标志物在预测结直肠癌的复发和/或转移风险中的用途

技术领域

本申请涉及生物医学领域。具体来说，本申请涉及标志物在预测结直肠癌的复发和/或转移风险中的用途。

背景技术

结直肠癌是全球发病率和死亡率都居前五的高发高致死率癌种。研究文献表明结直肠癌术后的复发转移率为20%~50%，且复发转移集中发现在术后前两年。患者术后需进行密切随访，前两年主要包括每三个月一次的CEA、CA19-9检测，每半年进行胸腹/盆CT或MRI，术后1年内进行肠镜检查。CEA、CA19-9肿瘤血清标志物的检测对复发转移灵敏度低；CT/MRI具有辐射性，难以发现微小病灶；肠镜具有侵入性不能发现远端转移；以上这些原因使得现有手段都不足以成为结直肠癌术后长期随访的主要手段。

液体活检技术使得肿瘤患者可以在肿瘤切除后，能够通过检测血浆游离DNA评估患者的肿瘤分子负荷，进行微小病灶残留及复发转移的风险评估。近年来DNA甲基化作为肿瘤分子检测的热门越来越多用于癌症的早筛早诊，但对于其用于患者术后复发风险评估，尚无特别高效的检测标志物。而且，由于血浆游离DNA中，肿瘤分子的占比极低，因而对开发尤其用于复发风险评估的高效的检测标志物存在极大的挑战。因此，亟需开发一种方法和/或试剂盒，其可以从生物样品中数量极为有限的细胞外游离DNA高效地读取与结直肠癌相关的表观遗传学信息，而且可以在医院检验科里很容易地配置并可以可靠地应用。

发明内容

为解决现有技术的不足，发明人通过筛选大量标志物，发现本发明的标志物能够以高的灵敏度和特异性预测经历结直肠癌手术后的个体的结直肠癌的复发和/或转移(包括原位复发和转移)。

在一方面，本发明涉及试剂在制备用于在个体中预测结直肠癌的复发和/或转移风险的试剂盒或微阵列中的用途，其特征在于所述试剂用于检测分离自所述个体的样品中选自以下的至少一种标志物的至少一个靶区域的甲基化水平：FOXE1、HMX1、MARCH11、基因间隔区1 (chr10:133107880-133113966)、基因间隔区2 (chr7:152620588-152624685)以及它们的任何组合，其中与相应的截断值相比，一种或多种标志物的至少一个靶区域的甲基化水平等于或高于截断值表明所述个体具有结直肠癌复发和/或转移的风险，以及其中所述靶区域包含至少一个CpG二核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述甲基化为CpG甲基化。在一些实施方案中，所述个体为经历结直肠癌手术后的个体，例如经历结直肠癌手术后的人。在一些实施方案中，所述试剂为选自以下的试剂：

i)与所述标志物的至少一个靶区域杂交或扩增所述标志物的至少一个靶区域的物质，例如寡核苷酸引物或探针；和

ii)亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶试剂，所述亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶试剂区分所述标志物的至少一个靶区域内的甲基化和未甲基化二核苷酸，例如甲基化和未甲基化CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸引物或探针与所述标志物的至少一个靶区域的至少9个碱基长的片段互补或相同，优选选自SEQ ID NO：1-10和13-17。在一些实施方案中，所述标志物为选自以下的两种或更多种标志物的组合：FOXE1、HMX1、MARCH11、基因间隔区1(chr10:133107880-133113966)和基因间隔区2 (chr7:152620588-152624685)。

在一些实施方案中，所述样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便及其组合；优选地，所述样品选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞及其组合。

在一些实施方案中，所述靶区域选自：区域chr4:8859817-8859921、chr5:16180271-16180378、chr9:100615549-100615636、chr10:133110880-133110966、chr7:152622588-152622685或者它们的互补序列或经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）；或者所述互补序列的经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）；或者前述序列和/或区域的任何组合。

在另一方面，本发明涉及一种用于在个体中预测结直肠癌的复发和/或转移风险的试剂盒或微阵列，其特征在于所述试剂盒或微阵列包含用于检测分离自所述个体的样品中选自以下的至少一种标志物的至少一个靶区域的甲基化水平的试剂：FOXE1、HMX1、MARCH11、基因间隔区1 (chr10:133107880-133113966)、基因间隔区2 (chr7:152620588-152624685)以及它们的任何组合，其中与相应的截断值相比，一种或多种标志物的靶区域的甲基化水平等于或高于截断值表明所述个体具有结直肠癌复发和/或转移的风险，以及其中所述靶区域包含至少一个CpG二核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述甲基化为CpG甲基化。在一些实施方案中，所述个体为经历结直肠癌手术后的个体，例如经历结直肠癌手术后的人。在一些实施方案中，所述样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便及其组合；更优选地，所述样品选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞及其组合。

在一些实施方案中，所述试剂为选自以下的试剂：

i)与所述标志物的至少一个靶区域杂交或扩增所述标志物的至少一个靶区域的物质，例如寡核苷酸引物或探针，优选地，所述寡核苷酸引物或探针与所述标志物的至少一个靶区域的至少9个碱基长的片段互补或相同，更优选地，所述寡核苷酸引物或探针选自SEQ ID NO：1-10和13-17；和

ii)亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶试剂，所述亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶试剂区分所述标志物的至少一个靶区域内的甲基化和未甲基化二核苷酸，例如甲基化和未甲基化CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述标志物为选自以下的标志物组合：FOXE1、HMX1、MARCH11和基因间隔区1；或FOXE1、HMX1、MARCH11、基因间隔区1和基因间隔区2。

在一些实施方案中，所述靶区域选自：区域chr4:8859817-8859921、chr5:16180271-16180378、chr9:100615549-100615636、chr10:133110880-133110966、chr7:152622588-152622685或者它们的互补序列或经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）；或者所述互补序列的经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）；或者前述序列和/或区域的任何组合。

在又一个方面，本发明涉及一种用于在个体中评估结直肠癌个体术后复发和/或转移的风险的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)从所述个体获取含有DNA的生物样品；和

(b)用试剂处理步骤(a)中获取的所述生物样品中的DNA，所述试剂能够区分所述DNA中的甲基化和未甲基化的位点例如CpG位点，从而获得经处理的DNA；

(c)任选地，用预扩增引物池预扩增从步骤(b)获取的所述经处理的DNA中的至少一种靶标志物的至少一个靶区域，其中各靶标志物的至少一个靶区域被预扩增以获得至少一种预扩增产物，并且所述至少一种靶标志物包含选自下组的一种或多种标志物：FOXE1、HMX1、MARCH11、基因间隔区1 (chr10:133107880-133113966)、基因间隔区2 (chr7:152620588-152624685)以及它们的任何组合，以及其中所述靶区域包含至少一个CpG二核苷酸序列；

(d)检测步骤(b)中或者步骤(c)中至少一种靶标志物的至少一个靶区域的甲基化模板，所述至少一种靶标志物包含选自下组的一种或多种标志物：FOXE1、HMX1、MARCH11、基因间隔区1 (chr10:133107880-133113966)、基因间隔区2 (chr7:152620588-152624685)以及它们的任何组合，和

(e)分别比较步骤(d)中的各靶标志物的至少一个靶区域的甲基化水平和相应的截断值，其中一种或多种靶标志物的至少一个靶区域相对于其相应的截断值具有等于或高于截断值的甲基化水平表明所述个体具有结直肠癌复发和/或转移的风险。

在一些实施方案中，所述个体为经历结直肠癌手术后的个体，例如经历结直肠癌手术后的人。在一些实施方案中，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶试剂，所述亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶试剂区分所述标志物的至少一个靶区域内的甲基化和未甲基化二核苷酸，例如甲基化和未甲基化CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，在步骤(c)中，使用扩增所述标志物的至少一个靶区域的物质，例如寡核苷酸引物，进行扩增。在一些实施方案中，所述寡核苷酸引物与所述标志物的至少一个靶区域的至少9个碱基长的片段互补或相同。在一些实施方案中，所述寡核苷酸引物选自SEQ ID NO：1-10。在一些实施方案中，在步骤(d)中，使用与所述标志物的至少一个靶区域杂交的物质，例如探针，进行检测。在一些实施方案中，所述探针与所述标志物的至少一个靶区域的至少9个碱基长的片段互补或相同。在一些实施方案中，所述探针选自SEQID NO：13-17。

在一些实施方案中，所述标志物为选自以下的标志物组合：FOXE1、HMX1、MARCH11和基因间隔区1；或FOXE1、HMX1、MARCH11、基因间隔区1和基因间隔区2。

在一些实施方案中，所述样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便及其组合；优选地，所述样品选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞及其组合。

在一些实施方案中，所述检测以基因测序、PCR (例如荧光PCR)、FISH、免疫组化、ELISA、Western或流式细胞技术为检测方法。

在一些实施方案中，所述靶区域选自：区域chr4:8859817-8859921、chr5:16180271-16180378、chr9:100615549-100615636、chr10:133110880-133110966、chr7:152622588-152622685或者它们的互补序列或经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）；或者所述互补序列的经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）；或者前述序列和/或区域的任何组合。

具体实施方式

参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来实施本发明。

本发明涉及新发现的标志物的甲基化水平与结直肠癌的复发和/或转移(包括原位复发和转移)风险之间的关系。本文所述标志物提供用于在个体中评估结直肠癌个体术后复发和/或转移(包括原位复发和转移)的风险的方法。因此，本发明的一个实施方案代表标志物的改进，所述标志物适用于评估结直肠癌个体术后复发和/或转移(包括原位复发和转移)的风险。在又一个实施方案中，本发明新发现的标志物可与本领域已知的一种或多种其它癌症标志物(例如CEA、CA 19-9、CA24-2、CA 125、CA 72-4、CF21-1、TSGF、P53-Ab)和/或常规检查手段例如胸腹/盆CT、胸腹/盆MRI和肠镜检查联用，例如用于在个体中评估结直肠癌个体术后复发和/或转移(包括原位复发和转移)的风险或用于制备用于此目的的试剂盒和/或微阵列。

术语“样品”意指已知或疑似表达或含有本文所述标志物的材料。样品可来源于生物来源(“生物样品”)，例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或包括细胞(例如肿瘤细胞)、细胞裂解物在内的细胞培养物和生物或生理流体，例如全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗、尿液、乳汁、腹膜液等。获自来源的样品或在预处理以改进样品特征(例如从血液制备血浆等)后的样品可直接使用。在本发明的某些方面，样品是人生理流体，例如人血浆。在本发明的某些方面，样品是活组织检查样品例如经组织检查获得的肿瘤组织或细胞。

可按照本发明进行分析的样品包括临床来源的多核苷酸。正如本领域技术人员应理解的是，靶多核苷酸可包括DNA或RNA，尤其是DNA，特别是游离DNA例如细胞外游离DNA。

可采用本领域已知方法，在一个或多个核苷酸上对靶多核苷酸或者对与靶多核苷酸杂交或扩增的物质（如寡核苷酸引物或探针）进行可检测标记。可检测标记可以是而不限于发光标记、荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记和比色标记。

如本文所用，术语“标志物”是指这样的目的核酸、基因区域或甲基化位点：其甲基化水平或基于甲基化水平的计算模型的得分指示着结直肠癌的复发和/或转移风险。基因应被认为包括其所有转录变体及其所有启动子和调控元件。如本领域技术人员所理解的，已知某些基因在个体之间表现出等位基因变异或单核苷酸多态性（“SNP”）。SNP包括不同长度的简单的重复序列（例如二核苷酸和三核苷酸重复）的插入和缺失。因此，本申请应被理解为扩展到由任何其他突变、多态性或等位基因变异产生的标志物/基因的所有形式。另外，应当理解，术语“标志物”应既包括标志物或基因的正义链序列，也包括标志物或基因的反义链序列。

本文所用的术语“标志物”被宽泛地解释为既包括1）在生物样品或基因组DNA中发现的原始标志物（处于特定的甲基化状态），也包括2）其经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应区域或MSRE处理后的对应区域）。亚硫酸氢盐转化后的对应区域与基因组序列中的目标标志物不同之处在于，一个或多个未甲基化的胞嘧啶残基被转化为尿嘧啶碱基、胸腺嘧啶碱基或在杂交行为上与胞嘧啶不同的其他碱基。经MSRE处理的对应区域与基因组序列中的目标标志物不同之处在于，该序列在一个或多个MSRE切割位点处被切割。

本发明中，“甲基化状态”是指一种或多种甲基化核苷酸碱基在核酸分子中的存在、不存在和/或其量。例如，含有甲基化胞嘧啶的核酸分子被认为是甲基化的，此时核酸分子的甲基化状态是甲基化的。不含有任何甲基化修饰的胞嘧啶的核酸分子被认为是未甲基化的，此时核酸分子的甲基化状态是未甲基化的。在一些实施方案中，如果核酸在特定基因座(例如特定单一CpG二核苷酸的基因座)或基因座特定组合处不是甲基化的，则核酸可表征为“未甲基化”，即使它在相同基因或分子的其他基因座处为甲基化的。

因此，甲基化状态描述了核酸(例如基因组序列)的甲基化的状态。另外，甲基化状态是指在特定基因组基因座处的核酸区段与甲基化相关的特征。此类特征包括但不限于此DNA序列内的任何胞嘧啶(C)残基是否为甲基化的、一个或多个甲基化C残基的位置、贯穿核酸的任何特定区域的甲基化C的频率或百分比以及由于例如等位基因起点的差异而导致的甲基化等位基因差异。“甲基化状态”是指在生物样品中贯穿核酸的任何特定区域的甲基化C或未甲基化C的相对浓度、绝对浓度或模式。例如，如果核酸序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基是甲基化的，则其可称为“超甲基化”或具有“增加的甲基化”，而如果DNA序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基是未甲基化的，则其可称为“去甲基化”或具有“减少的甲基化”。同样地，如果核酸序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基与另一个核酸序列(例如来自不同区域或来自不同个体等)相比是甲基化的，则该序列被认为与其他核酸序列相比是超甲基化的或具有增加的甲基化。或者，如果DNA序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基与另一个核酸序列(例如来自不同区域或来自不同个体等)相比是未甲基化的，则该序列被认为与其他核酸序列相比是去甲基化的或具有减少的甲基化。

本发明中，甲基化水平代表一个或多个位点处于甲基化状态的比例。一个区域（或一组位点）的甲基化水平是该区域中所有位点（或组中所有位点）的甲基水平的均值。因此，区域的甲基化水平上升或下降并不表示区域中所有甲基化位点的甲基化水平都上升或下降。本领域知晓将检测DNA甲基化的方法（例如简化甲基化测序、荧光定量PCR）所得结果转化为甲基化水平的过程。

本文所述“甲基化水平”包括所涉序列中任意数量、和任意位置的CpG的甲基化状态的关系。所述关系可以是甲基化状态参数（例如0或1）的加减或数学算法的计算结果（例如均值、百分比、份数、比例、程度或利用数学模型进行的计算），包括但不限于甲基化水平度量值、甲基化单倍型比值、或甲基化单倍型负荷。

在本发明中用作标志物的基因预期包括所述基因的天然存在的变体、其互补序列、其所有启动子和调控元件(例如基因注释起始位点上游5 kb (例如4 kb、3 kb、2 kb或1kb)和其基因注释终止位点下游5 kb以内的核酸序列)以及所述基因或所述变体的片段，特别是分子生物学上可检测的片段。在本发明中，术语“分子生物学上可检测的片段”、“靶区域”和“靶基因区域”可以互换使用。分子生物学上可检测的片段优选地包含所述标志物的至少16、17、18、19、20、22、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述连续核苷酸包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、15个或更多个CpG二核苷酸序列。在一些实施方案中，优选靶基因区域富含CpG二核苷酸。

在本发明中，术语“靶区域”或“靶基因区域”是指由标志物基因本身、其基因注释起始位点上游5 kb (例如4 kb、3 kb、2 kb或1 kb)和其基因注释终止位点下游5 kb (例如4 kb、3 kb、2 kb或1 kb)所构成的核酸区域内的任何分子生物学上可检测的片段、或者其互补序列或经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）、或者所述互补序列的经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）。例如，下表1中的靶标志物的靶基因区域包括其Hg19坐标以及该坐标上下游5 kb (例如4 kb、3 kb、2 kb或1 kb)以内的任何分子生物学上可检测的片段、其互补序列或经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）、以及所述互补序列的经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）。更优选地，下表1中的靶标志物的靶基因区域包括其Hg19坐标以及该坐标上游5 kb(例如4 kb、3 kb、2 kb或1 kb)以内的任何分子生物学上可检测的片段、其互补序列或经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）、以及所述互补序列的经过处理的序列（例如亚硫酸氢盐转化后的对应序列或MSRE处理后的对应序列）。

在一些实施方案中，优选使用和检测选自下表1的靶标志物及其靶基因区域或它们的任何组合：

表1. 靶标志物和靶基因区域

在一些实施方案中，优选使用和检测表1中的靶标志物及其靶基因区域的两种或更多种(例如3种、4种或5种)的组合，例如FOXE1、HMX1、MARCH11和基因间隔区1的组合；或FOXE1、HMX1、MARCH11、基因间隔区1和基因间隔区2的组合。

在一些实施方案中，优选使用和检测靶标志物FOXE1及其靶基因区域，任选地另外使用和检测选自以下的靶标志物及其靶基因区域或它们的任何组合：HMX1、MARCH11、基因间隔区1和基因间隔区2。在一些实施方案中，优选使用和检测靶标志物HMX1及其靶基因区域，任选地另外使用和检测选自以下的靶标志物及其靶基因区域或它们的任何组合：FOXE1、MARCH11、基因间隔区1和基因间隔区2。在一些实施方案中，优选使用和检测靶标志物MARCH11及其靶基因区域，任选地另外使用和检测选自以下的靶标志物及其靶基因区域或它们的任何组合：FOXE1、HMX1、基因间隔区1和基因间隔区2。

在一些实施方案中，使用本发明的靶标志物及其靶基因区域或它们的组合能够在大于80%例如大于85%或大于90%的特异性的情况下实现至少20%例如至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的灵敏度，或能够在大于80%特异性的情况下实现至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少85%的灵敏度。

术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文可互换使用，是指温血动物，例如哺乳动物。该术语包括但不限于家畜、啮齿动物(例如大鼠和小鼠)、灵长类动物和人。优选该术语是指人。

术语“甲基化测定”是指确定DNA序列内一个或多个二核苷酸(例如CpG)序列的甲基化状态的任何测定。

在本文中，术语“截断值”与“阈值”可互换使用，应根据本领域技术人员的一般理解来理解，并且表示用于反映DNA甲基化水平的任何有用的参考。在一些实施方案中，截断值用阳性参考区间表示，其中在阳性参考区间内表明所述个体具有结直肠癌复发和/或转移的风险；例如与相应的阳性参考区间相比，一种或多种标志物的甲基化水平在阳性参考区间内则表明所述个体具有结直肠癌复发和/或转移的风险。截断值或阳性参考区间的获得可由已知数据库或个人研究获得。在本发明中，截断值或阳性参考区间是指来自阳性对照(即患有结直肠癌的复发和/或转移的个体)的水平。截断值或阳性参考区间可以获自患者自身的血液参考样本；患有结直肠癌的复发和/或转移的个体的标志物基因的表达；或预先确定的患有结直肠癌的复发和/或转移的个体的结直肠癌细胞。在一些实施方案中，在使用荧光PCR检测的情况下，使用Ct值设置阳性参考区间，例如以各标志物大于90%特异性（未复发样本检测为阳性的比例小于10%）的Ct值设置阳性参考区间。如本领域技术人员已知的，Ct值越大则表明甲基化水平越低，即Ct值与甲基化水平是负相关的，因此在使用Ct值表示截断值或阳性参考区间的情况下，一种或多种标志物的甲基化水平等于或高于截断值应表示为一种或多种标志物的Ct值小于或等于参考Ct值。在一些实施方案中，各标志物的阳性参考区间所对应的Ct值如表4所示，例如对于FOXE1，阳性参考区间为Ct值小于或等于28。

术语“寡核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚体形式，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语包括双链和单链DNA和RNA，例如多核苷酸的甲基化或帽化等修饰形式和未修饰形式。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文可互换使用。寡核苷酸可但非必需包括其它编码或非编码序列，或者它可以但不一定与其它分子和/或载体或支持材料连接。用于本发明方法或试剂盒的寡核苷酸可具有适于具体方法的任何长度。在某些应用中，该术语是指反义核酸分子(例如处于与编码本发明标志物的有义多核苷酸相反方向的mRNA或DNA链)。

用于本发明的寡核苷酸包括互补核酸序列和与这些序列基本相同的核酸，并且还包括因遗传密码简并而不同于核酸序列的序列。可用于本发明的寡核苷酸还包括在严格条件下、优选高严格性条件下与寡核苷酸癌症标志物核酸序列杂交的核酸。

核苷酸杂交测定是本领域熟知的。杂交测定程序和条件将根据应用而变化并依据已知的通用结合方法选择，参见例如J. 萨姆布鲁克等，分子克隆：实验指南(第三版. 科学出版社，2002)；以及Young和Davis，P.N.A.S，80: 1194 (1983)。进行重复和受控杂交反应的方法和设备已经描述于美国专利号5,871,928、5,874,219、6,045,996、6,386,749和6,391,623中，其各自通过引用结合到本文中。

本文所用的“引物”通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下不形成热力学稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约15-25个核苷酸之间。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为“G”、“A”、“C”和“T”)以及核苷酸类似物，都可用于本发明的引物。

本文使用的“扩增产物”是指自核酸模板，通过核酸扩增而产生的扩增的核酸。

本文使用的术语“核苷酸类似物”指与天然存在的核苷酸在结构上相似的化合物。核苷酸类似物可以具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。通常具有改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积特性。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA))通常尤其改变链特性，例如二级结构形成。

本发明中使用的引物和探针的实例如表2所示，它们针对的靶基因区域如表1所示。

本发明的引物和探针的核苷酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的扩增或探测效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、在核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸残基、或者将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基，例如将A替换成T，将C替换成G等。本领域技术人员清楚，所述修饰形式的引物也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保护范围之内。在一个实施方案中，引物的核苷酸序列的修饰形式为如CN103270174A中所公开的化学增强型引物。

可以使用例如通用DNA合成仪(例如由Applied Biosystems制造的394型)，经化学方法合成本发明引物中的各个核苷酸。还可采用本领域众所周知的任何其它方法来合成寡核苷酸。

使用从样品中提取的DNA作为模板，并使用PCR引物对靶标志物进行扩增反应，以获得扩增产物。扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)，其公开于以下参考文献(在此引作参考)中：Mullis等，美国专利第4,683,195号；第4,965,188号；第4,683,202号；第4,800,159 (PCR)号；Gelfand等，美国专利第5,210,015号(用“Taqman”或”Taq” [注册商标]探针进行的实时PCR)；Wittwer等，美国专利第6,174,670号；Kacian等，美国专利第5,399,491号(“NASBA”)；Lizardi,美国专利第5,854,033号；Aono等，日本专利公开第JP 4-262799号(滚环扩增)；等等。

优选使用PCR法对靶标志物进行扩增。PCR法本身是本领域众所周知的。术语“PCR”包括该反应的衍生形式，其包括但不限于反转录PCR、实时PCR、嵌套式PCR、多重PCR和荧光定量PCR等。优选使用荧光定量PCR法对靶核苷酸进行定量扩增。

在引物、模板DNA和耐热DNA聚合酶存在下，使用与有义链杂交的引物(反向引物)和与反义链杂交的引物(正向引物)，通过使变性、退火和延伸步骤的循环重复大约30次～60次(例如50次)来进行PCR。在一个实施方案中，PCR为荧光定量PCR。在一个实施方案中PCR使用了如表2所示的引物。本领域技术人员能够理解的是，也可使用其它PCR法和引物，只要可扩增出目标片段即可。

在本发明的PCR中，可使用各种常规的耐热DNA聚合酶进行扩增，包括但不限于FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)、Ex Taq (注册商标, Takara)、Z-Taq、AccuPrime TaqDNA聚合酶和HotStarTaq Plus DNA聚合酶。

基于引物Tm值选择合适PCR反应条件的方法是本领域众所周知的，本领域普通技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等，选出最佳条件。例如，可使用以下条件进行荧光定量PCR反应：95℃ 5分钟；95℃ 15秒，56℃ 40秒，循环50次。反应体系为25 μL。

可用于检测本发明靶标志物的甲基化水平的试剂是本领域众所周知的。适用于本发明的这种试剂例如亚硫酸氢盐试剂或甲基化敏感限制酶可市购获得或通过本领域技术人员熟知的方法常规地制得。

术语“亚硫酸氢盐试剂”是指用于区分甲基化的和未甲基化的CpG二核苷酸序列的亚硫酸氢盐。

术语“甲基化敏感限制酶”应被理解为根据其识别位点的甲基化状态而选择性消化核酸的酶。对于当识别位点未被甲基化或半甲基化时才特异性剪切的限制酶来说，当识别位点被甲基化时，不会发生剪切，或以显著降低的效率剪切。对于当识别位点被甲基化时才特异性剪切的限制酶来说，当识别位点未被甲基化时，不会发生剪切，或以显著降低的效率剪切。优选以下甲基化敏感限制酶，其识别序列含有CG二核苷酸(例如cgcg或cccggg)。在一些实施方案中，进一步优选的为当该二核苷酸中的胞嘧啶在C5碳原子被甲基化时不切割的限制酶。

本发明的试剂盒可以通过本领域常规方法制备。试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括用于检测各靶标志物的试剂)。试剂盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、dNTP、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施检测的说明书等)。例如，试剂盒可以包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)。这样的内容物可一起或分开递送给既定的接受者。作为一个实例，试剂盒可含有用于检测各靶标志物的试剂、缓冲液以及使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有用于质控的内标、阳性和阴性对照等。试剂盒还可包含用于从样品制备核酸例如DNA的试剂。以上实例不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。

微阵列是指具有平坦表面的固相支持体，其具有核酸阵列，阵列中的各个成员包含固定在空间上确定的区域或位点上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷贝，所述区域或位点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠；也就是说，所述区域或位点在空间上是离散的。此外，空间上确定的杂交位点可为“可寻址的”，因为其位置及其固定化的寡核苷酸的身份是已知或预先确定的(例如在其使用前是已知或预先确定的)。通常寡核苷酸或多核苷酸为单链，并通常由5'-端或3'-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的密度通常大于100/cm

本发明公开了标志物在评估结直肠癌个体术后复发和/或转移的风险中的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述用途已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述用途进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例

为了更清楚的理解本发明的内容，将结合实施例详细说明。

实施例1. 患者术前术后检测靶位点甲基化信号对比

手术依然是目前治疗可切除的结直肠肿瘤的最有效方式，对于大多数患者，在肿瘤切除后可看到肿瘤分子负荷的降低。因此对于适合用于监测患者术后肿瘤分子负荷的标志物而言，应在统计上看到术前信号显著高于术后信号。本实施例检测了50名患者的术前血浆和术后血浆游离DNA甲基化信号。具体的实验步骤如下。

1. 使用商业化Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提上述血浆样本中的细胞外游离DNA。

2. 使用商业化亚硫酸氢盐转化试剂MethylCode

3. 将上述转化后的DNA用于预扩增，用如下表2所示的含所有待检测靶点(HMX1、MARCH11、FOXE1、基因间隔区1和基因间隔区2)甲基化特异性引物和内参(ACTB)引物对的引物池，以转化后的DNA为模板，进行PCR扩增，每条引物的终浓度为100 nM。PCR反应体系为10μL转化的DNA，包含上述引物的预混液2.5μL；PCR试剂(Luna®Universal Probe qPCRMaster Mix(NEB)) 12.5μL。PCR反应条件如下：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，56℃ 60秒，15个循环。

4. 荧光PCR检测。将步骤3中的预扩增产物稀释10倍后用于荧光PCR检测。使用如下表2所示的引物和检测探针序列，并且同时对内参基因ACTB进行检测，作为对照。引物终浓度为500 nM，探针终浓度为200 nM。PCR反应体系包含：10μL的预扩增稀释产物；包含检测位点的引物和探针预混液2.5μL；PCR试剂(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)) 12.5μL。PCR反应条件如下：95℃ 5分钟；95℃ 15秒，56℃ 40秒（采集荧光），50个循环。针对不同基因探针修饰荧光，选择相应检测荧光通道。未检测到扩增信号的靶点Ct值被设定为50。

表2.引物和探针序列

结果

上述检测标志物在术前术后的Ct平均值差异及统计分析汇总如下表，p值统计根据T检验获得。除内参外，其余检测位点术前术后的对比，p值均小于0.05。

表3. 术前术后对比

实施例2. 术后2~6周血浆游离DNA甲基化信号对复发转移的风险评估

共对102例患者采集手术后2~6周血液，按照实施例1检测流程进行血浆游离DNA甲基化检测。随后对该102例患者进行术后随访，随访中位数为10个月，共发现14人出现复发转移(包括原位复发和转移)。以各标志物大于90%特异性（未复发样本检测为阳性的比例小于10%）的Ct设置阳性参考区间，统计各标志物对复发转移的检测灵敏度，统计结果如下表：

表4. 各检测标志物对复发转移的检测灵敏度以及对应的阳性参考区间

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110> 复旦大学附属肿瘤医院

上海鹍远生物技术有限公司

<120> 标志物在预测结直肠癌的复发和/或转移风险中的用途

<130> CPCH2161902N

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<170> PatentIn version 3.3

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