一种杨梅衰弱病的荧光定量PCR辅助诊断方法

技术领域

本发明涉及植物疾病诊断领域，具体的为一种通过荧光PCR定量分析土壤中微生物进行杨梅衰弱病辅助诊断的方法。

背景技术

杨梅(Myrica rubra Sieb.Et Zucc)是中国南方重要的特色果树，其果实甜酸适中，风味独特，在国内外享有盛誉；并且杨梅也是一种重要的药用植物，杨梅果实提取物对炎症、过敏、糖尿病、癌症、细菌感染、腹泻等疾病具有辅助治疗作用。杨梅在我国南方地区栽植面积广，具有很好的经济效益。

本发明的发明人发现杨梅存在衰弱病，病症表现为：杨梅树结果量变大、果实变小、品质低劣，老熟叶片脱落严重，树势严重衰弱。根据病情指数进行分级，如下：0级，整个树体叶片茂密，树势健康；1级，0＜叶片脱落量占整个树体总叶片量的比例≤10％；3级，10％＜叶片脱落量占整个树体总叶片量的比例≤25％；5级，25％＜叶片脱落量占整个树体总叶片量的比例≤50％；7级，50％＜叶片脱落量占整个树体总叶片量的比例≤75％；9级，75％＜叶片脱落量占整个树体总叶片量的比例≤100％。其通过调查发现：杨梅衰弱病具有危害重、地域广的特点。该病发生以盛产期果园为主，在浙江、广西、广东、福建、江西等地均有较大面积发生。发病严重的果园，病死率甚至能达80％【任海英，郑锡良，张淑文，等，杨梅衰弱病病症及病树矿质营养分析，浙江农业科学，2020，61(10)：2043-2048】。

综上，衰弱病发病范围广，危害大，严重威胁杨梅的栽植，减少果农的收入。为有效进行杨梅衰弱病的防治，有必要进行杨梅衰弱病的诊断，以及时进行针对性的治疗，减少损失。目前，杨梅衰弱病的诊断仅由果农主观观察判断，尚无科学的诊断方法。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种杨梅衰弱病的辅助诊断方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种杨梅衰弱病的辅助诊断方法，该方法包括：收集同一地区健康杨梅和疑似患病杨梅的生长土壤，分别测定土壤中的Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌的相对丰度；将疑似患病杨梅生长土壤中Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌的相对丰度分别与健康杨梅的进行对比分析；如果相对于健康杨梅的生长土壤，疑似患病杨梅生长土壤中的Acidothermus属细菌相对丰度显著降低，Cladophialophora属真菌相对丰度显著增加，则表示疑似患病杨梅得衰弱病的可能性大，如果疑似患病杨梅的生长土壤中Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌相对丰度均无显著性差异，则表示疑似患病杨梅未得衰弱病。

进一步地，所述测定土壤中的Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌相对丰度的操作步骤包括：采用DNA抽提试剂盒提取土壤样本基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，选择特异性引物进行荧光PCR定量分析。

优选地，所述特异引物包括：Acidothermus属细菌的上游引物5’-CTGCCCTTGACTCTGGGATA-3’(Tm＝60.21℃)和下游引物5’-GTCGCCTTGGTAAGCCATTA-3’(Tm＝60.10℃)，Cladophialophora属真菌的的上游引物5’-GGTTGTCACCAATCCTCTGG-3’(Tm＝60.36℃)和下游引物5’-ATTTCGCTGCGTTCTTCATC-3’(Tm＝60.36℃)，Acidothermus属细菌PCR产物长度为154，Cladophialophora真菌的PCR产物长度为为158。

进一步地，所述土壤为环绕杨梅树干一圈1.5m左右树冠滴水线位置采集的0～20cm的表层土壤，利用四分法收集进行收集，并过0.45mm的筛网，低温保存。

优选地，定期收集杨梅的生产土壤，测定土壤中的Acidothermus属细菌和Cladophialophora真菌的量，通过监测Acidothermus属细菌和Cladophialophora真菌变化情况来监测杨梅是否可能得衰弱病。

进一步地，所述地区包括浙江省的慈溪市、临海市、泰顺县、天台县和文成县。

本发明的优势在于：(1)本发明通过测定土壤中的Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌相对丰度提供了一种杨梅衰弱病的辅助诊断方法，可快速有效的获得诊断结果，为杨梅衰弱病提供了新的分子诊断手段。(2)通过所述方法对杨梅果园中的Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌相对丰度进行定期检测和监控，能及时发现杨梅得衰弱病的可能性，及早进行防治。(3)杨梅衰弱病表现为：杨梅树结果量变大、果实变小、品质低劣，老熟叶片脱落严重，树势严重衰弱。果农在观察诊断时，多等杨梅结果后才能判别果树是否得衰弱病，此时，果实变小，质量低劣，不能获得好的收益，已经严重影响果农收入。本发明可以在任何时期进行诊断，尤其在杨梅结果前，从而及早进行治疗，进一步降低损失。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1健康杨梅和衰弱病杨梅生长土壤中微生物对比研究

(1)实验材料

选择浙江省5个杨梅主产区的杨梅果园，该5个主产区分别为海宁市、临海市、泰顺县、天台县和文成县。所选果园均存在健康杨梅和衰弱病杨梅。

选择健康杨梅树和树冠大小和树叶脱落量占整株树总叶片量的25％～50％(病情指数为5级)的衰弱病杨梅树。

(2)土壤样品的采集

在环绕杨梅树干1圈1.5m左右树冠滴水线位置采集0～20cm表层土样品，利用四分法收集混合土壤样品，过0.45mm的筛网，保存于-80℃冰箱中。

(3)土壤基因组测序

基因组测序委托上海欧易生物医学科技有限公司执行。采用DNA抽提试剂盒(DNeasy PowerSoil Kit、QIAamp 96PowerFecal QIAcube HT kit)提取土壤样本基因组DNA。以稀释后的基因组DNA为模板，使用Tks Gflex DNA Polymerase高保真酶(Takara，大连)进行PCR。使用带条形码(Barcode)的特异引物343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′扩增细菌多样性对应区域16SrRNA V3-V4区；选择ITS1F-5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS2-5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′扩增真菌ITS多样性对应区域ITS1和ITS2。使用Qubit dsDNA Assay Kit定量后，PCR产物等量混样，利用IlluminaMiSeqPE300平台对PCR产物进行测序。采用Illumina Miseq对微生物多样性测序分析，使用Vsearch软件按照97％的相似度进行OTU分类，采用RDP Classifier Naive Bayesian对代表序列与数据库进行物种注释。

(4)实验结果

Illumina MiSeq高通量测序结果显示：细菌文库共得到20020～38808条有效序列，序列平均长度分布在422.57～430.85bp之间，在97％相似水平上各样本OTU个数分布在1482～2727之间；真菌文库共得到21914～134217条有效序列，序列平均长度分布在258～319bp之间，在97％相似水平上各样本OTU个数分布在608～1168之间。不同处理样本间共有的细菌OTUs数为279，健康树(H)的OTU数平均值为1685，衰弱病树(D)的OTU数平均值为1575，衰弱病树根际土壤细菌OTU数比健康树组低9.78％。

各地区杨梅生长土壤中属水平相对丰度均较高的10种细菌相对丰度测定结果及对比如下表1。各地区杨梅生长土壤中属水平相对丰度均较高的10种真菌相对丰度测定结果及对比如下表2。

表1各地区杨梅生长土壤中相对丰度均较高的10种细菌(属水平)测定结果对比表

备注：

表2各地区杨梅生长土壤中相对丰度均较高的10种真菌(属水平)测定结果对比表

备注：

由表1可知，10种细菌中，各地区衰弱病杨梅生长土壤中Acidothermus属细菌的相对丰度均显著低于健康杨梅的，说明土壤中Acidothermus属细菌与杨梅衰弱病密切相关。其他9种细菌在各地区的表现的趋势不一致，说明不同地区土壤中细菌差异较大，影响细菌的因素多样，而Acidothermus属细菌在各地区趋势一致，进一步说明Acidothermus属细菌与杨梅衰弱病密切相关。

由表2可知，10种真菌中，各地区衰弱病杨梅生长土壤中的Cladophialophora属真菌的相丰度均显著高于健康杨梅的，说明土壤中Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌的变化与杨梅衰弱病密切相关。其他9种真菌在各地区表现的趋势不一致，说明土壤中真菌差异较大，影响真菌的因素多样，而Cladophialophora属细菌在各地区趋势均一致，进一步说明Cladophialophora属真菌与杨梅衰弱病密切相关。

实施例2杨梅生长土壤中Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌相对丰度的测定及对比分析

1、按下表3中所述的Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌的特异性引物对实施例1中所述的健康杨梅树生长土壤和衰弱病杨梅生长土壤中基因组DNA进行荧光PCR定量分析，分别测定其中的Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌的相对丰度。

表3 Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌的特异性引物

实验结果发现各地区衰弱病杨梅生长土壤中Acidothermus属细菌相对丰度均显著低于健康杨梅的(p＜0.01)，约为健康杨梅的83％，Cladophialophora属真菌相对丰度均显著高于健康杨梅的(p＜0.001)，约为健康杨梅的175％，该结果进一步证实土壤中Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌与杨梅衰弱病密切相关，土壤中Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌的相对丰度可作为杨梅衰弱病的诊断指标。

2、于12月份分别选取上述果园中健康杨梅和表现为老熟叶片脱落，树势衰弱的疑似患病杨梅，按实施例1取其生长土壤，采用DNA抽提试剂盒(DNeasy PowerSoil Kit、QIAamp 96PowerFecal QIAcube HT kit)提取土壤样本基因组DNA，用上述Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌特异性引物进行荧光PCR定量分析。于第二年杨梅成熟时(6～7月份)观察记录上述健康杨梅和疑似患病杨梅的果实状况。

实验结果表明相比健康杨梅生长土壤，Acidothermus属细菌相对丰度显著降低且Cladophialophora属真菌相对丰度显著升高的疑似患病杨梅结果量大，果实小，表现为衰弱病症状；而Acidothermus属细菌相对丰度未显著降低或Cladophialophora属真菌相对丰度未显著升高的疑似患病杨梅的果实正常，未表现出衰弱病症状。

上述结果证实通过测定疑似患病杨梅生长土壤中的Acidothermus属细菌和Cladophialophora属真菌的相对丰度，并与健康杨梅生长土壤的进行对比分析，可对杨梅是否得衰弱病进行诊断，另外，该诊断方法可以在任何时期进行，尤其在杨梅结果前，因而可在果树结果前采取治疗措施，进一步降低损失。