导航：首页> 生物化学；啤酒；烈性酒；果汁酒；醋；微生物学；酶学；突变或遗传工程>一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用

一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用

文献发布时间：2023-06-19 18:32:25

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用。

背景技术

三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，其中的某些中间产物是合成生物体中重要有机物的前提，例如草酰乙酸(OAA)是天冬氨酸族氨基酸合成的碳架，α-酮戊二酸是谷氨酸族氨基酸合成的碳架，当三羧酸循环的中间产物用于合成有机物的合成时，生物体会启动回补途径以确保三羧酸循环可以正常运行。

谷氨酸棒杆菌有两条回补途径，分别是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，ppc编码)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成草酰乙酸(OAA)，以及丙酮酸羧化酶(PC，pyc编码)催化丙酮酸生成草酰乙酸。这两种回补途径对于菌株的氨基酸代谢具有重要的影响。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用。

第一方面，本发明提供一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中经过如下任意一种或多种突变得到：

第27位由谷氨酸突变为天冬氨酸、第34位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第85位由酪氨酸突变为组氨酸、第180位由异亮氨酸突变为亮氨酸、第303位由赖氨酸突变为谷氨酸、第360位由苏氨酸突变为丙氨酸、第408位由丙氨酸突变为丝氨酸、第542位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第634位由精氨酸突变为赖氨酸、第840位由精氨酸突变为组氨酸。

进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列(由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码得到)。

进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由如SEQ ID NO.4所示核苷酸编码得到。本发明进一步用于编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体的核酸。

第二方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列发生如下突变中的任意一种或多种：

进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体的氨基酸序列包括如SEQ IDNO.1所示的序列。

进一步地，所述微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌。

本发明优选实施例中使用的出发菌株MHZ-0112-8为谷氨酸产生菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11941，公开于中国专利CN202011285971.7。

出发菌株MHZ-0513-3为谷氨酰胺产生菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13405，公开于中国专利CN201611250325.0。

出发菌株MHZ-0701为脯氨酸产生菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13757，公开于中国专利CN201710385500.5。

本发明进一步提供所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体或所述核酸在提高菌株氨基酸产量中的应用。

进一步地，所述菌株为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌；和/或，

所述氨基酸为谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸或羟脯氨酸中的一种或多种。

本发明进一步提供所述重组微生物在生产氨基酸中的应用；优选为在生产谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸或羟脯氨酸中的一种或多种中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，包括多个位点的突变，将该突变体应用于菌株中时，发现在这些位点发生突变时，其谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的产量显著提高。

具体地，菌株MHZ-0112-8/pXMJ19-ppc10与MHZ-0112-8/pXMJ19-ppc相比，谷氨酸产量从35.8g/L提高到39.9g/L，产酸提高11.5％；将质粒pXMJ19-ppc10和pXMJ19-ppc转化到谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3，菌株MHZ-0513-3/pXMJ19-ppc10与MHZ-0513-3/pXMJ19-ppc相比，谷氨酰胺产量从28.8g/L提高到32.3g/L，产酸提高12.2％；将质粒pXM J19-ppc10和pXMJ19-ppc转化到谷氨酸棒杆菌MHZ-0701，菌株MHZ-0701/pXMJ19-ppc10与MHZ-0701/pXMJ19-ppc相比，脯氨酸产量从38.3g/L提高到40.6g/L，产酸提高6％。由此可见ppc10中点突变E27D、Q34R、Y85H、I180L、K303E、T360A、A408S、Q542R、R634K、R840H有利于谷氨酸的生产。

本发明提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体不仅能促进谷氨酸生产，还能促进谷氨酸衍生物谷氨酰胺、脯氨酸的生产，显而易见，可将该突变应用于其他谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等宿主菌中，用于生产谷氨酸其他衍生物，例如鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸等。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中涉及的引物名称及序列如表1(SEQ ID NO.5-8)所示。

表1引物序列

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1构建磷酸烯醇式丙酮酸突变体文库

1、本发明首先采用易错PCR的方法构建磷酸烯醇式丙酮酸突变体文库。本发明采用的易错PCR体系为：每50μL体系添加5μL 10×易错PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，1％Triton，20mmol/LMgCl

2、构建ppc表达质粒：所得ppc突变体片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用XmaI进行消化，同时将pXMJ19利XmaI进行消化，并用FastAP去磷酸化，将用T4DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGenBiotech)，挑取卡那抗性克隆，XmaI酶切鉴定得到片段插入pXMJ19的阳性克隆，进一步通过用P1/P2引物测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pXMJ19-ppcX，X＝1，2，3…n。

实施例2 MHZ-0112-8/pXMJ19-ppcX突变菌株构建及生产谷氨酸性能

本实施例将质粒pXMJ19-ppcX电转到MHZ-0112-8，获得菌株MHZ-0112-8/pXMJ19-ppcX，然后进行摇瓶发酵，检测谷氨酸产量。

1、发酵验证谷氨酸产量的方法：将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于斜面培养基中进行活化，于31.5℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于种子培养基中，于31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期(12h左右)，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在31.5℃，振荡培养。在糖被完全消耗之后，测定培养基中积累的L-谷氨酸的浓度。结果如表2所示(OD

2、培养基配方如下：

斜面培养基：酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2.5g/L，pH 7.0-7.2，121℃0.1MPa灭菌30min；

种子培养基：葡萄糖25g/L，尿素3g/L，K

发酵培养基：葡萄糖60g/L，硫酸铵15g/L，KH

表2突变菌株谷氨酸含量检测

结果显示，菌株MHZ-0112-8/pXMJ19-ppc10的谷氨酸产量显著提高，与MHZ-0112-8/pXMJ19-ppc相比，谷氨酸含量从35.8g/L提高到39.9g/L，产酸提高11.5％，说明表达ppc10突变后，菌株的谷氨酸产量显著提高。

本发明进一步对质粒pXMJ19-ppc10进行测序，结果表明，其氨基酸突变位点分别为E27D、Q34R、Y85H、I180L、K303E、T360A、A408S、Q542R、R634K和R840H。

实施例3 MHZ-0513-3/pXMJ19-ppc10突变菌株构建及生产谷氨酰胺的性能

本实施例进一步将实施例2挑选出的质粒pXMJ19-ppc10转入谷酰产生菌MHZ-0513-3，构建菌株MHZ-0513-3/pXMJ19-ppc10，随后进行摇瓶发酵，检测谷氨酰胺含量。

1、发酵验证谷氨酰胺产量的方法：将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于上述斜面培养基中进行活化，于33℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于33℃，100rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为5h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在33℃，150rpm振荡培养48h。结果如表3所示(OD

2、培养基配方如下：

斜面培养基：脑心浸液37g/L，琼脂1.8％，121℃0.1MPa灭菌20min；

种子培养基为：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH

发酵培养基为：葡萄糖90g/L，(NH4)

表3突变菌株谷氨酰胺含量检测

菌株MHZ-0513-3/pXMJ19-ppc10与MHZ-0513-3/pXMJ19-ppc比，谷氨酰胺含量从28.8g/L提高到32.3g/L，产酸提高12.2％，说明ppc基因突变为ppc10后，不仅利于提高谷氨酸产量，还有利于谷氨酰胺的生产。

实施例4 MHZ-0701/pXMJ19-ppc10突变菌株的构建及生产脯氨酸的性能

本实施例进一步将质粒pXMJ19-ppc10转入脯氨酸产生菌MHZ-0701，构建菌株MHZ-0701/pXMJ19-ppc10，随后进行摇瓶发酵，检测脯氨酸含量。

1、培养基配方如下：

种子活化培养基：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH 7.2。

种子培养基：玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO

发酵培养基：玉米浆0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸铵3.7％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO

2、培养流程如下：

(1)种子培养：挑取MHZ-0701、MHZ-0701/pXMJ19-ppc、MHZ-0701/pXMJ19-ppc10斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养16-22h。

(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养72h。

(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-脯氨酸含量，其浓度如下表4所示：

表4突变菌株脯氨酸含量检测

菌株MHZ-0701/pXMJ19-ppc10与菌株MHZ-0701/pXMJ19-ppc相比，脯氨酸产量从38.3g/L提高到40.6g/L，产酸提高6.0％。

综合以上实施例中的结果可以看出，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶中含有点突变E27D、Q34R、Y85H、I180L、K303E、T360A、A408S、Q542R、R634K、R840H，有利于谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的合成和生产，显而易见，可将该突变应用于其他谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等宿主菌中，用于生产谷氨酸其他衍生物，例如鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸等。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 梅花（上海）生物科技有限公司

<120> 一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用

<130> KHP211117887.6

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 919

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Gln Ile Leu

1 5 10 15

Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val

20 25 30

Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu

35 40 45

Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala

50 55 60

Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala

85 90 95

Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu

100 105 110

Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn

115 120 125

Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg

130 135 140

Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu

145 150 155 160

Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys

165 170 175

Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp

180 185 190

Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile

195 200 205

Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro

210 215 220

Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu

225 230 235 240

Gly Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly

245 250 255

Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser

260 265 270

Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu

275 280 285

His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val

290 295 300

Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro

305 310 315 320

Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly

325 330 335

Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu

340 345 350

Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe

355 360 365

Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Lys Asp

370 375 380

Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu

385 390 395 400

Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu

405 410 415

Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr

420 425 430

Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu

435 440 445

Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu

450 455 460

Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser

465 470 475 480

Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile

485 490 495

Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu

500 505 510

Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr

515 520 525

Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gln Ala Gly

530 535 540

Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp

565 570 575

Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp

580 585 590

Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu

595 600 605

Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro

610 615 620

Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly Ala Val Gln Gly Ser

625 630 635 640

Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn

645 650 655

Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu

660 665 670

Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala

675 680 685

Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala

690 695 700

Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser

705 710 715 720

Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser

725 730 735

Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp

740 745 750

Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly

755 760 765

Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr

770 775 780

Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe

785 790 795 800

Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu

805 810 815

Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Thr Glu Val Ala

820 825 830

Glu Arg Val Tyr Ser Val Ile Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys

835 840 845

Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro

850 855 860

Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu

865 870 875 880

Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln

885 890 895

Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser

900 905 910

Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly

915

<210> 2

<211> 919

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Gln Ile Leu

1 5 10 15

Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Asp Val Tyr Glu Leu Val

20 25 30

Glu Arg Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu

35 40 45

Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala

50 55 60

Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu His Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala

85 90 95

Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu

100 105 110

Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn

115 120 125

Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg

130 135 140

Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu

145 150 155 160

Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys

165 170 175

Leu Asp Glu Leu Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp

180 185 190

Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile

195 200 205

Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro

210 215 220

Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu

225 230 235 240

Gly Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly

245 250 255

Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser

260 265 270

Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu

275 280 285

His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Glu Val

290 295 300

Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro

305 310 315 320

Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly

325 330 335

Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu

340 345 350

Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Ala Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe

355 360 365

Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Lys Asp

370 375 380

Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu

385 390 395 400

Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ser Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu

405 410 415

Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr

420 425 430

Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu

435 440 445

Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu

450 455 460

Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser

465 470 475 480

Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile

485 490 495

Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu

500 505 510

Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr

515 520 525

Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Arg Ala Gly

530 535 540

Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp

565 570 575

Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp

580 585 590

Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu

595 600 605

Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro

610 615 620

Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Lys Gly Ala Val Gln Gly Ser

625 630 635 640

Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn

645 650 655

Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu

660 665 670

Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala

675 680 685

Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala

690 695 700

Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser

705 710 715 720

Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser

725 730 735

Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp

740 745 750

Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly

755 760 765

Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr

770 775 780

Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe

785 790 795 800

Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu

805 810 815

Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Thr Glu Val Ala

820 825 830

Glu Arg Val Tyr Ser Val Ile His Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys

835 840 845

Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro

850 855 860

Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu

865 870 875 880

Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln

885 890 895

Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser

900 905 910

Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly

915

<210> 3

<211> 2760

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60

gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120

gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180

ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240

gcggaagacc tctacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300

ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360

gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420

gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480

cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540

gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600

cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660

gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720

ggtgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780

aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840

ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900

atgaataagg tcaccccgca gctgcttgcg ctggcagatg cagggcacaa cgacgtgcca 960

agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020

acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080

ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140

gaatccaagg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200

agctttggat tcaaccttta cgcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260

gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320

gcagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380

ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440

gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500

tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggtg ttgctcaagg aattcggact catcgcagcc 1560

aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620

ctccaggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatctcta ccgcaactac 1680

ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740

ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800

tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860

ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca ggggggctgt ccaaggttcc 1920

gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980

cgccgaaacc tcgaagccct ggtctcagcc acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040

gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100

aagaagtacg cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160

acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220

acctcctcgg tggaagattt gcgagccatc ccatgggtgc tcagctggtc acagtctcgt 2280

gtcatgctgc caggctggtt tggtgtcgga accgcattag agcagtggat tggcgaaggg 2340

gagcaggcca cccaacgcat tgccgagctg caaacactca atgagtcctg gccatttttc 2400

acctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460

ctctacgcag acctgatccc agatacggaa gtagccgagc gagtctattc cgtcatccgc 2520

gaggagtact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggctctga tgatctgctt 2580

gatgacaacc cacttctcgc acgctctgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640

aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagtg 2700

tcccgcaaca ttcagctgac catgaacggt ctttccactg cgctgcgcaa ctccggctag 2760

<210> 4

<211> 2760

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60

gcggaacaag aaggccagga cgtttatgaa ctggtcgaac gagcgcgcct gacttctttt 120

gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180

ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240

gcggaagacc tccacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300

ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360

gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420

gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480

cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagctc 540

gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600

cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660

gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720

ggtgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780

aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840

ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900

atgaatgagg tcaccccgca gctgcttgcg ctggcagatg cagggcacaa cgacgtgcca 960

agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020

acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttgct 1080

ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140

gaatccaagg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200

agctttggat tcaaccttta cagtctggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260

gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320

gcagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380

ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440

gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500

tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggtg ttgctcaagg aattcggact catcgcagcc 1560

aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620

ctccgggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatctcta ccgcaactac 1680

ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740

ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800

tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860

ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca agggggctgt ccaaggttcc 1920