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一种Dxd抗体或其抗原结合片段及其应用

文献发布时间：2023-06-19 18:32:25

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种Dxd抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术

抗体-小分子药物偶联物(Antibody-drug conjugate，ADC)是新一代抗体靶向治疗药物，主要应用于癌症肿瘤的治疗。ADC药物由小分子细胞毒性药物(Drug)、抗体(Antibody)以及连接抗体和细胞毒性药物的连接子(Linker)三部分组成，小分子细胞毒性药物通过化学偶联的方法结合到抗体蛋白上。临床研究已证明，ADC药物的药效高、在血液中相对稳定，能有效地降低小分子细胞毒性药物(化药)本身对循环系统以及健康组织的毒性，是目前国际上抗癌药物的研发热点。

Dxd是一种抗癌生物碱喜树碱类似物(结构式如上所示)，Dxd利用超螺旋DNA解旋和促进DNA复制调节DNA的拓扑结构，抑制TOP的合成。通过与TOP1，DNA形成稳定的三元复合物，阻滞细胞周期至S期，从而阻止DNA的复制，引起细胞死亡。因此Dxd可作为ADC(抗体-小分子药物偶联物，Antibody-drug conjugate)优选的小分子细胞毒性药物，其中靶向Her2且以Dxd作为小分子细胞毒性药物的Dxd类ADC DS8201已于2019年12月21日被FDA正式批准用于HER2阳性乳腺癌的后线治疗，尚有不少Dxd类ADC目前正处于临床前研究或临床试验阶段。

临床试验中需要对ADC在给药后体内的ADC浓度进行监测以针对性地确定给药剂量，目前尚无能够良好检测样本中Dxd类ADC含量的检测试剂，因此研发出一种能够有效结合Dxd的抗体以便快速对Dxd类ADC进行准确分析。

发明内容

针对现有技术中尚无能够良好检测样本中Dxd的检测试剂和方法的技术问题，本发明提供了一种Dxd抗体或其抗原结合片段及其应用。本发明的Dxd抗体可以高特异性地识别小分子Dxd，且对Dxd具有较高的亲和力，可以实现对样品中Dxd含量的有效检测。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：提供一种Dxd抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区；

所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1为如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列或其变体；所述HCDR2为如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列或其变体；所述HCDR3包含选自如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:37或SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列或其变体；

所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1为如SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR2包含如STN或GTN或DTS或YGS所示的氨基酸序列；所述LCDR3的氨基酸序列包含如SEQID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列或其变体；所述变体在原氨基酸序列上具有1-3个氨基酸残基的增加、缺失或替换，并维持所述Dxd抗体或其抗原结合片段的功能。

较佳地，所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，分别如SEQ ID NO:4-6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，分别如SEQ IDNO:35-37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，分别如SEQ ID NO:38-40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，分别如SEQ ID NO:77-79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

和/或，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、STN、SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，分别如SEQ ID NO:9、GTN、SEQ ID NO:10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，分别如SEQ ID NO:41、GTN、SEQ ID NO:42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，分别如SEQ ID NO:43、DTS、SEQ ID NO:44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，分别如SEQ ID NO:80、YGS、SEQ ID NO:81所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

更佳地，所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、STN、SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、GTN、SEQ ID NO:10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:35-37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:41、GTN、SEQ ID NO:42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:38-40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:43、DTS、SEQ ID NO:44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:77-79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:80、YGS、SEQ ID NO:81所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在本技术方案中，所述重链可变区还可包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11-14所示；或，所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15-18所示；或，所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:45-48所示；或，所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:53-56所示；或，所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:82-85所示。

和/或，所述轻链可变区包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，所述的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19-22所示；或，所述的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23-26所示；或，所述的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:49-52所示；或，所述的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:57-60所示；或，所述的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:86-89所示。

较佳地：

所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11-14所示的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19-22所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4；或，所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15-18所示的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23-26所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4；或，所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:45-48所示的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:49-52所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4；或，所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:53-56所示的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:57-60所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4；或，所述重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:82-85所示的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO:86-89所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。

在一些优选的实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:64或SEQID NO:91所示氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。

较佳地，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；或，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；或，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；或，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；或，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。

更佳地，所述重链可变区由如SEQ ID NO:31的第1-378位所示的核苷酸序列编码，所述轻链可变区由如SEQ ID NO:32的第1-327位所示的核苷酸序列编码；或所述重链可变区由如SEQ ID NO:33的第1-357位所示的核苷酸序列编码，所述轻链可变区由如SEQ IDNO:34的第1-327位所示的核苷酸序列编码；或所述重链可变区由如SEQ ID NO:65的第1-357位所示的核苷酸序列编码，所述轻链可变区由如SEQ ID NO:66的第1-327位所示的核苷酸序列编码；或所述重链可变区由如SEQ ID NO:67的第1-345位所示的核苷酸序列编码，所述轻链可变区由如SEQ ID NO:68的第1-318位所示的核苷酸序列编码；或所述重链可变区由如SEQ ID NO:92的第1-363位所示的核苷酸序列编码，所述轻链可变区由如SEQ ID NO:93的第1-321位所示的核苷酸序列编码。

在一些优选的实施方案中，所述Dxd抗体或其抗原结合片段包括鼠或人抗体恒定区或其突变；所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b3或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区，所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区。由此，所述Dxd抗体或其抗原结合片段包括重链和轻链。

较佳地，所述突变与所述鼠或人抗体恒定区的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或者99％的同源性。

更佳地，所述Dxd抗体或其抗原结合片段中，所述重链包括如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，所述轻链包括如SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列；或，所述重链包括如SEQ IDNO:71所示的氨基酸序列，所述轻链包括如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列；或，所述重链包括如SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列，所述轻链包括如SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列或，所述重链包括如SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列，所述轻链包括如SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列；或，所述重链包括如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列，所述轻链包括如SEQID NO:95所示的氨基酸序列。

进一步更佳地，所述Dxd抗体或其抗原结合片段中，所述重链由如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列编码，所述轻链由如SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列编码；或，所述重链由如SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列编码，所述轻链由如SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列编码；所述重链由如SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列编码，所述轻链由如SEQ ID NO:66所示的核苷酸序列编码；或，所述重链由如SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列编码，所述轻链由如SEQ ID NO:68所示的核苷酸序列编码；或，所述重链由如SEQ ID NO:92所示的核苷酸序列编码，所述轻链由如SEQ ID NO:93所示的核苷酸序列编码。

更佳地，所述Dxd抗体或其抗原结合片段的结构包括免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’)

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：提供一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如技术方案之一所述的Dxd抗体或其抗原结合片段。

较佳地，编码所述Dxd抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列中，编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:31的第1-378位所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:32的第1-327位所示；或编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:33的第1-357位所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:34的第1-327位所示；或编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:65的第1-357位所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:66的第1-327位所示；或编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:67的第1-357位所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:68的第1-327位所示。

更佳地，编码所述的Dxd抗体或其抗原结合片段的重链的核苷酸序列如SEQ IDNO:31所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；或编码重链的核苷酸序列如SEQID NO:33所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示；或编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示；或编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：提供一种表达载体，所述表达载体包括如技术方案之二所述的分离的核酸。例如，所述表达载体的出发载体为pEE12.4。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如技术方案之二所述的分离的核酸或技术方案之三所述的表达载体。

较佳地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

更佳地，所述原核细胞为大肠杆菌；所述真核细胞为CHO细胞。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：提供一种制备如技术方案之一所述的Dxd抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，培养如技术方案之四所述的宿主细胞，使其在适合的条件下表达所述Dxd抗体或其抗原结合片段即得。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之六为：提供一种检测组合物，所述检测组合物包含如技术方案之一所述的Dxd抗体或其抗原结合片段。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之七为：提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如技术方案之一所述的Dxd抗体或其抗原结合片段、技术方案之二所述的分离的核酸、技术方案之三所述的表达载体、技术方案之四所述的宿主细胞和/或技术方案之六所述的检测组合物。

较佳地，所述试剂盒还包括(i)施用抗体或其抗原结合片段、分离的核酸、表达载体、转化体或检测组合物的装置；和/或(ii)使用说明。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之八为：提供一种检测样品中Dxd的方法，所述方法使用如技术方案之一所述的Dxd抗体或其抗原结合片段、技术方案之六所述的检测组合物和/或技术方案之七所述的试剂盒与样品进行反应。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之九为：提供一种如技术方案之一所述的Dxd抗体或其抗原结合片段、技术方案之二所述的分离的核酸、技术方案之三所述的表达载体、技术方案之六所述的检测组合物或技术方案之七所述的试剂盒在检测Dxd中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十为：提供一种Dxd抗体或其抗原结合片段，其可识别Dxd或含Dxd的分子，所述含Dxd的分子例如为ADC029和ADC-8201；所述ADC029和ADC-8201如以下式子所示：

术语

本发明中，术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一，所述6个CDR的定义由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR H1、CDR H2、CDR H3或H1、H2、H3)。

本发明中，术语“抗体”可互换地用来指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本发明中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本发明中缩写为VL)和轻链恒定区(本发明中缩写为CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完全抗体形成“Y”形状。Y的茎由两条重链的第二和第三恒定区(并且对于IgE和IgM，第四恒定区)结合在一起组成，并且二硫键(链间)在铰链中形成。重链γ、α和δ具有由三个串联(成一行)Ig结构域构成的恒定区，和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂包括结合到单个轻链的可变和恒定区的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。

本发明中，“Fab”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。“Fab’”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)

本发明中，所述的scFv(single chain antibody fragment，单链抗体)可为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)]。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G

如本领域已知，在本发明中可交换使用的“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。

如下进行序列之间序列同源性(即同一性，identity)的计算。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同源性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同源性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同源性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同源性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12、空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同源性百分数。额外地或备选地，可以进一步使用本发明所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

如本发明所用，“表达载体”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。表达载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明公开了一种Dxd抗体或其抗原结合片段及其应用。本发明的Dxd抗体可以高特异性地识别小分子Dxd，且对Dxd具有较高的亲和力，可以实现对样品中Dxd含量的有效检测，在临床检测Dxd中具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1.Dxd免疫原的制备

GGFG-Dxd(结构如下)分别偶联KLH(Sigma-Aldrich，货号H1757)和BSA(Sigma-Aldrich，货号A1933)作为免疫原。GGFG-Dxd参照WO2015146132A1报道的已知的方法进行合成而得。

GGFG-Dxd偶联KLH制备Dxd-KLH：首先称取3mg KLH，用乙二胺四乙酸(5mM)和碳酸氢钠(0.1M)的缓冲液(pH8.0)溶解成10mg/ml溶液(共0.3ml)。接着称取一定量2`亚氨基硫烷盐酸盐(生工，货号C100211)用无菌水溶解成2mg/ml(14mM)溶液。向KLH溶液中加入0.25ml的2`亚氨基硫烷盐酸盐溶液，KLH氨基数目和2`亚氨基硫烷盐酸盐摩尔比为1:2，室温反应2小时得到KLH-SH。用乙二胺四乙酸(5mM)和PBS(0.1M)的缓冲液(pH 6.5)室温透析2h。然后称取GGFG-Dxd 1.2mg，用二甲基亚砜溶解成10mg/ml的溶液。向前述制备得到的KLH-SH中加入配制好的1.2mg GGFG-Dxd的二甲基亚砜溶液，室温反应2小时。用1×PBS，pH7.4 4℃透析过夜，换液一次，制得Dxd-KLH备用。

GGFG-Dxd偶联BSA制备Dxd-BSA：称取3mg BSA，用乙二胺四乙酸(5mM)和碳酸氢钠(0.1M)的缓冲液(pH8.0)溶解成10mg/ml的溶液(共0.3ml)。接着称取一定量2`亚氨基硫烷盐酸盐用无菌水溶解成2mg/ml(14mM)的溶液。向BSA溶液中加入0.255ml的2`亚氨基硫烷盐酸盐溶液。BSA 氨基数目和2`亚氨基硫烷盐酸盐摩尔比为1:2。室温反应2小时得到BSA-SH。用乙二胺四乙酸(5mM)和PBS(0.1M)的缓冲液(pH6.5)室温透析2小时。称取GGFG-Dxd1.3mg,用二甲基亚砜溶解成10mg/ml溶液。2小时后取出BSA-SH，向前述制备得到的BSA-SH中向加入配制好的1.3mgGGFG-Dxd的二甲基亚砜溶液，室温反应2小时。用1×PBS，pH7.4 4℃透析过夜，换液一次制得Dxd-BSA备用。

实施例2.动物免疫

免疫共分为两组开展分别采用不同的抗原进行免疫，A组5只Balb/c小鼠分别编号#1363、#1364、#1365、#1366和#1367，用Dxd-KLH进行免疫，B组5只Balb/c小鼠分别编号#1368、#1369、#1370、#1371和#1372，用Dxd-BSA免疫。免疫开始前4天采血备用，第0天、第14天、第28天、第42天分别进行免疫，共4轮免疫。首次免疫每只小鼠用50μg抗原进行皮下注射，第2、3、4轮免疫每只小鼠用25μg抗原进行皮下注射。第2、3轮免疫后第7天对小鼠进行采血。间接ELISA和竞争ELISA检测免疫动物血清以此确定免疫应答的水平。第4轮免疫后进行细胞融合。

间接ELISA方法检测血清滴度：在第3次免疫7天后，采用疏水性质的酶标板(Nunc，货号446442)，分别以1μg/ml的Dxd-BSA和Dxd-KLH包被酶标板条分别检测Dxd-KLH免疫组和Dxd-BSA免疫组，包被液为PBS(pH7.4)，血清分别稀释成1:1000(滴度A)、1:2000(滴度B)、1:4000(滴度)、1:8000(滴度D)、1:16000(滴度E)、1:32000(滴度F)、1:64000(滴度G)、1:128000(滴度H)、1:256000(滴度I)和1:512000(滴度J)后加入酶标板条与小分子进行结合，酶联二抗辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠Fc的IgG(Bethyl Laboratories，货号A90-231P)检测，OD655nm波长为参比波长(Molecular Devices，型号SpectraMax M2e)，OD450nm处测定吸光度，其中10只小鼠血清滴度均较强，稀释512000倍的信噪比均大于3。结果见表1。

表1.小鼠血清滴度检测值

竞争ELISA方法检测10只小鼠血清：分别采用0.1μg/ml的Dxd-BSA和Dxd-KLH包被酶标板条，分别检测Dxd-KLH免疫组和Dxd-BSA免疫组小鼠血清。其中包被液为PBS(pH7.4)，血清分别稀释1:1000(滴度A)、1:2000(滴度B)、1:4000(滴度C)、1:8000(滴度D)、1:16000(滴度E)、1:32000(滴度F)、1:64000倍数(滴度G)、1:128000(滴度)、1:256000(滴度I)和1:512000(滴度J)后与0μg/ml或者100μg/ml的Dxd加入酶标板条，酶联二抗Goat Anti-MouseIgG,FcγFragment Specific检测，OD655nm波长为参比波长，OD450nm处测定吸光度，过量Dxd小分子竞争结合抗血清，其中#1363、#1364、#1365、#1366、#1367和#1368编号小鼠血清均具有较强的竞争结合活性，综合间接ELISA检测的滴度数据，选择小鼠#1363进行细胞融合实验，所得结果见表2。

表2.小鼠血清竞争ELISA检测值

实施例3.细胞融合与母克隆筛选

采用电融合方法进行细胞融合，共2轮。平均融合效率约2500个脾细胞能融合产生1个杂交瘤细胞，每轮融合的所有细胞均铺到96孔板中进行扩增培养。对融合细胞产生的母克隆上清进行ELISA筛选，采用间接ELISA方法筛选阳性母克隆，Dxd-KLH免疫的小鼠杂交瘤细胞母克隆采用1μg/ml的Dxd-BSA包被酶标板条用于检测，分别加入免疫的小鼠杂交瘤细胞母克隆上清原液到酶标板条中，然后加入酶联二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Fc的IgG进行显色。OD值越高，结合于酶标板上的Dxd-BSA抗体浓度越高。筛选到杂交瘤细胞阳性母克隆编号分别为3B8、4A9、5B3、6A11、6C2、8A2、8A6、8B8、9H10、11C4、12E1、12G9、14D10、14E3和15H3，检测的ELISA结果见表3。

表3.Dxd免疫的小鼠杂交瘤细胞母克隆的ELISA检测结果

竞争ELISA检测母克隆与Dxd的结合活性，1μg/ml Dxd-BSA包被，加入等体积的10倍稀释的杂交瘤上清和不同浓度的Dxd(0、0.01和0.1μg/ml，CAS号：1599440-33-1)，包被于酶标板条的Dxd-BSA和加入的Dxd竞争结合上清中的抗体，加入的小分子量越多，与包被于酶标板条的Dxd结合抗体越少，洗板后，加入酶联二抗辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠Fc的IgG(稀释倍数：20000)进行显色反应，5B3、9H10、14E3、15H3，8B8和12G9竞争结合Dxd的活性较强，结果见表4。

表4.母克隆竞争ELISA检测值(OD

采用竞争ELISA方法检测5B3、9H10、14E3、15H3，8B8和12G9克隆与含有Dxd

表5母克隆与ADC-8201竞争ELISA检测值(OD

表6母克隆与ADC029竞争ELISA检测值(OD

实施例4.亚克隆筛选

采用有限稀释法对阳性母克隆5B3、8B8、9H10、12G9和14E3进行亚克隆，以确保最终拿到单克隆细胞。亚克隆阶段进行3轮，采用竞争ELISA方法进行亚克隆筛选，每个母克隆选择2个稳定的子克隆进行扩增和低温保存。低温冻存前每个子克隆收集5ml上清，按照亚类试剂盒的说明书(购自southern biotech，5300-04)对所有亚型进行鉴定。

竞争ELISA分析亚克隆细胞培养上清5B3-1、5B3-2，8B8-1、8B8-2，9H10-1、9H10-2，12G9-1、12G9-2，14E3-1、14E3-2，0.5μg/ml Dxd-BSA包被酶标板条(购自Nunc，446442)，加入等体积150倍稀释的亚克隆细胞5B3-1、5B3-2，8B8-1、8B8-2，9H10-1、9H10-2，12G9-1、12G9-2，14E3-1、14E3-2上清和不同浓度的ADC-8201和ADC029(0、0.4、4μg/ml)，加入酶联二抗进行显色反应，检测OD值越低抗体对小分子的特异性结合越好。ELISA检测结果见表7和表8。结果显示5B3-1、5B3-2，8B8-1、8B8-2，9H10-1、9H10-2共6个亚克隆只能与ADC-8201结合；12G9-1、12G9-2，14E3-1、14E3-2共4个亚克隆均具有与ADC-8201和ADC029结合的活性。

表7.亚克隆与ADC-8201竞争ELISA检测值(OD

表8.亚克隆与ADC029竞争ELISA检测值(OD

实施例5.单抗鉴定

对单克隆12G9-2、14E3-1和14E3-2进行抗体生产，采用Protein A/G亲和层析方法(Cytiva，货号29049104)纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液(PBS)中。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，间接ELISA进行滴度检测，竞争ELISA进行鉴定，NanoDrop2000(Thermo)测定抗体浓度。

采用间接ELISA方法检测单抗滴度。采用疏水性质的酶标板(购自Nunc，446442)，以1μg/ml的dxd-BSA包被酶标板条，包被液为PBS(pH7.4)，12G9-2抗体稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000和512000倍后至终浓度1000ng/ml(浓度1)、500ng/ml(浓度2)、250ng/ml(浓度3)、125ng/ml(浓度4)、62.50ng/ml(浓度5)、31.25ng/ml(浓度6)、15.62ng/ml(浓度7)、7.81ng/ml(浓度8)、3.90ng/ml(浓度9)、1.95ng/ml(浓度10)，各100μl加入酶标板条与Dxd-BSA进行结合，酶联二抗辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠Fc的IgG进行显示反应，OD

表9.Dxd抗体滴度检测值(OD

竞争ELISA检测，0.5μg/ml包被Dxd-BSA，把纯化后的12G9-2、14E3-1和14E3-2抗体用PBS稀释至30ng/ml和不同浓度的Dxd(30000.000ng/ml、10000.000ng/ml、3333.333ng/ml、1111.111ng/ml、370.370ng/ml、123.457ng/ml、41.152ng/ml、13.717ng/ml、4.572ng/ml、1.524ng/ml、0.508ng/ml)等体积加入板孔中，让包被的Dxd-BSA和加入的Dxd竞争结合抗体，加入的小分子量越多，和包被的小分子结合的抗体越少，洗板后加入二抗辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠Fc的IgG，OD值越低说明抗体对Dxd的特异性结合活性越强。Dxd单抗12G9-2、14E3-1和14E3-2竞争结合结果符合预期，对Dxd具有较强的结合专属性。

表10.12G9-2、14E3-1和14E3-2抗体的竞争ELISA检测结果(OD

实施例6.单抗序列鉴定

对12G9-2、14E3-1、14E3-2、5B3-2、8B8-2和9H10-2杂交瘤细胞进行复苏，新鲜收集的杂交瘤细胞沉淀细胞数5×10

表11.各抗Dxd单抗的HCDR氨基酸序列和LCDRs氨基酸序列

由上表11信息可知，单抗12G9-2与14E3-1的HCDR2、LCDR1和LCDR3的氨基酸序列完全相同，HCDR1与LCDR2的大部分氨基酸序列相同，HCDR3的氨基酸序列的C端与N端部分氨基酸残基相同。可见两个单抗在识别Dxd上具有相近的原理，可能识别相同或相似的抗原表位。5B3-2与14E3-1相比，LCDR1和LCDR2的氨基酸序列完全相同，LCDR3仅相差一个氨基酸。8B8-2与12G9-2相比，HCDR1与HCDR2仅相差一个氨基酸。因此单抗5B3-2、8B8-2与12G9-2、14E3-1可能识别相同或相似的抗原表位。

表12.各抗Dxd单抗的HFR氨基酸序列和LHRs氨基酸序列

表13.各抗Dxd单抗的轻重链可变区氨基酸序列

表14.各抗Dxd单抗的轻重链核酸序列和氨基酸序列

实施例7.抗体亲和力测定

采用表面等离子共振(GE，型号Biacore T200)分析技术检测抗体1H3-1、12G9-2和14E3-1与Dxd的亲和力常数(KD)。将Dxd-BSA通过氨基共价偶联的方法固定于CM5芯片表面(GE Healthcare)，用缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％Tween 20,pH7.4)稀释抗体12G9-2和14E3-1至不同浓度：3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM，分别注入芯片，进样流速为30μL/min，样品结合时间为300s,解离时间为600s。每次结合解离后，芯片表面用50mM盐酸进行再生，再生时间为60s，进样流速为100μL/min。测定抗体12G9-2和14E3-1与Dxd的亲和力常数检测结果见下表15。

表15.亲和力测定值

实施例8.ADC-8201和ADC029抗体偶联药物的鉴定

ELISA检测用包被液(15.1mmol/L碳酸钠，34.88mmol/L碳酸氢钠，pH 9.6)稀释12G9-2抗体至2μg/ml，4℃包被过夜，每孔加入200μl的封闭液(10.14mmol/L磷酸氢二钠，1.76mmol/L磷酸二氢钾，137mmol/L氯化钠，2.68mmol/L氯化钾，pH7.4，0.05％吐温20，3％BSA的溶液)室温孵育2个小时，分别加入梯度浓度的ADC-8201和ADC029(梯度浓度分别为1000ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、0.167ng/mL和0.017ng/mL)各100μL，室温下200rpm，震摇1小时。甩板弃液用洗涤液(10.14mmol/L磷酸氢二钠，1.76mmol/L磷酸二氢钾，0.137mol/L氯化钠，2.68mmol/L氯化钾，0.05％吐温20)洗板，重复3次，拍干。稀释液稀释生物素化的抗原至50ng/mL，以100μL/孔加入酶标板条室温下200rpm，震摇1小时。甩板弃液用洗涤液洗板，重复3次，拍干。100μL/孔加入二抗辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠Fc的IgG，TMB显色。将96孔酶标板放入酶标仪，以450nm为检测波长，650nm为参比波长双波长读数。以ADC浓度为X轴，对应的信号值读数为Y轴，选取四参数方程绘制剂量反应曲线，所得结果如表16所示。

表16.Dxd单抗与含有Dxd的抗体偶联药物的竞争结合情况

SEQUENCE LISTING

<110> 上海复旦张江生物医药股份有限公司

<120> 一种Dxd抗体或其抗原结合片段及其应用

<130> P21015301C

<160> 95

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 HCDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 HCDR2

<400> 2

Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr

1 5

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 HCDR3

<400> 3

Ala Arg Val Pro Ile Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Val Asn Tyr Val

1 5 10 15

Met Asp Tyr

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 HCDR1

<400> 4

Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 HCDR2

<400> 5

Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 HCDR3

<400> 6

Ala Arg Asn Ser Arg Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 LCDR1

<400> 7

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 LCDR3

<400> 8

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 LCDR1

<400> 9

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 LCDR3

<400> 10

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val

1 5

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 HFR1

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 HFR2

<400> 12

Ile Leu Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Glu

<210> 13

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 HFR3

<400> 13

Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ser Arg Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 HFR4

<400> 14

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 HFR1

<400> 15

Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 HFR2

<400> 16

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Glu

<210> 17

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 HFR3

<400> 17

Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 HFR4

<400> 18

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 LFR1

<400> 19

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 LFR2

<400> 20

Ala Asn Trp Val Gln Glu Leu Ile Gly Lys Pro Asp His Leu Phe Thr

1 5 10 15

Gly Leu Ile Gly

<210> 21

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 LFR3

<400> 21

Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly

1 5 10 15

Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Ile Tyr Phe Cys

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 LFR4

<400> 22

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 23

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 LFR1

<400> 23

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 LFR2

<400> 24

Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 LFR3

<400> 25

Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr

1 5 10 15

Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 LFR4

<400> 26

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 27

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 VH

<400> 27

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Leu Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Pro Ile Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Val Asn Tyr Val

100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 28

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 VH

<400> 28

Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Ser Arg Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2 VL

<400> 29

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Ser Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 30

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1 VL

<400> 30

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 31

<211> 1350

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2重链核酸

<400> 31

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagt ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggctt caccttcacc aactactgga tactctgggt gaatcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaacggtcg tactaagtac 180

agtgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca aatcctcccg tacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagtccca 300

atttattact acggtggtag ctacgtaaac tatgttatgg actactgggg tcaaggaacc 360

tcagtcaccg tctcctcagc caaaacgaca cccccatctg tctatccact ggcccctgga 420

tctgctgccc aaactaactc catggtgacc ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct 480

gagccagtga cagtgacctg gaactctgga tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca 540

gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc 600

tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac 660

aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt aagccttgca tatgtacagt cccagaagta 720

tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct 780

aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg 840

tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac 900

agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc atcatgcacc aggactggct caatggcaag 960

gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag 1080

atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc atgataacag acttcttccc tgaagacatt 1140

actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca gcggagaact acaagaacac tcagcccatc 1200

atggacacag atggctctta cttcgtctac agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg 1260

gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact 1320

gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa 1350

<210> 32

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 12G9-2轻链核酸

<400> 32

caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60

acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagtaatt atgccaactg ggtccaagaa 120

aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtagtacca acaaccgagc tccaggtgtt 180

cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240

cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaacca tttggtgttc 300

ggtggaggaa ccaagctgac tgtcctaggc cagcccaagt cttcgccatc agtcaccctg 360

tttccacctt cctctgaaga gctcgagact aacaaggcca cactggtgtg tacgatcact 420

gatttctacc caggtgtggt gacagtggac tggaaggtag atggtacccc tgtcactcag 480

ggtatggaga caacccagcc ttccaaacag agcaacaaca agtacatggc tagcagctac 540

ctgaccctga cagcaagagc atgggaaagg catagcagtt acagctgcca ggtcactcat 600

gaaggtcaca ctgtggagaa gagtttgtcc cgtgctgact gttcc 645

<210> 33

<211> 1329

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1重链核酸

<400> 33

caggtccaac tgctgcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaggctg 60

tcctgcaagg cttctgacta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaacggtcg tactagctac 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaactct 300

aggtacctct actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 360

aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 420

atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 480

aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 540

tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 600

tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 660

tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 720

ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 780

gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 840

cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 900

gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 960

agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1020

gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1080

ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1140

gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1200

ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1260

tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1320

cctggtaaa 1329

<210> 34

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 14E3-1轻链链核酸

<400> 34

caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60

acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagtaact atgccaactg ggtccaagaa 120

aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc tccaggtgtt 180

cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240

cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaacca tttggtgttc 300

ggtggaggaa ccaaactgac tgtcctaggc cagcccaagt cttcgccatc agtcaccctg 360

tttccacctt cctctgaaga gctcgagact aacaaggcca cactggtgtg tacgatcact 420

gatttctacc caggtgtggt gacagtggac tggaaggtag atggtacccc tgtcactcag 480

ggtatggaga caacccagcc ttccaaacag agcaacaaca agtacatggc tagcagctac 540

ctgaccctga cagcaagagc atgggaaagg catagcagtt acagctgcca ggtcactcat 600

gaaggtcaca ctgtggagaa gagtttgtcc cgtgctgact gttcc 645

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 HCDR1

<400> 35

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile

1 5

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 HCDR2

<400> 36

Ile Asn Pro Tyr Tyr Val Ser Thr

1 5

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 HCDR3

<400> 37

Ala Arg Tyr Asn Gly Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 HCDR1

<400> 38

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp

1 5

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 HCDR2

<400> 39

Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 HCDR3

<400> 40

Ala Arg Asn Ser Tyr Asp Asp Tyr

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 LCDR1

<400> 41

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 LCDR3

<400> 42

Val Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val

1 5

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 LCDR1

<400> 43

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 LCDR3

<400> 44

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

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<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 HFR1

<400> 45

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Thr Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

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<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 HFR2

<400> 46

Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Ser

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<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 HFR3

<400> 47

Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

<210> 48

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 HFR4

<400> 48

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 49

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 LFR1

<400> 49

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 50

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 LFR2

<400> 50

Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 51

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 LFR3

<400> 51

Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly

1 5 10 15

Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Ile Tyr Phe Cys

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 LFR4

<400> 52

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 53

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 HFR1

<400> 53

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 54

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 HFR2

<400> 54

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 55

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 HFR3

<400> 55

Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 HFR4

<400> 56

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 57

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 LFR1

<400> 57

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

20 25

<210> 58

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 LFR2

<400> 58

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 59

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 LFR3

<400> 59

Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

<210> 60

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 LFR4

<400> 60

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 61

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 VH

<400> 61

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Thr Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

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Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2 VL

<400> 62

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 63

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 VH

<400> 63

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Ser Tyr Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 64

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8B8-2 VL

<400> 64

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 65

<211> 1329

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5B3-2重链核酸

<400> 65

gagatccagc tgcagcagac tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tgctctgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaagt attaatcctt actatgttag tactagctac 180

aatctgaaat tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 240

atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatacaac 300

ggccttgact atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc 360