一种丙烯酰胺的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种丙烯酰胺的制备方法。

背景技术

丙烯酰胺（C

文献：李琪, 张庆占, 刘明辉. 微生物法生产丙烯酰胺技术[J]. 化工设计通讯,2018, 44(9):1.针对微生物法生产丙烯酰胺做了重点性介绍，该文章中谈及微生物法的优势，即：①生产流程简单、安全；②转化率高，无须回收、分离丙烯腈；③生产效率高、无副产物；④成品浓度高，无须提取。但同时，该文章中也重点指出了微生物法中微生物酶的关键作用，也即丙烯酰胺生产时容易受到酶活性的影响。文献：孙中华. 微生物法制备丙烯酰胺单体的影响因素分析[J]. 胜利油田职工大学学报, 2005(3):2.则探讨了催化水合反应温度、反应液pH、反应液中丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对丙烯腈水合酶催化活性的影响，为微生物法制备丙烯酰胺的工业化生产提供了理论依据。

目前，微生物法生产丙烯酰胺的浓度在25-35%左右，例如：专利CN03115536.7公开了微生物催化法生产丙烯酰胺的工艺，具体通过发酵生产含有腈水合酶的丙酸棒杆菌或其诱变株细胞，然后用游离细胞法或固定化细胞法催化丙烯腈水合成丙烯酰胺，经后处理得高纯度的丙烯酰胺产品。该发明重点对工艺过程中的菌株进行优化，具体采用丙酸棒杆菌及其经诱变的菌种，相比于红球菌属的细菌具有更高的生物量、酶活。该发明的转化率尽管可达到99.99%，但整体得到的丙烯酰胺溶液浓度仅为32%，出釜浓度尽管相比于常规的微生物法要显著，但难以满足当下高浓度丙烯酰胺的需求。

专利CN201510504967.8则公开了一种在微生物法生产丙烯酰胺工艺中降低酶使用量的方法，该发明将贮存时间≤24h和贮存时间≥240h的腈水合酶细胞发酵液进行混合，以提高腈水合酶的活性和质量，达到降低腈水合酶使用量。该发明重点探究了酶的用量，已经将丙烯酰胺含量32-34%作为反应终点，进而探究单耗、成本问题，故而实际操作同样难以得到高浓度丙烯酰胺。

专利CN201510940461.1则公开了一种连续化微生物法制备丙烯酰胺的方法及装置，重点将间歇生产和取样改为连续化和自动化生产。减少设备投资和占地面积，而且实现效率高效、生产成本降低，使产品质量更加稳定和易于控制。该发明更侧重于装置的优化，以环保为基准，并未对实际丙烯酰胺的含量以及相关转化率问题进行探究。

但目前的微生物法若要获得更高浓度丙烯酰胺通常会采用后处理如加热浓缩的方式获得，此方法会引起较大环境污染问题，同时浓缩过程易发生自聚。针对现有技术存在的问题，寻找一种环保、稳定、便捷且能够获得高浓度丙烯酰胺的制备方法十分必要。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种丙烯酰胺的制备方法，该制备方法环保、稳定且便捷，能够得到较高浓度的丙烯酰胺。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种丙烯酰胺的制备方法，包括以下步骤：

（1）将诺卡氏菌和紫红红球菌分别在种子培养基培养后，混合得到复合菌A接种到发酵培养基中进行培养，得到发酵液，离心去上清液后，进行包埋，得到固定化细胞A；

（2）将菌种B在种子培养基培养后，接种到发酵培养基中进行培养，得到发酵液，离心去上清液后，进行包埋，得到固定化细胞B；

（3）将步骤（1）得到的固定化细胞A与去离子水混合后，搅拌，第一次流加丙烯腈，反应，再加入步骤（2）得到的固定化细胞B，继续流加丙烯腈，继续反应，过滤得到的丙烯酰胺；

所述菌种B包括绿针假单胞菌。

进一步地，步骤（1）和步骤（2）中所述种子培养基包括：葡萄糖5-12g/L、酵母膏5-8g/L、尿素3-4g/L、磷酸氢二钾0.4-0.5g/L、七水合硫酸镁1-1.5g/L、NaCl 0.3-0.5g/L；优选为葡萄糖8g/L、酵母膏5g/L、尿素4g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1.2g/L、NaCl0.4g/L。

进一步地，步骤（1）和步骤（2）中所述发酵培养基包括：葡萄糖20-25g/L、酵母膏5-8g/L、尿素5-6g/L、磷酸氢二钾0.4-0.5g/L、七水合硫酸镁1-1.5g/L。优选为葡萄糖22g/L、酵母膏6g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水合硫酸镁1.2g/L。

进一步地，步骤（1）和步骤（2）中所述包埋具体为加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，加入到0.4MCaCl

进一步地，步骤（1）中所述培养的温度为25-35℃，搅拌速度为150r/min；步骤（2）中所述培养的温度为28-30℃，搅拌速度为150r/min。

进一步地，步骤（3）中所述反应的温度为20-28℃。

进一步地，步骤（3）中所述固定化细胞B加入前，对丙烯酰胺浓度进行检测，丙烯酰胺的浓度累计达到25%。

进一步地，所述复合菌A中诺卡氏菌和紫红红球菌的重量比为2-4:1。

优选地，所述复合菌A中诺卡氏菌和紫红红球菌的重量比为3:1。

进一步地，步骤（3）中所述去离子水、固定化细胞A（湿重）和第一次流加的丙烯腈的重量比为100:2-4:15-20。优选为100:3:18。

进一步地，步骤（3）中所述去离子水：固定化细胞B（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B后流加的丙烯腈用量）=100:1:5。

进一步地，本发明还提供了上述的制备方法制备得到的丙烯酰胺。

本发明所取得的技术效果是：

本发明中的制备方法采用微生物法，通过优化丙烯酰胺制备过程中微生物种类以及工艺参数，具体通过对多菌种（诺卡氏菌、紫红红球菌、绿针假单胞菌）进行包埋得到固定化细胞，再经两步法加入固定化酶，能够有效地提高各菌种生产腈水合酶的酶活，同时也更容易控制最终得到产品的品质，提高产品的产量，最终得到的丙烯酰胺浓度较高同时丙烯腈的转化率较高；此外，由于本发明采用连续化方式反应，因此更为稳定且简便。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

值得说明的是，本发明中使用的相关菌种具体为诺卡氏菌ATCC19296、紫红红球菌DSM46022、绿针假单胞菌ATCC13985，其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。

实施例1

一种丙烯酰胺的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将诺卡氏菌和紫红红球菌分别在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖5g/L、酵母膏5g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L、NaCl 0.3g/L）培养后，混合得到复合菌A（重量比为2:1的诺卡氏菌和紫红红球菌）接种到发酵培养基中进行培养（发酵培养基的成分：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L），接种量为6%（w/w），培养温度为25℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入到0.4M的CaCl

（2）将绿针假单胞菌（即菌种B）在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖5g/L、酵母膏5g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L、NaCl 0.3g/L）培养后，接种到发酵培养基培养（发酵培养基的成分：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L）接种量为5%（w/w），培养温度为28℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入0.4M的CaCl

（3）反应釜中注入去离子水，控制反应釜温度为20℃，将步骤（1）得到的固定化细胞A加入反应釜，搅拌，流加丙烯腈进行酶催化水合反应，当丙烯酰胺的浓度累计达到25%（质量分数）左右时，向反应釜中加入步骤（2）得到的固定化细胞B，继续流加丙烯腈，再反应8h后，过滤得到丙烯酰胺。

步骤（3）中去离子水：固定化细胞A（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B前流加的丙烯腈用量）=100:2:15；去离子水：固定化细胞B（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B后流加的丙烯腈用量）=100:1:5。

反应结束后测定反应釜出口的丙烯酰胺浓度为56.8%，由丙烯腈到丙烯酰胺的转化率为99.99%。

实施例2

一种丙烯酰胺的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将诺卡氏菌和紫红红球菌分别在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖12g/L、酵母膏8g/L、尿素4g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水合硫酸镁1.5g/L、NaCl 0.5g/L）培养后，混合得到复合菌A（重量比为4:1的诺卡氏菌和紫红红球菌）接种到发酵培养基中进行培养（发酵培养基的成分：葡萄糖25g/L、酵母膏8g/L、尿素6g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水合硫酸镁1.5g/L），接种量为6%（w/w），培养温度为35℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入到0.4M的CaCl

（2）将绿针假单胞菌（即菌种B）在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖12g/L、酵母膏8g/L、尿素4g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水合硫酸镁1.5g/L、NaCl 0.5g/L）培养后，接种到发酵培养基培养（发酵培养基的成分：葡萄糖25g/L、酵母膏8g/L、尿素6g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水合硫酸镁1.5g/L），接种量为5%（w/w），培养温度为30℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入0.4M的CaCl

（3）反应釜中注入去离子水，控制反应釜温度为28℃，将步骤（1）得到的固定化细胞A加入反应釜，搅拌，流加丙烯腈进行酶催化水合反应，当丙烯酰胺的浓度累计达到25%（质量分数）左右时，向反应釜中加入步骤（2）得到的固定化细胞B，继续流加丙烯腈，再反应8h后，过滤得到丙烯酰胺。

步骤（3）中去离子水：固定化细胞A（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B前流加的丙烯腈用量）=100:4:20；去离子水：固定化细胞B（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B后流加的丙烯腈用量）=100:1:5。

反应结束后测定反应釜出口的丙烯酰胺浓度为59.0%，由丙烯腈到丙烯酰胺的转化率为99.99%。

实施例3

一种丙烯酰胺的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将诺卡氏菌和紫红红球菌分别在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖8g/L、酵母膏5g/L、尿素4g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1.2g/L、NaCl 0.4g/L）培养后，混合得到复合菌A（重量比为3:1的诺卡氏菌和紫红红球菌）接种到发酵培养基中进行培养（发酵培养基的成分：葡萄糖22g/L、酵母膏6g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水合硫酸镁1.2g/L），接种量为6%（w/w），培养温度为30℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入到0.4M的CaCl

（2）将绿针假单胞菌（即菌种B）在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖8g/L、酵母膏5g/L、尿素4g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1.2g/L、NaCl 0.4g/L）培养后，接种到发酵培养基培养（发酵培养基的成分：葡萄糖22g/L、酵母膏6g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水合硫酸镁1.2g/L），接种量为5%（w/w），培养温度为30℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入0.4M的CaCl

（3）反应釜中注入去离子水，控制反应釜温度为25℃，将步骤（1）得到的固定化细胞A加入反应釜，搅拌，流加丙烯腈进行酶催化水合反应，当丙烯酰胺的浓度累计达到25%（质量分数）左右时，向反应釜中加入步骤（2）得到的固定化细胞B，继续流加丙烯腈，再反应8h后，过滤得到丙烯酰胺。

步骤（3）中去离子水：固定化细胞A（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B前流加的丙烯腈用量）=100:3:18；去离子水：固定化细胞B（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B后流加的丙烯腈用量）=100:1:5。

反应结束后测定反应釜出口的丙烯酰胺浓度为61.4%，由丙烯腈到丙烯酰胺的转化率为99.99%。

对比例1

一种丙烯酰胺的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将诺卡氏菌和紫红红球菌分别在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖5g/L、酵母膏5g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L、NaCl 0.3g/L）培养后，混合得到复合菌A（重量比为2:1的诺卡氏菌和紫红红球菌）接种到发酵培养基中进行培养（发酵培养基的成分：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L），接种量为6%（w/w），培养温度为25℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入到0.4M的CaCl

（2）将绿针假单胞菌在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖5g/L、酵母膏5g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L、NaCl 0.3g/L）培养后，接种到发酵培养基培养（发酵培养基的成分：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L），接种量为5%（w/w），培养温度为28℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入0.4M的CaCl

（3）反应釜中注入去离子水，控制反应釜温度为20℃，将步骤（1）得到的固定化细胞A和固定化细胞B加入反应釜，搅拌，第一次流加丙烯腈进行酶催化水合反应，当丙烯酰胺的浓度累计达到25%（质量分数）左右时，继续流加丙烯腈，再反应8h后，过滤得到丙烯酰胺。

步骤（3）中去离子水：固定化细胞A（湿重）：丙烯腈（第一次流加的丙烯腈用量）=100:2:15；去离子水：固定化细胞B（湿重）：丙烯腈（继续流加的丙烯腈用量）=100:1:5。

也即与实施例1的区别主要仅在于，步骤（3）中直接将获得的固定化细胞B与获得的固定化细胞A一起加入，不进行分步加入。

反应结束后测定反应釜出口的丙烯酰胺浓度为45.5%，由丙烯腈到丙烯酰胺的转化率为98.4%。

对比例2

一种丙烯酰胺的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将诺卡氏菌、紫红红球菌、绿针假单胞菌分别在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖5g/L、酵母膏5g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L、NaCl0.3g/L）培养后，混合得到复合菌（重量比为2:1:1.5的诺卡氏菌、紫红红球菌、绿针假单胞菌）接种到发酵培养基中进行培养（发酵培养基的成分：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L），接种量为11%（w/w），培养温度为25℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入到0.4M的CaCl

（3）反应釜中注入去离子水，控制反应釜温度为20℃，将步骤（1）得到的部分固定化细胞加入反应釜，搅拌，流加丙烯腈进行酶催化水合反应，当丙烯酰胺的浓度累计达到25%（质量分数）左右时，向反应釜中加入剩余的固定化细胞，继续流加丙烯腈，再反应8h后，过滤得到丙烯酰胺。

步骤（3）中去离子水：部分固定化细胞A（湿重）：丙烯腈（加入剩余固定化细胞A前流加的丙烯腈用量）=100:2:15；去离子水：剩余固定化细胞A（湿重）：丙烯腈（加入部分固定化细胞A后流加的丙烯腈用量）=100:1:5。

也即与实施例1的区别主要仅在于，将诺卡氏菌、紫红红球菌、绿针假单胞菌分别进行种子培养后，三者混合得到复合菌后，继续后续操作。

反应结束后测定反应釜出口的丙烯酰胺浓度为40.7%，由丙烯腈到丙烯酰胺的转化率为97.5%。

对比例3

一种丙烯酰胺的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将诺卡氏菌和紫红红球菌分别在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖5g/L、酵母膏5g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L、NaCl 0.3g/L）培养后，混合得到复合菌A（重量比为2:1的诺卡氏菌和紫红红球菌）接种到发酵培养基中进行培养（发酵培养基的成分：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L），接种量为6%（w/w），培养温度为25℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入到0.4M的CaCl

（2）将紫红红球菌在种子培养基（种子培养基的成分：葡萄糖5g/L、酵母膏5g/L、尿素3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L、NaCl 0.3g/L）培养后，接种到发酵培养基培养（发酵培养基的成分：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、尿素5g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、七水合硫酸镁1g/L），接种量为5%（w/w），培养温度为28℃，搅拌速度为150r/min，发酵40h后得到发酵液，将发酵液离心后去上清液后，加入海藻酸钠，使海藻酸钠的加入量占2%(w/v)，搅拌成浆，注入0.4M的CaCl

（3）反应釜中注入去离子水，控制反应釜温度为20℃，将步骤（1）得到的固定化细胞A加入反应釜，搅拌，流加丙烯腈进行酶催化水合反应，当丙烯酰胺的浓度累计达到25%（质量分数）左右时，向反应釜中加入步骤（2）得到的固定化细胞B，继续流加丙烯腈，再反应8h后，过滤得到丙烯酰胺。

步骤（3）中去离子水：固定化细胞A（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B前流加的丙烯腈用量）=100:2:15；去离子水：固定化细胞B（湿重）：丙烯腈（加入固定化细胞B后流加的丙烯腈用量）=100:1:5。

也即与实施例1的区别主要仅在于，将步骤（2）的绿针假单胞菌替换为紫红红球菌。

反应结束后测定反应釜出口的丙烯酰胺浓度为50.9%，由丙烯腈到丙烯酰胺的转化率为96.6%。

综合以上结果可知，本发明的制备方法整体而言，减少了获得高浓度丙烯酰胺的浓缩步骤，更为环保且稳定；此外，由于菌种的优化以及制备方法采用连续化两步反应，因此，最终得到的丙烯酰胺浓度较高同时丙烯腈的转化率较高。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。