一种NAD+的制备方法及NMNAT的应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种NAD+的制备方法及烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶在制备NAD+中的应用。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，缩写NAD+)，以及它相应的还原态(NADH)，就是通常所说的辅酶I，也称二磷酸烟苷，其存在于每一个细胞中，参与上千个反应。在哺乳动物体内存在氧化型(NAD+)和还原型(NADH)两种状态，氧化型(NAD+)在260nm处具有最大紫外吸收光谱，从底物中接受一个带电的氢分子(H+)和两个电子，转换为还原型(NADH)，在340nm处有最大吸收。

NAD+是三羧酸循环的重要辅酶，促进糖、脂肪、氨基酸的代谢，参与能量的合成；NAD+又是辅酶I消耗酶的唯一底物(DNA修复酶PARP的唯一底物、长寿蛋白Sirtuins的唯一底物、环ADP核糖合成酶CD38/157的唯一底物)。NAD+的体内代谢途径包括：(1)Preiss-Handler途径；(2)从头合成途径；(3)补救合成途径。无论哪一种途径最后都会经过NMN被NMNAT1-3酶的催化转变为NAD+的步骤。研究表明，随着人体年龄的增长，NAD+也会随之骤减，从而导致一系列的健康问题，因此补充NAD+成为当下的研究热点。NAD+也可通过体外酶催化转化法制备，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide mononucleotideadenylyltransferase,NMNAT)可在体外将前体烟酰胺单核苷酸(NMN)和三磷酸腺苷(ATP)催化合成NAD+。

专利公开文本CN105755019A公开了一种来源于热杆菌属Methanothermobactersp.CaT2的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因(该专利中SEQ ID NO:1)，并利用其在体外将烟酰胺单核苷酸NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+，底物NMN浓度100mmol/L时，对底物NMN的转化率均可达到99.0％。专利公开文本CN107653257A公开了以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主对NMNAT(氨基酸序列为该专利中的SEQ ID NO:2)进行重组表达，得到的烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶比活力可达40U/mg，但是没有给出催化数据。专利授权公告文本CN103710321B公开了来自Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661(詹氏甲烷球菌属)的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶，其核苷酸序列如该专利的序列1所示(参考GenBank L77117)，氨基酸序列如该专利的序列2所示(参考GenBank NP_247520)，并利用其进行突变，获得突变体F119Y、D149E、S59T，突变体的催化活性比亲本高出50％，将NMNAT进行固定化用于催化NMN制备NAD+，底物NMN浓度为5mM时，NMN转化率超过80％。

上述现有技术中，这些酶催化的底物浓度都较低(不高于100mmol/L)，NAD+的产量较低。面对市场对NAD+的需求扩大，需要探索更多的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶用于催化制备NAD+，并且达到酶催化的底物浓度高，底物转化率高、反应成本低的技术效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为克服现有的NAD+酶催化转化法适用的底物浓度较低，进而NAD+产量较低的缺陷，提供一种NAD+的制备方法及烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶在制备NAD+中的应用。本发明的发明人意外发现一些烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶可在高浓度底物的条件下催化NMN生成NAD+，且底物转化率较高。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种NAD+的制备方法，其包括以下步骤：在反应体系中，使用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamidemononucleotide adenylyltransferase,NMNAT)催化NMN和ATP或其二钠盐，从而合成NAD+，其中所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶选自GenBank登录号为WP_137651209.1、SUF38787.1、EAA7244348.1、WP_013799818.1和WP_011972696.1的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶中的一种或多种。

本发明的制备方法的反应式如下：

较佳地，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的浓度为0.01-2mg/ml，优选为0.02-1mg/ml，更优选为0.04-0.08mg/ml。

本发明中，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶可为纯酶液或粗酶液，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶为纯酶液时，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶在所述反应体系中的浓度可为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml或6mg/ml。当使用所述粗酶液时，本领域技术人员可以容易地确定所述粗酶液中烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的含量，并确保所述粗酶液加入所述反应体系后，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶在所述反应体系中的浓度与前述使用所述纯酶液时保持一致。

在一优选，所述粗酶液通过如下方式制备：在液体培养基中培养烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶生产菌株，至进入生长对数期初期例如OD600为0.3-0.4时添加本领域常规浓度例如终浓度0.1mM IPTG并于25℃诱导12～20h，例如16h，离心弃去上清，收集湿菌体。将上述湿菌体悬浮于缓冲液，配置成菌体终浓度例如为0.1g/ml的溶液，均质破碎，离心去除沉淀，所得上清即为含有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的粗酶液。

较佳地，所述NMN的浓度为150-600mM，优选为200-500mM，更优选为350-480mM；

和/或，所述ATP或其二钠盐与所述NMN的摩尔比为1:1-3:1，优选为1:1-2:1。

较佳地，其特征在于，所述反应体系还包括MgCl

较佳地，所述反应体系还包括缓冲液，所述缓冲液优选Tris-HCl缓冲液，本领域技术人员可以常规选择所述Tris-HCl缓冲液的终浓度。

较佳地，所述反应体系中，反应pH为7-8；和/或，反应温度为30-40℃；和/或，反应时间为6-18h；和/或，在反应的过程中进行搅拌，所述搅拌的转速为200-400rpm。

在本发明一具体实施例中，所述反应体系包括448.8mM的NMN、0.04mg/ml的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶、745.2mM的ATP二钠盐、15.75mM的MgCl

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶在制备NAD+中的应用，其中所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶选自GenBank登录号为WP_137651209.1、SUF38787.1、EAA7244348.1、WP_013799818.1和WP_011972696.1的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶中的一种或多种。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种组合物，所述组合物包括烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶，所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶选自GenBank登录号为WP_137651209.1、SUF38787.1、EAA7244348.1、WP_013799818.1和WP_011972696.1的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶中的一种或多种；优选地，所述组合物包括GenBank登录号为SUF38787.1和EAA7244348.1的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种试剂盒，所述试剂盒包括如本发明技术方案之三所述的组合物。优选地，所述试剂盒还包括NMN、ATP或其二钠盐、MgCl

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明提供的NAD+的制备方法可用于浓度高达400mM底物NMN，远高于现有技术水平；同时在高底物浓度条件下，底物转化率可达90％以上，最高可达99.8％，大大提升了NAD+的生产效率。

附图说明

图1为底物NMN对照品图谱。

图2为底物ATP对照品图谱。

图3为产物NAD+对照品图谱。

图4为实施例6中专利CN105755019A对比氨基酸序列的反应液图谱。

图5为实施例6中Enz.11即PT023反应液图谱。

图6为实施例6中Enz.09即PT020反应液图谱。

图7为实施例6中Enz.08即PT019反应液图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

pET28a(+)购买自Novagen公司；DpnI酶购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司；NdeI酶、HindIII酶购买自Thermo Fisher公司，E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

NMN由弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司生产(参见http://abiochem.webd.testwebsite.cn/prod-c/typeid/4.html，CAS No.1094-61-7)。

NAD+对照品来自邦泰生物工程(深圳)有限公司。

高效液相色谱(HPLC)分析检测方法：

用配备紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，色谱柱型号Welch Ultimate AQ-C18，5um，4.6*250mm，溶液缓冲液为0.05mol/L磷酸氢二铵：10％四丁基氢氧化铵水溶液＝91:1，磷酸调节PH至3.6，流动相为乙腈：缓冲液＝8:92，柱温25℃，流速1.0mL/min，检测波长254nm，运行时间35min。

底物NMN对照品的保留时间为：2.773min，见图(1)。

底物ATP对照品的保留时间为：24.564min，见图(2)。

对照品NAD+的保留时间为：4.399min，见图(3)。

实施例1烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的基因获得

本发明筛选的部分烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因的GeneBank登录号如表1所示，所有基因均由生工生物工程(上海)股份有限公司(合成，所用酶切位点为Nde I、HindIII，克隆至pET28a载体，获得含有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因的重组质粒，使得N端6His标签可以表达，并用于后期纯化。

表1基因列表

实施例2烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的诱导表达

将已经构建好的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)宿主，涂布50μg/mL卡那抗性平板，37℃培养16h，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃220rpm培养至OD600至0.6-0.8时得种子液，再将种子液以1％接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，37℃220rpm培养至OD600至0.3-0.4时添加终浓度0.1mM IPTG于220rpm25℃诱导16h，4000rpm离心20min，弃去上清，收集湿菌体，保存于-20℃，备用。

实施例3酶的分离与纯化

称取上述所得湿菌体5g，悬浮于50ml 100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4，4℃600Bar均质破碎，12000rpm离心5min，去除沉淀，所得上清即为含有烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶粗酶液，用Bradford法蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

将粗酶液用Ni柱纯化，即可得到纯酶液。用Bradford法蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，用100mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4，统一稀释至终浓度0.2mg/mL，于-20℃保存，备用。

实施例4酶的初筛

称取100mg NMN与330mg ATP二钠盐于50mL三角瓶，分别加入5mL100mM pH7.5Tris-HCl、0.015gMgCl

表2转化结果

实施例5烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶粗酶液用于制备NAD+放大反应

称取15g NMN与28.5g ATP二钠盐于500mL三角瓶，加入60mL100mM pH7.5 Tris-HCl，待完全溶解后调pH至7.5，加0.15g MgCl

表3 HPLC检测结果

实施例6烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶纯酶用于制备NAD+放大反应

称取15g NMN与28.5g ATP二钠盐于500mL三角瓶，加入60mL100mM pH7.5 Tris-HCl，待完全溶解后调pH至7.5，加0.15g MgCl

表4 HPLC检测结果

其中Enz.08的转化率为99.8％，产物NAD+含量为296g/L，谱图如图7所示。