NO:59或60的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:59或60的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:59或60的氨基酸序列组成，但不限于此。

在变体的一个实施方案中，SEQ ID NO:52的氨基酸序列中对应于第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代的变体可以包含SEQ ID NO:61或62的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:61或62的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:61或62的氨基酸序列组成，但不限于此。

在变体的一个实施方案中，SEQ ID NO:53的氨基酸序列中对应于第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代的变体可以包含SEQ ID NO:63或64的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:63或64的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:63或64的氨基酸序列组成，但不限于此。

在变体的一个实施方案中，SEQ ID NO:54的氨基酸序列中对应于第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代的变体可以包含SEQ ID NO:65或66的氨基酸序列，基本上由SEQ ID NO:65或66的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:65或66的氨基酸序列组成，但不限于此。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括对应于SEQ ID NO:31和49至54中任一氨基酸序列的第12位和/或第116位的位置被其它氨基酸取代；可以与SEQ IDNO:31和49至54中任一氨基酸序列具有60％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％。91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％，或99％或更多，且小于100％的序列同源性；并且可以具有丝氨酸蛋白酶活性。

本申请的丝氨酸蛋白酶变体与修饰前的多肽、天然野生型多肽或未修饰的多肽相比，可具有增强的活性，但不限于此。此外能够清楚理解的是，在部分氨基酸序列具有缺失、修饰、取代和添加的氨基酸序列的任何蛋白质都在本申请的范围内，只要该蛋白质具有上述同源性以及与所述蛋白等同的效果。

此外能够清楚理解的是，除了在第12位氨基酸和/或第116位氨基酸中的突变或在其相应位置的突变之外，在相应的SEQ ID NO的氨基酸序列的正向或反向中添加无义序列、或具有天然存在的突变、或具有沉默突变的任何变体不被排除在本申请的范围之外，只要该变体具有与根据本申请的变体相同或等同的活性，也包括在本申请的范围内。

同时，NCBI参考序列WP_016188200.1(SEQ ID NO:40)的成熟区对应于本申请的SEQ ID NO:31的氨基酸序列，并且SEQ ID NO:40除信号肽之外的序列对应于本申请的SEQID NO:2。

如上所述能够清楚理解的是，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括对丝氨酸蛋白酶的性质和二级结构具有很小影响的氨基酸的缺失或添加，其中在对应于SEQ ID NO:31的第12位和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被不同的氨基酸取代。此外，通过本领域公知的序列比对，本领域技术人员能够清楚理解的是，本申请的SEQ ID NO：31的自N末端的第12位和第116位对应于SEQ ID NO：40的第193位和第297位以及SEQ ID NO：2的第163位和第267位，并且SEQ ID NO：31包括在SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：2中。

因此，关于各自包括SEQ ID NO：31的氨基酸序列的SEQ ID NO：2和40的氨基酸序列，本申请的丝氨酸蛋白酶变体包括这样的变体：在所述变体中，对应于SEQ ID NO：31的第12位和第116位的氨基酸(SEQ ID NO：2中的第163位和/或第267位氨基酸以及SEQ ID NO：40中的第193位和/或第297位氨基酸)的位置处的氨基酸各自被取代。另外，上文关于SEQID NO:31及第12位和第116位氨基酸给出的描述也适用于SEQ ID NO:2及其第163位和第267位氨基酸和SEQ ID NO:40及其第193位和第297位氨基酸。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括这样的氨基酸序列：在对应于SEQ ID NO:31的第12位和第116位的位置处的氨基酸被其它氨基酸取代，并且可以与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％(例如60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)的序列同源性。在另一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括SEQ ID NO:2的第163位氨基酸和/或第266位氨基酸被其它氨基酸取代，并且可以与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同源性，并且可以与SEQ ID NO:3至10中任一氨基酸序列具有至少60％的序列同源性，但不限于此。

同时能够清楚理解的是，在包括SEQ ID NO:49至54中任一氨基酸序列的多肽中包括对应于SEQ ID NO:49至54的自N末端起的第12位和/或第116位的氨基酸的取代的变体也包括在本申请的丝氨酸蛋白酶的范围内。

包含SEQ ID NO:49至54中任一氨基酸序列的多肽的序列可以是，例如，在GenBank登录号KUP96625.1中描述的氨基酸序列(SEQ ID NO:67),NCBI参考序列WP_068687914.1(SEQ ID NO:68),NCBI参考序列WP_133739400.1(SEQ ID NO:69)，NCBI参考序列WP_179641868.1(SEQ ID NO:70),NCBI参考序列WP_184391208.1(SEQ ID NO:71),NCBI参考序列WP_017594871.1(SEQ ID NO:72)等。

本领域技术人员可以通过本领域已知的序列比对，鉴定对应于SEQ ID NO:67-72中SEQ ID NO:49-54的自N末端起的第12位和/或第116位的氨基酸，并应用SEQ ID NO:49-54的自N末端起的第12位和/或第116位的描述。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括用其它氨基酸取代对应于SEQ ID NO:49至54中任一氨基酸序列的自N末端起的第12位和/或第116位的氨基酸，并且可以与SEQ ID NO:67至72中任一氨基酸序列具有至少60％(例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)的同源性或同一性。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列中对应于第12位的氨基酸的取代，并且可以与SEQ ID NO:70至72任一项所示的氨基酸序列具有至少60％(例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)的同源性或同一性。作为一个实例，丝氨酸蛋白酶变体可以进一步包括SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列中对应于第116位的氨基酸的取代。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括对应于SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列第198位的氨基酸进行取代。变体可以与SEQ ID NO:67具有至少60％的同源性或同一性，例如60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。例如，变体可以包括氨基酸序列，其中在对应于SEQ ID NO:49的第12位氨基酸的位置上的氨基酸被另一个氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:49具有至少70％的序列同一性。作为实例，丝氨酸蛋白酶变体可以进一步包括对应于SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的第302位的氨基酸进行取代。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括对应于SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的第178位的氨基酸进行取代。变体可以与SEQ ID NO:68具有至少60％的同源性或同一性，例如60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。例如，变体可以包括氨基酸序列，其中在对应于SEQ ID NO:50的第12位氨基酸的位置上的氨基酸被另一个氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:50具有至少70％的序列同一性。作为实例，丝氨酸蛋白酶变体可以进一步包括对应于SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的第282位的氨基酸进行取代。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括对应于SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的第207位的氨基酸进行取代。变体可以与SEQ ID NO:69具有至少60％的同源性或同一性，例如60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％。84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。例如，变体可以包括氨基酸序列，其中在对应于SEQ ID NO:51的第12位氨基酸的位置上的氨基酸被另一个氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:51具有至少70％的序列同一性。作为实例，丝氨酸蛋白酶变体可以进一步包括对应于SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列的第311位的氨基酸进行取代。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括对应于SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的第203位的氨基酸进行取代。变体可以与SEQ ID NO:70具有至少60％的同源性或同一性，例如60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。例如，变体可以包括氨基酸序列，其中在对应于SEQ ID NO:52的第12位氨基酸的位置上的氨基酸被另一个氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:52具有至少70％的序列同一性。作为实例，丝氨酸蛋白酶变体可以进一步包括对应于SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列的第303位的氨基酸进行取代。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括对应于SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的第201位的氨基酸进行取代。变体可以与SEQ ID NO:71具有至少60％的同源性或同一性，例如60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。例如，变体可以包括氨基酸序列，其中在对应于SEQ ID NO:53的第12位氨基酸的位置上的氨基酸被另一个氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:53具有至少70％的序列同一性。作为实例，丝氨酸蛋白酶变体可以进一步包括对应于SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的第304位的氨基酸进行取代。

在一个实施方案中，本申请的丝氨酸蛋白酶变体可以包括对应于SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的第201位的氨基酸进行取代。变体可以与SEQ ID NO:72具有至少60％的同源性或同一性，例如60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。例如，变体可以包括氨基酸序列，其中在对应于SEQ ID NO:54的第12位氨基酸的位置上的氨基酸被另一个氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:54具有至少70％的序列同一性。作为实例，丝氨酸蛋白酶变体可以进一步包括对应于SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的第304位的氨基酸进行取代。

然而，本申请的丝氨酸蛋白酶变体不限于上述那些。

本文所用术语“对应于”是指蛋白或多肽中所述位置处的氨基酸残基，或与蛋白或多肽中所述位置相似、相同或同源的氨基酸残基。鉴定对应位置的氨基酸可以是确定参考特定序列的序列的特定氨基酸。本文所用术语“对应区域”通常是指相关蛋白或参照蛋白中类似或对应的位置。例如，任何氨基酸序列可以与SEQ ID NO:31比对，并且基于此，氨基酸序列的每个氨基酸残基可以参考对应于SEQ ID NO:31的氨基酸残基的氨基酸残基的数字位置来编号。例如，序列比对算法(如本申请中描述的算法)可以鉴定氨基酸的位置或与查询序列(也称为“参考序列”)相比发生修饰(如取代、插入或缺失)的位置。

对于这种比对，可使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)，EMBOSS程序包(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276–277)的Needle程序等，但比对程序不限于此。可以通过多序列比对来鉴定对应的氨基酸残基。本领域已知的多序列比对程序的实例包括，MUSCLE(通过对数期望进行多序列比较；版本3.5或更高；Edgar,2004,Nucleic Acids Research 32:1792-1797)和MAFFT(6.857版或更高版本；Katoh and Kuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059–3066；Katoh et al.,2005,Nucleic AcidsResearch 33:511–518；Katoh and Toh,2007,Bioinformatics 23:372–374；Katoh etal.,2009,Methods in Molecular Biology 537:39–64；Katoh and Toh,2010,Bioinformatics 26:1899–1900)和EMBOSS EMMA，使用ClustalW(1.83或更高)；Thompsonet al.,1994,Nucleic Acids Research 22:4673–4680)，并且可以使用每个程序的基本参数，但是程序不限于此。

本申请的另一方面提供了编码丝氨酸蛋白酶变体的多核苷酸。

本文所用术语“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物，其中核苷酸单体通过共价键以长链形状彼此连接，并且通常是指具有一定或更长长度的DNA或RNA链，更具体而言，是指编码变体的多核苷酸片段。

编码本申请的丝氨酸蛋白酶变体的多核苷酸可以包括编码根据本申请的具有增强的活性的丝氨酸蛋白酶变体的任何多核苷酸序列，但不限于此。在一个实施方案中，编码本申请中的野生型丝氨酸蛋白酶的基因可以来源于Thermobifida属，拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)属，Actinorugispora属或Spinactinospora属的微生物，具体而言，可以来源于Thermobifida fusca,Thermobifida celulosilytica,Thermobifida halotolerans,Actinorugispora endohytica,Spinactinospora alkalitolerans,堆肥拟诺卡氏菌(Nocardiopsis composta)或Nocardiopsis potens，但不限于此。

在不改变氨基酸序列的范围内，本申请的多核苷酸可以包括在多肽的氨基酸序列中的编码区中进行的各种修饰，这是由于密码子简并性或考虑了多肽将表达于的活生物体的偏好密码子。具体而言，可以包括编码变体的任何多核苷酸序列，在变体中，在对应于SEQID NO:31和49至54的任一氨基酸序列的自N末端的第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其他氨基酸取代，但不限于此。

例如，本申请的多核苷酸可以是编码本申请的变体的多核苷酸序列，具体而言，变体是由SEQ ID NO:32至39和55至66中任一氨基酸序列组成的多肽，或者与所述多肽具有一定同源性的多肽，但不限于此。

在一个实施方案中，编码由SEQ ID NO:32至39中任一氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸序列可以由SEQ ID NO:41至48中任一多核苷酸序列组成，但不限于此。

如上文所述，本申请的丝氨酸蛋白酶变体包括这样的变体，其中在包含SEQ IDNO:31和49至54中任一氨基酸序列的多肽中，对应于序列第12位和/或第116位的位置的氨基酸被取代，因此能够清楚理解的是，编码这种丝氨酸蛋白酶变体的多核苷酸序列也包括在本申请的范围内。

作为实例，在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:40中，在对应于SEQ ID NO:31的第12位和第116位的位置上的氨基酸(SEQ ID NO:2的第163位氨基酸和/或第267位氨基酸以及SEQID NO:40的第193位氨基酸和/或第297位氨基酸)被取代的变体也包括在本申请的丝氨酸蛋白酶的范围内。因此，编码这些变体的多核苷酸序列也包括在本申请的范围内。例如，编码丝氨酸蛋白酶变体的多核苷酸序列可以是编码SEQ ID NO:3-10中任一氨基酸序列的序列，具体而言，是由SEQ ID NO:23-30中任一多核苷酸序列组成的序列，但不限于此。

另外，可以包括编码具有变体活性的蛋白质的任何序列，其中在严格条件下，通过与可以由已知基因序列(例如，与核苷酸序列的全部或部分互补的序列)制备的探针杂交，在所述变体中SEQ ID NO:31和49至54中任一个的自N末端起的对应于第12位氨基酸和/或第116位氨基酸的位置上的氨基酸被其它氨基酸取代，但不限于此。

术语“严格条件”是指能够在多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这样的条件具体公开于文献中。例如，严格条件可以包括如下所述的条件，具有高同源性的基因(至少40％、特别是至少90％、更特别是至少95％、还更特别是至少97％、并且甚至还更特别是至少99％的同源性的基因)实现杂交，但具有比上述同源性更低的同源性的基因不实现杂交的条件；或者用于Southern杂交的典型洗涤条件，即，洗涤在对应于60℃、1×SSC和0.1％SDS，特别是60℃、0.1×SSC和0.1％ SDS，更特别是68℃、0.1×SSC和0.1％ SDS的盐浓度和温度下进行一次，特别是两次或三次。然而，严格条件不限于此，而是可以由本领域技术人员根据其目的适当地调节。

杂交需要两个核苷酸具有互补序列，但是根据杂交严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，在DNA中，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本申请不仅可以包括基本上相似的核苷酸序列，而且可以包括与整个序列互补的分离的多核苷酸片段。

具体而言，具有同源性的多核苷酸可以在55℃的Tm值下通过使用上述杂交条件来检测。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的适当地控制。

多核苷酸杂交的适当严格程度可以取决于多核苷酸的长度和互补程度，参数是本领域熟知的。

本申请的又一方面提供了包含编码本申请的丝氨酸蛋白酶变体的多核苷酸的载体。

本文所用术语“载体”是指含有编码目标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，所述编码目标蛋白的多核苷酸与适当的控制序列可操作地连接，以在适当的宿主细胞中表达目标多核苷酸。控制序列可以包括能够启动转录的启动子，用于控制转录的任何操纵子序列，编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列，和用于控制转录和翻译终止的序列。在转化入适当的宿主细胞后，载体可以独立于宿主的基因组复制或起作用，或者可以整合到基因组本身中。

本文所用术语“可操作地连接”是指编码本申请的目标蛋白的多核苷酸序列与启动和介导多核苷酸转录的启动子序列功能性连接。可操作的连接可以通过本领域已知的遗传重组技术制备，位点特异性DNA切割和连接可以使用本领域已知的限制酶、连接酶等制备，但不限于此。

本申请中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例可包括天然或重组形式的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌体载体或粘粒载体，并且基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL、基于pET、基于pUB110的载体可以用作质粒载体。具体而言，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC和pSM704等载体。可用于本申请的载体没有特别限制，而是可以使用任何已知的表达载体。

在一个实施方案中，使用用于细胞中染色体插入的载体，可以用突变的多核苷酸取代编码染色体中的变体目标的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。载体可以进一步包括选择标记，以确认染色体插入。选择标记用于选择被载体转化的细胞，即，确认是否插入目标核酸分子。选择标记的实例可以包括提供选择性表型的标记，例如耐药性，营养缺陷型，对细胞毒性剂的抗性，或表面突变多肽的表达。在被选择性试剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞可以存活或显示不同的表型，因此可以选择被转化的细胞。

本申请的又一方面提供包含本申请的丝氨酸蛋白酶变体、编码所述变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体中的至少一者的宿主细胞。

特别地，宿主细胞可以是微生物。

包含丝氨酸蛋白酶变体、编码该变体的多核苷酸和包含该多核苷酸的载体中的至少一者的微生物可以特别是通过用包含编码变体的多核苷酸的载体转化而制备的微生物，但不限于此。

微生物可以是表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物。

本文所用术语“待表达/所表达/表达”蛋白质是指将目标蛋白引入微生物或在微生物中表达的状态。考虑到本申请的目的，“目标蛋白”可以是上述丝氨酸蛋白酶变体。

具体而言，术语“引入蛋白质”可以指在最初不具有具蛋白质的微生物中表现出该具体蛋白质的活性，或者与该蛋白质的内源性活性或修饰前的活性相比，表现出该蛋白质的增强活性。例如，蛋白质的引入可以指将编码具体蛋白质的多核苷酸引入微生物的染色体，或将包含编码具体蛋白质的多核苷酸的载体引入微生物，从而显示蛋白质的活性。

微生物可以是重组微生物。重组可以通过遗传修饰(如转化)来实现。

本文所用术语“转化”是指将含有编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，以允许所述多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达的过程。无论被转化的多核苷酸是插入宿主细胞的染色体中的形式还是位于染色体外的形式，两种形式的被转化的多核苷酸都属于本申请的范围内，只要被转化的多核苷酸在宿主细胞中表达。此外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入宿主细胞，只要多核苷酸被引入宿主细胞中并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是含有自身复制所需的所有必需元件的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子，转录终止信号，核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体。另外，多核苷酸可以以其原始形式被引入到宿主细胞中，并且可操作地连接到在宿主细胞中表达所需的序列，而不限于此。用于转化的方法包括用于将多核苷酸引入细胞的任何方法，并且可以通过本领域已知的合适的标准技术进行。例如，转化方法包括电穿孔法、磷酸钙(Ca(H

重组微生物可以是本申请的丝氨酸蛋白酶的活性得到增强的微生物。

“活性增强”可以指微生物的具体蛋白质的活性与内源性活性或修饰前的活性相比得到增强。术语“内源活性”可以指当微生物由天然或人工因素引起的遗传突变转化时，转化前微生物的亲本菌株所具有的具体蛋白质的活性。

具体而言，本申请中的蛋白质变体的活性的增强可以通过以下至少一种方法实现：增加编码蛋白质变体的基因的细胞内拷贝数的方法，将突变引入编码蛋白质变体的基因的表达控制序列的方法，用具有更强活性的序列替换编码蛋白质变体的基因的表达控制序列的方法，用编码蛋白变体的基因替换编码具有丝氨酸蛋白酶活性的野生型蛋白的染色体基因的方法，和进一步将突变引入编码蛋白变体的基因中，以增强蛋白变体的活性的方法，但不限于此。

接下来，通过缺失、插入、非保守取代、保守取代或上述方式的组合，在核酸序列中引入突变，以进一步增强表达控制序列的活性，或者通过用具有更强活性的核酸序列替换核酸序列，可以进行增加多核苷酸表达的表达控制序列的修饰，但不限于此。表达控制序列可以包括启动子、操纵子序列、核糖体结合位点编码序列、用于调节转录和翻译的序列等，但不限于此。

用于替换内源启动子的强启动子可以连接在多核苷酸表达单元的上游，但启动子不限于此。已知强启动子的实例可包括cj1至cj7启动子(US7662943B2),lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体PR启动子，P

此外，染色体上多核苷酸序列的修饰可以通过核酸序列的缺失、插入、非保守取代、保守取代或以上方式的组合在表达控制序列中引入突变，以进一步增强多核苷酸序列的活性，或者通过用修饰为具有更强活性的多核苷酸序列替换该序列而进行，但不限于此。

通常，蛋白质活性的引入和增强可以将对应蛋白质的活性或浓度从野生型或未修饰的微生物株中的活性或浓度增加1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％至最大1000％或2000％，但不限于此。

根据本申请的宿主细胞或微生物可以是通过包含本申请的多核苷酸或本申请的载体而表达丝氨酸蛋白酶变体的任何微生物。具体而言，宿主细胞或微生物的实例可包括属于埃希氏菌属(Escherichia)，沙雷氏菌属(Serratia)，欧文氏菌属(Erwinia)，肠细菌属(Enterobacteria)，普罗维登斯菌属(Providencia)，沙门氏菌属(Salmonela)，链霉菌属(Streptomyces)，假单胞菌属(Pseudomonas)，短杆菌属(Brevibacterium)，棒状杆菌属(Corynebacterium)或芽孢杆菌属(Bacilus等的微生物菌株，具体而言，宿主细胞或微生物可以是枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacilus amyloliquefaciens)，韦利茨芽孢杆菌(Bacilus velezensis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或米曲霉(Aspergilus oryzae)的菌株，更具体而言，可以是枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)，但不限于此。

本申请的又一方面提供了制备本申请的丝氨酸蛋白酶变体的方法。

制备本申请的变体的方法可以包括培养包含本申请的丝氨酸蛋白酶变体、编码所述变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体中的至少一者的微生物的步骤。

本文所用术语“培养”是指在适当调节的环境条件下使宿主细胞生长。本申请中的培养方法可以在本领域已知的适当培养条件下使用适当的培养基进行。本领域技术人员可以根据所选择的菌株容易地调节和使用这种培养方法。具体而言，培养可以是分批培养、连续培养和补料分批培养，但不限于此。

本文所用术语“培养基”是指培养宿主细胞所需的营养物作为主要成分混合并供给存活和生长必需的营养素和生长因子(包括水)的物质。具体而言，作为用于培养本申请的宿主细胞的培养基和其它培养条件，可以使用任何培养基而没有特别限制，只要其是用于培养宿主细胞的常规培养基，但是本申请的宿主细胞可以在有氧条件下、在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的常规培养基中培养，同时控制温度、pH等。

在一个实施方案中，制备本申请的变体的方法可以进一步包括回收在培养步骤中表达的本申请的变体的步骤。

在另一个实施方案中，可以使用本申请所属领域已知的方法回收在培养步骤中表达的变体。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收变体，所述常规方法包括但不限于收集，离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发或沉淀。

回收方法可以是使用本领域已知的合适方法收集变体，方法取决于本申请的宿主细胞的培养方法，例如分批、连续或补料分批培养方法。例如，可以使用离心、过滤、用结晶蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、提取、超声处理、超滤、透析、各种色谱(例如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱和亲和色谱)、HPLC，以及这些方法的组合，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或宿主细胞中回收变体。

在另一个实施方案中，可以不回收在培养步骤中由宿主细胞表达的变体。在该实施方案中，表达变体的宿主细胞本身可以用作变体的来源。

本申请的又一方面提供了包含本申请的丝氨酸蛋白酶变体和表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物中至少一者的饲料组合物。

包含在本申请变体的饲料组合物中的丝氨酸蛋白酶变体可以以这样的方式包含在饲料组合物中：表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物包含在饲料组合物中，或者可以是从表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物中分离并纯化的形式，但是本申请不限于此。

本文所用术语“饲料组合物”是指任何天然或人造食物、膳食等的任何制备物，或用于动物食用、摄入和消化或适合的膳食组分，并且饲料可以以本领域已知的各种形式制备。

饲料组合物可以是饲料添加剂。

饲料的类型没有特别限制，并且可以使用本领域中常用的饲料。饲料的非限制性实例可以包括：蔬菜饲料，例如谷物、根/果实、食品加工副产物、藻类、纤维、药物副产物、油和脂肪、淀粉、瓜类、以及谷物副产物；和动物饲料，例如蛋白质，无机材料，油和脂肪，矿物质，单细胞蛋白质，动物浮游生物或食品。这些饲料可以单独使用或至少两种组合使用。

本申请的饲料组合物可以进一步包括选自以下的至少一种：有机酸，例如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸和苹果酸；磷酸盐，例如磷酸钠，磷酸钾，酸式焦磷酸盐和多磷酸盐(聚合磷酸盐)；以及天然抗氧化剂，例如多酚，儿茶素，α-生育酚，迷迭香提取物，维生素C，绿茶提取物，甘草提取物，壳聚糖，鞣酸和植酸。

本申请的饲料组合物可以进一步包括选自以下的至少一种：辅助物质，例如氨基酸、矿物质、维生素、抗生素、抗菌物质、抗氧化剂、抗真菌剂和不同益生菌形式的微生物制剂；谷物，(例如，粉末或粉碎的小麦、燕麦、大麦、玉米和大米)；植物蛋白饲料，包括油菜、菜豆、向日葵为主要成分；动物蛋白饲料，例如血粉，肉粉，骨粉和鱼粉；糖和乳制品(例如，由各种类型的干奶粉和乳清粉形成的干组分；脂质(例如，活性成分，诸如通过加热液化的任何动物脂肪和植物油)；以及添加剂，例如营养补充剂，消化和吸收促进剂，生长促进剂和预防剂。

本申请的饲料组合物可以是干燥或液体制剂的形式，并且可以进一步包括用于饲料的赋形剂。用于饲料的赋形剂可以是，例如，沸石，玉米粉，米糠等，但不限于此。

除了丝氨酸蛋白酶变体之外，本申请的饲料组合物还可以包括酶制剂。例如，饲料组合物可进一步包括至少一种选自以下的酶：脂质降解酶，如脂肪酶，将植酸降解成磷酸盐和磷酸肌醇的植酸酶，催化淀粉、糖原等中含有的α-1,4-糖苷键水解的淀粉酶，催化有机磷酸酯水解的磷酸酶，催化麦芽糖生成两个葡萄糖分子的麦芽酶，以及催化蔗糖水解为葡萄糖-果糖混合物的转化酶。然而，本申请的饲料组合物不限于此。

本申请的饲料组合物可以单独施用于动物，或与包含在可食用载体中的其它饲料添加剂组合施用于动物。此外，饲料组合物可以作为饲料添加剂或追加饲料容易地施用，直接施用到家畜饲料中或与饲料分开施用，或在单独的口服制剂中施用或与其它成分组合施用。此外，每日剂量可通过如本领域中通常已知的每日一次剂量或每日多次剂量来使用。

施用本申请的饲料组合物的动物的实例可以包括家畜，例如肉牛、奶牛、小牛、猪、仔猪、绵羊、山羊、马、兔、狗和猫；和家禽，例如小鸡、母鸡、家鸡、公鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑和小禽，但不限于此。

包括在本申请的饲料组合物中的丝氨酸蛋白酶变体的量没有特别限制，并且可以根据目的适当地调节。在一个实施方案中，可以以适当的量包含丝氨酸蛋白酶变体，用于降解蛋白质源物质，同时在家畜的消化道中长期存有，如本申请所属领域中通常已知的，但丝氨酸蛋白酶变体的量不限于此。

本申请的又一方面提供了包含本申请的丝氨酸蛋白酶变体和表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物中的至少一种的食物组合物。丝氨酸蛋白酶变体可用于液体或固体食物组合物中。此外，食品可以是粉剂、丸剂、饮料、茶或普通食品的添加剂。

在一个实施方案中，食物可以是一组需要蛋白酶的食物，例如乳制品，用于改善肠运动和体重减轻的健康功能食物，和用于预防高血压的健康功能食物。

在另一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶变体可以作为食品增溶剂、食品软化剂和肉质改良剂包含在各种食品组合物中。在各种其它实施方案中，丝氨酸蛋白酶变体可以在麸质网络分解的步骤中加入到焙烤混合物中。或者，丝氨酸蛋白酶变体可用于催化食物蛋白(例如乳蛋白)的水解。或者，为了提供、制备调味剂，降低苦味，改变乳化性，产生生物活性肽，降低蛋白质中引起变态反应的抗原，丝氨酸蛋白酶变体可以包含在各种食品组合物中。然而，这仅仅是说明性的实施方案，丝氨酸蛋白酶变体的用途不限于此。

本申请的食物组合物中包含的丝氨酸蛋白酶变体的量可以由本领域技术人员根据目的适当地调节。

本申请的又一方面提供包含本申请的丝氨酸蛋白酶变体和表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物中的至少一种的除垢剂组合物。

本申请的除垢剂组合物可以是第一和第二水性除垢剂组合物、非水性液体除垢剂组合物、流延固体、粗粒、颗粒、压缩片剂、凝胶、糊剂或浆料的形式。除垢剂组合物可用于除去顽固的食物污渍、食物残渣膜和其它少量的食物组合物。

根据本申请的除垢剂组合物可以以用于清洁硬表面的除垢剂组合物，用于清洁织物的除垢剂组合物，用于洗碗的除垢剂组合物，用于口腔清洁的除垢剂组合物，用于清洁义齿的除垢剂或隐形眼镜清洁溶液的形式提供。然而，本申请的除垢剂组合物不限于此。

本申请的又一方面提供包含本申请的丝氨酸蛋白酶变体和表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物中的至少一种的药物组合物。

本申请的药物组合物可用作消化酶的药物组合物，以改善消化疾病、消化障碍和消化道手术后异常，直接施用于血凝块以溶解纤维蛋白的溶栓或抗血栓组合物，用作体内防御系统以去除炎性物质或坏死组织的抗炎药物，或用于减轻手术或伤口后的水肿的抗炎药物。

根据使用的方法或目的，药物组合物可以进一步包括药学上可接受的或营养学可接受的载体、赋形剂、稀释剂或辅助成分。载体、赋形剂或稀释剂可包括选自乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、糊精、碳酸钙、丙二醇、液体石蜡和盐水中的至少一种，但不限于此。

除了上述用途之外，本申请的丝氨酸蛋白酶变体或表达丝氨酸蛋白酶变体的微生物还可以用于生产化妆品、加工皮革、制备药物、制备诊断剂、处理废物、制备用于学术研究的化学品的目的。然而，这仅仅是示例性地描述了目的，而丝氨酸蛋白酶变体也可以用于本领域已知的变性、降解或去除蛋白类物质的任何其它目的。

实施例

在下文中，将参考以下实施例和实验例更详细地描述本申请。然而，这些实施例和实验例仅用于说明目的，而不旨在限制本申请的范围。

实施例1.源自Thermobifida fusca的丝氨酸蛋白酶变体的筛选

实施例1-1：源自Thermobifida fusca的丝氨酸蛋白酶文库的制备

通过易错PCR将随机突变引入编码对应于源自Thermobifida fusca的丝氨酸蛋白酶的成熟区的氨基酸(SEQ ID NO:31)的基因中。使用Diversify

表1

使用下表2中所示的引物扩增，使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)，将在上述过程中获得的PCR片段连接到载体上，并转化到DH5α细胞中以获得菌落。纯化所得菌落中的质粒，以获得大小为约5×10

表2

实施例1-2：源自Thermobifida fusca的丝氨酸蛋白酶文库的筛选

用实施例1-1中制备的蛋白酶文库转化容易释放蛋白质的枯草芽孢杆菌LB700菌株并进行筛选。筛选通过两阶段方法进行。在第一阶段，将用文库转化的枯草芽孢杆菌菌株接种在2％脱脂奶平板上，并根据晕圈大小选择所希望的菌落。根据Groningen方法进行枯草芽孢杆菌的转化，筛选中使用的脱脂奶的组成如下表3所示。

表3

(每1L)

第二阶段涉及通过偶氮酪蛋白显色来重新选择在第一阶段中选择的菌落的方法。将含有卡那霉素抗生素的脑心灌注(BHI，bd，货号53286)液体培养基添加到96深孔板中，并且将在第一阶段中选择的菌落接种到其中，随后在37℃下孵育20至24小时。孵育后，通过离心获得包含酶的上清液，并将上清液与等量的作为底物的2％(w/v)偶氮酪蛋白混合，然后在37℃反应1小时。通过向酶反应溶液中加入3倍体积的10％三氯乙酸(TCA)终止反应，并通过离心除去凝结的蛋白质。通过将产物与等量的NaOH混合进行显色反应，然后在440nm处测量吸光度，以比较显色程度。通过该方法，选择与野生型丝氨酸蛋白酶相比吸光度增加150％或更多的菌落。

实施例2.选择的变体的制备和活性评价

实施例2-1：变体制备

作为分析来自筛选的变体序列的结果，证实SEQ ID NO:31的第12位氨基酸(苯丙氨酸，Phe)和第116位氨基酸(天冬酰胺，Asn)分别被酪氨酸(Tyr)和天冬氨酸(Asp)取代。在图1中，显示了基于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的突变的位置。通过定点诱变将两个选择的突变(F12和N116)以单一突变的形式重新引入到pBE-S-TAP质粒中，将具有双突变和单一突变的菌株的活性分别与野生型菌株的活性进行比较。用于制备变体的引物如下表4所示。

表4

实施例2-2：活性评价

在用制备的质粒转化枯草芽孢杆菌LB700菌株后，使用N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺(Sigma,货号S7388，下文称为SUC-AAPF-pNA)肽作为底物进行转化株的活性评价。将转化的枯草芽孢杆菌菌株接种到含有卡那霉素抗生素的脑心灌注(BHI,bd,货号53286)液体培养基中，并在37℃下培养20至24小时，将除细胞外的一部分培养液与25mMTris-HCl(pH7.5)缓冲液和1mM Suc-AAPF-pNA混合，然后在37℃下反应30分钟。在410nm测量反应溶液的吸光度。由文献中已知的酶产生的对硝基苯胺的消光系数在410nm处为8800M

表5

作为测量的结果，证实F12Y和F12YN116D变体的活性在pH 7.5和37℃的条件下相比于野生型分别增加约2.1倍和3.9倍。

实施例2-3：热稳定性的评价

进行下面描述的实验以证实引入突变对热稳定性的影响。

具体而言，在将实施例2-2中使用的样品分别置于室温、70℃、80℃和90℃下5分钟之后，测量样品的酶活性，用于活性评价。测量的活性示于下表6中。

表6

作为测量的结果证实，即使在80℃下，F12Y和F12YN116D变体显示出比野生型菌株高约2倍和4倍的酶活性。由此证实本申请的丝氨酸蛋白酶变体在高温下也保持高活性，因此丝氨酸蛋白酶变体可以有效地用于工业中。

实施例3.饱和诱变文库的制备和筛选

实施例3-1.F12和N116残基的饱和诱变文库制备

为了确认用酪氨酸和天冬氨酸以外的残基取代F12和N116残基(即，先前选择的变体)对活性的影响，制备了关于这两个残基的饱和诱变文库。

分别使用pBE-S-TAP质粒作为模板和引物对SEQ ID NO:11和12以及SEQ ID NO:13和14获得两个PCR片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒将各片段连接，然后转化到DH5α细胞中，从而获得菌落。纯化所得菌落中的质粒，以获得大小为约4×10

表7

实施例3-2：饱和诱变文库的筛选和活性评价

以与实施例1-2相同的方式对实施例3-1中制备的饱和诱变文库进行筛选。通过筛选、序列分析、使用Suc-AAPF-pNA作为底物对这些变体进行活性评价，选择与F12YN116D变体相比具有相同或增加的活性的变体。

表8

结果发现，F12和N116变体的活性增加，即使它们的残基各自被除了实施例2中证实的酪氨酸和天冬氨酸以外的不同氨基酸(例如，F12S、F12A、F12R、N116S、N116T、N116G)取代。

实施例3-3：F12S变体的制备和活性评价

通过定点诱变将突变(F12S)以单一突变形式重新引入pBE-S-TAP质粒后，将变体的活性与野生型的活性进行比较。

使用Suc-AAPF-pNA作为底物对变体(F12S)进行活性评价。

[表9]

作为测量的结果，证实F12S变体的活性增加了约1.5倍。

实施例4.源自Thermobifida fusca的丝氨酸蛋白酶样蛋白的第12和116位残基的影响确认

实施例4-1：野生型和变体的制备

为了研究对应于SEQ ID NO:31的第12和116位的氨基酸残基是否影响与SEQ IDNO:31具有序列同源性的其它丝氨酸蛋白酶的活性的增加，分别用酪氨酸(Y)和天冬氨酸(D)取代序列同源性为87.2％、81.8％、81.3％、73.8％、69.9％和66.7％的丝氨酸蛋白酶的第12和116位残基，然后将丝氨酸蛋白酶的活性与野生型的活性进行比较。各丝氨酸蛋白酶的来源和序列信息如表10所示。

[表10]

用酪氨酸(Y)和天冬氨酸(D)取代各种丝氨酸蛋白酶的第12和116位残基，以制备SEQ ID NO:55至66所示的变体。

实施例4-2：活性评价

将制备的质粒在枯草芽孢杆菌LB700菌株中转化和表达，然后通过与实施例2-2中所述的活性测量方法相同的方法进行活性评价。测量的活性如表11所示。

[表11]

作为测量的结果，证实了当突变被引入第12位残基时，与源自Thermobifidafusca的丝氨酸蛋白酶具有序列同源性的六种蛋白的活性也增加，如同源自Thermobifidafusca的丝氨酸蛋白酶。根据上述事实，证实了第12和116位残基是展现丝氨酸蛋白酶活性的重要残基，并且酶活性可以通过用不同的氨基酸取代这些残基来提高，正如通过SEQ IDNO:31所证实的。因此，本申请的具有增加的酶活性的丝氨酸蛋白酶变体可有效地用于工业中。

综上所述，本申请所属领域的技术人员将能够理解，本申请可以以其它具体形式来实现，而不改变本申请的技术构思或本质特征。在这方面，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，而不应被解释为限制本申请的范围。相反，本申请旨在不仅涵盖示例性实施方案，而且涵盖可包括在如所附权利要求书所定义的本申请的实质和范围内的各种替代、修改、等同方案和其它实施方案。

序列表

<110> CJ 第一制糖株式会社(CJ CheilJedang Corporation)

<120> 新的丝氨酸蛋白酶变体

<130> OPA22007

<150> KR 10-2021-0032885

<151> 2021-03-12

<160> 72

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 6922

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> pBE-S-TFP

<400> 1

actagtgttc ttttctgtat gaaaatagtt atttcgagtc tctacggaaa tagcgagaga 60

tgatatacct aaatagagat aaaatcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc 120

catctattac aataaattca cagaatagtc ttttaagtaa gtctactctg aacttaagca 180

aaaggagagg gacgcgtgtg agaagcaaaa aattgtggat cagcttgttg tttgcgttaa 240

cgttaatctt tacgatggcg ttcagcaaca tgtctgcgca ggctgcggcc ggtgcacata 300

tgcaagagct ggcgttgaaa cgggacctcg gcctctctga cgcagaagta gccgaactcc 360

gggctgctga ggcggaagcg gtcgagctcg aggaggagct ccgcgattca ttagggtcag 420

acttcggcgg tgtatatctg gatgctgaca ccaccgaaat tacggtcgcg gtaaccgacc 480

cggcagcggt aagtcgtgtc gacgcggatg atgtcacagt tgatgttgtc gatttcgggg 540

aaacagcttt gaatgatttt gtggcttcat taaatgccat tgccgacacg gcagacccta 600

aagtcactgg atggtatacc gatctcgaaa gtgatgccgt agtcattacg accttgcgtg 660

gcgggactcc tgctgccgag gaacttgctg agagagcggg tctcgacgaa agagccgttc 720

ggattgtgga agaagatgaa gaaccacaga gcttggctgc aattattggt ggaaacccgt 780

actatttcgg aaattacaga tgcagtatcg ggtttagtgt ccgtcagggc tctcaaacgg 840

gattcgcgac cgcaggccac tgcggatcca cggggacgcg tgtgtcttct ccttcaggaa 900

cagttgcagg aagttatttc ccgggtcgcg atatgggctg ggtgcggatt acatcagcag 960

atactgtaac accactcgta aatcggtata atgggggaac tgttacggtc actgggtcac 1020

aagaagctgc caccggatcc tccgtttgtc gctctggagc aacaacgggc tggcgctgcg 1080

gaactatcca atcaaaaaac caaacggttc gctatgcaga agggactgtt actggtttaa 1140

caagaactac agcctgtgct gaaggtgggg attctggagg gccatggctc acaggtagcc 1200

aggcgcaagg ggttacaagc ggcggaacag gcgattgcag aagtggaggg attacctttt 1260

tccaaccaat caatccattg cttagctatt tcggccttca attagtgacc ggctgaaagc 1320

ttgtcgacct gcagtctaga catcaccatc atcaccacta atgcggtagt ttatcacagt 1380

taaattgcta acgcagtcag gcaccgtgta tgaaatctaa caatgcgctc atcgtcatcc 1440

tcggcaccgt caccctggat gctgtaggca taggcttggt tatgccggta ctgccgggcc 1500

tatttcactt tttgcattct acaaactgca taactattat gtaaatcgct cctttttagg 1560

tggcacaaat gtgaggcatt ttcgctcttt ccggcaacca cttccaagta aagtataaca 1620

cactatactt tatattcata aagtgtgtgc tctgcgaggc tgtcggcagt gccgaccaaa 1680

accataaaac ctttaagacc tttctttttt ttacgagaaa aaagaaacaa aaaaacctgc 1740

cctctgccac ctcagcaaag gggggttttg ctctcgtgct cgtttaaaaa tcagcaaggg 1800

acaggtagta ttttttgaga agatcactca aaaaatctcc acctttaaac ccttgccaat 1860

ttttattttg tccgttttgt ctagcttacc gaaagccaga ctcagcaaga ataaaatttt 1920

tattgtcttt cggttttcta gtgtaacgga caaaaccact caaaataaaa aagatacaag 1980

agaggtctct cgtatctttt attcagcaat cgcgcccgat tgctgaacag attaataata 2040

gattttagct ttttatttgt tgaaaaaagc taatcaaatt gttgtcggga tcaattactg 2100

caaagtctcg ttcatcccac cactgatctt ttaatgatgt attggggtgc aaaatgccca 2160

aaggcttaat atgttgatat aattcatcaa ttccctctac ttcaatgcgg caactagcag 2220

taccagcaat aaacgactcc gcacctgtac aaaccggtga atcattacta cgagagcgcc 2280

agccttcatc acttgcctcc catagatgaa tccgaacctc attacacatt agaactgcga 2340

atccatcttc atggtgaacc aaagtgaaac ctagtttatc gcaataaaaa cctatactct 2400

ttttaatatc cccgactggc aatgccggga tagactgtaa cattctcacg cataaaatcc 2460

cctttcattt tctaatgtaa atctattacc ttattattaa ttcaattcgc tcataattaa 2520

tcctttttct tattacgcaa aatggcccga tttaagcaca ccctttattc cgttaatgcg 2580

ccatgacagc catgataatt actaatacta ggagaagtta ataaatacga gcaaaaggcc 2640

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 2700

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 2760

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 2820

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 2880

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 2940

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 3000

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 3060

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 3120

gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 3180

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 3240

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 3300

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 3360

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 3420

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 3480

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 3540

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 3600

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 3660

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 3720

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 3780

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 3840

cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 3900

agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 3960

tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 4020

agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 4080

atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 4140

ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 4200

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 4260

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 4320

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 4380

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct 4440

aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc 4500

gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca gtaaccaaca tgattaacaa 4560

ttattagagg tcatcgttca aaatggtatg cgttttgaca catccactat atatccgtgt 4620

cgttctgtcc actcctgaat cccattccag aaattctcta gcgattccag aagtttctca 4680

gagtcggaaa gttgaccaga cattacgaac tggcacagat ggtcataacc tgaaggaaga 4740

tctgattgct taactgcttc agttaagacc gaagcgctcg tcgtataaca gatgcgatga 4800

tgcagaccaa tcaacatggc acctgccatt gctacctgta cagtcaagga tggtagaaat 4860

gttgtcggtc cttgcacacg aatattacgc catttgcctg catattcaaa cagctcttct 4920

acgataaggg cacaaatcgc atcgtggaac gtttgggctt ctaccgattt agcagtttga 4980

tacactttct ctaagtatcc acctgaatca taaatcggca aaatagagaa aaattgacca 5040

tgtgtaagcg gccaatctga ttccacctga gatgcataat ctagtagaat ctcttcgcta 5100

tcaaaattca cttccacctt ccactcaccg gttgtccatt catggctgaa ctctgcttcc 5160

tctgttgaca tgacacacat catctcaata tccgaatagg gcccatcagt ctgacgacca 5220

agagagccat aaacaccaat agccttaaca tcatccccat atttatccaa tattcgttcc 5280

ttaatttcat gaacaatctt cattctttct tctctagtca ttattattgg tccattcact 5340

attctcattc ccttttcaga taattttaga tttgcttttc taaataagaa tatttggaga 5400

gcaccgttct tattcagcta ttaataactc gtcttcctaa gcatccttca atccttttaa 5460

taacaattat agcatctaat cttcaacaaa ctggcccgtt tgttgaacta ctctttaata 5520

aaataatttt tccgttccca attccacatt gcaataatag aaaatccatc ttcatcggct 5580

ttttcgtcat catctgtatg aatcaaatcg ccttcttctg tgtcatcaag gtttaatttt 5640

ttatgtattt cttttaacaa accaccatag gagattaacc ttttacggtg taaaccttcc 5700

tccaaatcag acaaacgttt caaattcttt tcttcatcat cggtcataaa atccgtatcc 5760

tttacaggat attttgcagt ttcgtcaatt gccgattgta tatccgattt atatttattt 5820

ttcggtcgaa tcatttgaac ttttacattt ggatcatagt ctaatttcat tgcctttttc 5880

caaaattgaa tccattgttt ttgattcacg tagttttctg tattcttaaa ataagttggt 5940

tccacacata ccaatacatg catgtgctga ttataagaat tatctttatt atttattgtc 6000

acttccgttg cacgcataaa accaacaaga tttttattaa tttttttata ttgcatcatt 6060

cggcgaaatc cttgagccat atctgacaaa ctcttattta attcttcgcc atcataaaca 6120

tttttaactg ttaatgtgag aaacaaccaa cgaactgttg gcttttgttt aataacttca 6180

gcaacaacct tttgtgactg aatgccatgt ttcattgctc tcctccagtt gcacattgga 6240

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tgtttatact ctaatatttc agcacaatct tttactcttt cagccttttt aaattcaaga 6360

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<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 饱和诱变_F_1

<400> 19

gtggaaaccc gtactatnnn ggaaattaca gatgcag 37

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 饱和诱变_R_1

<400> 20

gcatagcgaa ccgtttgnnn ttttgattgg atagttcc 38

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 饱和诱变_F_2

<400> 21

ggaactatcc aatcaaaann ncaaacggtt cgctatgc 38

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 饱和诱变_R_2

<400> 22

ctgcatctgt aatttccnnn atagtacggg tttccac 37

<210> 23

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> Thermobifida fusca (F12Y)

<400> 23

atgcaagagc tggcgttgaa acgggacctc ggcctctctg acgcagaagt agccgaactc 60

cgggctgctg aggcggaagc ggtcgagctc gaggaggagc tccgcgattc attagggtca 120

gacttcggcg gtgtatatct ggatgctgac accaccgaaa ttacggtcgc ggtaaccgac 180

ccggcagcgg taagtcgtgt cgacgcggat gatgtcacag ttgatgttgt cgatttcggg 240

gaaacagctt tgaatgattt tgtggcttca ttaaatgcca ttgccgacac ggcagaccct 300

aaagtcactg gatggtatac cgatctcgaa agtgatgccg tagtcattac gaccttgcgt 360

ggcgggactc ctgctgccga ggaacttgct gagagagcgg gtctcgacga aagagccgtt 420

cggattgtgg aagaagatga agaaccacag agcttggctg caattattgg tggaaacccg 480

tactattacg gaaattacag atgcagtatc gggtttagtg tccgtcaggg ctctcaaacg 540

ggattcgcga ccgcaggcca ctgcggatcc acggggacgc gtgtgtcttc tccttcagga 600

acagttgcag gaagttattt cccgggtcgc gatatgggct gggtgcggat tacatcagca 660

gatactgtaa caccactcgt aaatcggtat aatgggggaa ctgttacggt cactgggtca 720

caagaagctg ccaccggatc ctccgtttgt cgctctggag caacaacggg ctggcgctgc 780

ggaactatcc aatcaaaaaa ccaaacggtt cgctatgcag aagggactgt tactggttta 840

acaagaacta cagcctgtgc tgaaggtggg gattctggag ggccatggct cacaggtagc 900

caggcgcaag gggttacaag cggcggaaca ggcgattgca gaagtggagg gattaccttt 960

ttccaaccaa tcaatccatt gcttagctat ttcggccttc aattagtgac cggctga 1017

<210> 24

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> Thermobifida fusca (F163Y_N267D)

<400> 24