一株重组菌株及其生产氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及重组微生物领域，特别涉及构建含有突变的waaA或编码突变waaA的核苷酸序列的菌株生产苏基酸。

背景技术

L-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等领域中。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，有多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第56至18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3:149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。梅花集团申请的中国专利201611250306.8中，通过强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ-0215-2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。

发明内容

本发明的目的是提高苏氨酸产量。具体地，本发明提供一种突变waaA，所述突变waaA在大肠杆菌中表达后，可提高大肠杆菌合成L-苏氨酸的能力。本发明的探究过程如下：

本发明在对W3110进行紫外诱变后，获得一株高产苏氨酸的诱变菌，并对其进行全基因组测序发现其waaA处存在第48位的突变，为了进一步验证该突变是否有利于苏氨酸的生产，将该突变引入苏氨酸生产菌MHZ-0215-2中，发现其苏氨酸的产量多有提高，因此确定该位点的突变有利于苏氨酸产量的提高。

为了探索该位点的突变与苏氨酸产量提高的内在机理，对突变waaA编码的酶的功能进行研究。waaA编码3-脱氧-D-甘露糖醇-辛酸转移酶，参与细胞外膜脂多糖的生物合成。其蛋白序列中3-23位为信号锚定序列，31-211位为3-脱氧-D-甘露糖醇-辛酸转移酶的催化区，268-269、309-311、35-338位为底物结合区。第48位的脯氨酸位于该酶的催化区域，因此第48位的氨基酸的突变，改变的是该酶的催化功能，从而进一步影响苏氨酸的生产。脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸均为含羟基的氨基酸，其中脯氨酸为非极性氨基酸，丝氨酸和苏氨酸为极性氨基酸，第48位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸不会引起侧链基团的变化，但引起极性的变化，从而造成酶性质的变化。

因此，第一方面，本发明提供一种突变waaA，所述突变waaA是指野生型waaA编码的蛋白氨基酸序列在48位的氨基酸发生改变。

具体地，本发明所述突变waaA编码的蛋白氨基酸序列是，如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列的第48位的脯氨酸突变为含羟基的氨基酸；

进一步地，所述突变waaA编码的蛋白氨基酸序列是，如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列的第48位由脯氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，或所述突变waaA编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示。

本发明提供的突变waaA是，如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列的第142位由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶或腺嘌呤，或所述突变waaA的核苷酸序列如SEQ ID No.15或SEQ IDNo.16所示。

根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护上述突变waaA或上述DNA分子在生产L-苏氨酸或异亮氨酸中的应用。

第二方面，本发明提供一株高产L-苏氨酸的重组菌株的构建方法，包括；

(1)以pTargetF质粒为模板，使用pTF-sgRNA-F/pTF-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(waaA)；

(2)以W3110基因组为模板，使用waaA-UF/waaA C142A-UR引物对或waaA-UF/waaAC142T-UR引物对，扩增出上游同源臂，使用waaA C142A-DF/waaA-DR引物对或waaA C142T-DF/waaA-DR引物对扩增出下游同源臂；以上游同源臂和下游同源臂为模板，使用waaA-UF/waaA-DR引物对，扩增出waaAC142A全长片段或waaA C142T全长片段，也称Donor DNA；

(3)将pCas质粒电转入MHZ-0215-2感受态细胞中，将pTargetF-N20(waaA)质粒和(2)中构建得到的Donor DNA同时电转入MHZ-0215-2(pCas)感受态细胞中。

其中，引物对pTF-sgRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，pTF-sgRNA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；waaA-UF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；waaA-DR的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；waaA C142T-UR的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；waaA C142T-DF的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；waaA C142A-UR的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；waaA C142A-DF的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

第三方面，本发明提供一株重组菌，含有上述的突变waaA或使用上述构建方法构建得到。

进一步地，本发明提供的重组菌为大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌或沙雷氏菌。

第四方面，本发明提供一种生产苏氨酸或异亮氨酸的方法，使用上述重组菌进行发酵得到苏氨酸或异亮氨酸。

根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，上述的突变waaA或上述的重组菌，在提高苏氨酸产量中的应用。

苏氨酸可在胞内降解生成甘氨酸和异亮氨酸，因此本领域的技术人员可以通过强化苏氨酸到异亮氨酸合成路径上的基因，以增强异亮氨酸的合成。本发明提供的有利于苏氨酸产量提高的方法，也有利于其下游产物异亮氨酸的生产。

因此，本发明还请求保护上述的突变waaA或上述的重组菌，在提高异亮氨酸产量中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一株高产苏氨酸或异亮氨酸的重组菌株，本发明提供的重组菌株的苏氨酸产量为17.59-18.23g/L，重组菌株较野生菌株的苏氨酸产量提高27.46-32.1％。本发明证实了，重组菌株中waaA编码蛋白的催化区发生氨基酸的改变或waaA核苷酸序列的第142位由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶或腺嘌呤，可以明显提高苏氨酸的生产能力。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明公开了高苏氨酸产量的菌种的构建方法及生产苏氨酸的方法。下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明以MHZ-0215-2(菌株保藏号为CGMCC No.13403)为出发菌株，在其基因组上进行相关改造。主要方式为waaA突变。

大肠杆菌的基因组编辑，主要借鉴了Jiang Y等报道的CRISPR-Cas9基因编辑技术(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)。

以下实施例中，所述卡那霉素(Kanamycin)在培养基中的终浓度为50μg/mL，所述壮观霉素(spectinomycin)在培养基中的终浓度为50μg/ml。

以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的高转化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为MHZ-0215-2，属于W3110(埃希氏菌属(Escherichia)。

实施例中所使用引物序列见下表1。

表1引物序列表

实施例1制备waaA 142位核苷酸由胞嘧啶替换为胸腺嘧啶的菌株MHZ-0221-13

(1)pTargetF-N20(waaA C142T)质粒及Donor DNA构建

Step1：以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA-F/pTF-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(waaA)，并进行PCR鉴定及测序验证；Step2：以W3110基因组为模板，选用waaA-UF/waaA C142T-UR引物对，扩增出上游同源臂①；Step3：以W3110基因组为模板，选用waaA C142T-DF/waaA-DR引物对扩增出下游同源臂②；Step4：以①、②为模板，选用waaA-UF/waaA-DR引物对，扩增出waaA C142T全长片段，也称Donor DNA。

(2)感受态细胞制备及电转化

Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；Step2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(3)重组验证

Step1：使用引物对waaA-F/waaA-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；Step2：用引物对waaA-F/waaA-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

(4)构建相关质粒丢失

Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(waaA)质粒已丢失；Step3：挑取pTargetF-N20(waaA)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-13(waaA C142T)菌株。

实施例2制备waaA 142位核苷酸由胞嘧啶替换为腺嘌呤的菌株MHZ-0221-14

(1)pTargetF-N20(waaA C142A)质粒及Donor DNA构建

Step1：以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA-F/pTF-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(waaA)，并进行PCR鉴定及测序验证；Step2：以W3110基因组为模板，选用waaA-UF/waaA C142A-UR引物对，扩增出上游同源臂①；Step3：以W3110基因组为模板，选用waaA C142A-DF/waaA-DR引物对扩增出下游同源臂②；Step4：以①、②为模板，选用waaA-UF/waaA-DR引物对，扩增出waaA C142A全长片段，也称Donor DNA。

(2)感受态细胞制备及电转化

Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；Step2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。Step3：将pTargetF-N20(waaA)质粒和(1)中构建得到的Donor DNA同时电转入MHZ-0215-2(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。

(3)重组验证

Step1：使用引物对waaA-F/waaA-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；Step2：用引物对waaA-F/waaA-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

(4)构建相关质粒丢失

Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(waaA)质粒已丢失；Step3：挑取pTargetF-N20(waaA)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-14(waaAC142A)菌株。

实施例1-2中所获得的产苏氨酸的基因改造菌株的基因型如表2所示。

表2本发明构建的基因工程菌

实施例3产L-苏氨酸基因工程菌摇瓶发酵验证

Step 1:从冻存管中取MHZ-0215-2、MHZ-0221-13、MHZ-0221-14共3株菌，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；Step 2:将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基(见表3)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD

表3种子培养基(g/L)

表4发酵培养基(g/L)

表5产苏氨酸基因工程菌生产力比较

注：*表示P值<0.01，说明其与对照相比有明显差异

由表5可知，本发明所述新型大肠杆菌L-苏氨酸产量均高于各自的对照菌株，其中改造菌株MHZ-0221-13苏氨酸产量为17.59g/L，摇瓶转化率为29.31％，MHZ-0221-13较出发菌苏氨酸产量平均提高27.46％，转化率提高80.93％；改造菌株MHZ-0221-14苏氨酸产量为18.23g/L，摇瓶转化率为30.39％，MHZ-0221-14较出发菌苏氨酸产量平均提高32.10％，转化率提高87.59％。由摇瓶结果可以得出，waaA核苷酸序列的突变可以明显提高苏氨酸的生产能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 梅花（上海）生物科技有限公司

<120> 一株重组菌株及其生产氨基酸的方法

<130> KHP211117787.5

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agttaccgcc atccgctaaa accgttttag agctagaaat agcaa 45

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttttagcg gatggcggta actagtatta tacctaggac tgagct 46

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccataccggg cggtgtggtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttgcatcag gataattctg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggcgttac agaaatatcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgactcttt tgtgtgattg 20

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggtttttac cgccatccgc taaaatcagg cggcattatg ctgcac 46

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgcagcata atgccgcctg attttagcgg atggcggtaa aaaccg 46

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggtttttac cgccatccgc taaaataagg cggcattatg ctgcac 46

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgcagcata atgccgcctt attttagcgg atggcggtaa aaaccg 46

<210> 11

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu

1 5 10 15

Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Ala Pro Ala Tyr Arg

20 25 30

Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Pro

35 40 45

Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala

50 55 60

Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala

85 90 95

Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp

100 105 110

Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile

115 120 125

Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg

130 135 140

Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg

165 170 175

Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val

180 185 190

Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys

195 200 205

Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu

210 215 220

Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr

225 230 235 240

His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu

245 250 255

Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu

260 265 270

Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr

275 280 285

Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val

290 295 300

Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp

305 310 315 320

Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro

325 330 335

Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr

340 345 350

Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu

355 360 365

Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu

370 375 380

Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu

385 390 395 400

Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu

405 410 415

Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His

420 425

<210> 12

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu

1 5 10 15

Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Ala Pro Ala Tyr Arg

20 25 30

Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala

50 55 60

Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala

85 90 95

Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp

100 105 110

Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile

115 120 125

Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg

130 135 140

Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg

165 170 175

Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val

180 185 190

Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys

195 200 205

Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu

210 215 220

Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr

225 230 235 240

His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu

245 250 255

Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu

260 265 270

Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr

275 280 285

Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val

290 295 300

Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp

305 310 315 320

Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro

325 330 335

Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr

340 345 350

Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu

355 360 365

Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu

370 375 380

Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu

385 390 395 400

Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu

405 410 415

Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His

420 425

<210> 13

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu

1 5 10 15

Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Ala Pro Ala Tyr Arg

20 25 30

Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Thr

35 40 45

Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala

50 55 60

Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala

85 90 95

Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp

100 105 110

Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile

115 120 125

Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg

130 135 140

Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg

165 170 175

Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val

180 185 190

Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys

195 200 205

Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu

210 215 220

Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr

225 230 235 240

His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu

245 250 255

Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu

260 265 270

Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr

275 280 285

Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val

290 295 300

Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp

305 310 315 320

Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro

325 330 335

Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr

340 345 350

Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu

355 360 365

Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu

370 375 380

Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu

385 390 395 400

Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu

405 410 415

Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His

420 425

<210> 14

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgctcgaat tgctttacac cgcccttctc taccttattc agccgctgat ctggatacgg 60

ctctgggtgc gcggacgtaa ggctccggcc tatcgaaaac gctggggtga acgttacggt 120

ttttaccgcc atccgctaaa accaggcggc attatgctgc actccgtctc cgtcggtgaa 180

actctggcgg caatcccgtt ggtgcgcgcg ctgcgtcatc gttatcctga tttaccgatt 240

accgtaacaa ccatgacgcc aaccggttcg gagcgcgtac aatcggcttt cgggaaggat 300

gttcagcacg tttatctgcc gtatgatctg cccgatgcac tcaaccgttt cctgaataaa 360

gtcgacccta aactggtgtt gattatggaa accgaactat ggcctaacct gattgcggcg 420

ctacataaac gtaaaattcc gctggtgatc gctaacgcgc gactctctgc ccgctcggcc 480

gcaggttatg ccaaactggg taaattcgtc cgtcgcttgc tgcgtcgtat tacgctgatt 540

gctgcgcaaa atgaagaaga tggtgcacgt tttgtggcgc tgggcgcaaa aaataatcag 600

gtgaccgtta ccggtagcct gaaattcgat atttctgtaa cgccgcagtt ggctgctaaa 660

gccgtgacgc tgcgccgcca gtgggcacca caccgcccgg tatggattgc caccagcact 720

cacgaaggcg aagagagtgt ggtgatcgcc gcacatcagg cattgttaca gcaattcccg 780

aatttattgc tcatcctggt accccgtcat ccggaacgct tcccggatgc gattaacctt 840

gtccgccagg ctggactaag ctatatcaca cgctcttcag gggaagtccc ctccaccagc 900

acgcaggttg tggttggcga tacgatgggc gagttgatgt tactgtatgg cattgccgat 960

ctcgcctttg ttggcggttc actggttgaa cgtggtgggc ataatccgct ggaagctgcc 1020

gcacacgcta ttccggtatt gatggggccg catactttta actttaaaga catttgcgcg 1080

cggctggagc aggcaagcgg gctgattacc gttaccgatg ccactacgct tgcaaaagag 1140

gtttcctctt tactcaccga cgccgattac cgtagtttct atggccgtca tgccgttgaa 1200

gtactgtatc aaaaccaggg cgcgctacag cgtctgcttc aactgctgga accttacctg 1260

ccaccgaaaa cgcattga 1278

<210> 15

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgctcgaat tgctttacac cgcccttctc taccttattc agccgctgat ctggatacgg 60

ctctgggtgc gcggacgtaa ggctccggcc tatcgaaaac gctggggtga acgttacggt 120

ttttaccgcc atccgctaaa atcaggcggc attatgctgc actccgtctc cgtcggtgaa 180

actctggcgg caatcccgtt ggtgcgcgcg ctgcgtcatc gttatcctga tttaccgatt 240

accgtaacaa ccatgacgcc aaccggttcg gagcgcgtac aatcggcttt cgggaaggat 300

gttcagcacg tttatctgcc gtatgatctg cccgatgcac tcaaccgttt cctgaataaa 360

gtcgacccta aactggtgtt gattatggaa accgaactat ggcctaacct gattgcggcg 420

ctacataaac gtaaaattcc gctggtgatc gctaacgcgc gactctctgc ccgctcggcc 480

gcaggttatg ccaaactggg taaattcgtc cgtcgcttgc tgcgtcgtat tacgctgatt 540

gctgcgcaaa atgaagaaga tggtgcacgt tttgtggcgc tgggcgcaaa aaataatcag 600

gtgaccgtta ccggtagcct gaaattcgat atttctgtaa cgccgcagtt ggctgctaaa 660

gccgtgacgc tgcgccgcca gtgggcacca caccgcccgg tatggattgc caccagcact 720

cacgaaggcg aagagagtgt ggtgatcgcc gcacatcagg cattgttaca gcaattcccg 780

aatttattgc tcatcctggt accccgtcat ccggaacgct tcccggatgc gattaacctt 840

gtccgccagg ctggactaag ctatatcaca cgctcttcag gggaagtccc ctccaccagc 900

acgcaggttg tggttggcga tacgatgggc gagttgatgt tactgtatgg cattgccgat 960

ctcgcctttg ttggcggttc actggttgaa cgtggtgggc ataatccgct ggaagctgcc 1020

gcacacgcta ttccggtatt gatggggccg catactttta actttaaaga catttgcgcg 1080

cggctggagc aggcaagcgg gctgattacc gttaccgatg ccactacgct tgcaaaagag 1140

gtttcctctt tactcaccga cgccgattac cgtagtttct atggccgtca tgccgttgaa 1200

gtactgtatc aaaaccaggg cgcgctacag cgtctgcttc aactgctgga accttacctg 1260

ccaccgaaaa cgcattga 1278

<210> 16

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgctcgaat tgctttacac cgcccttctc taccttattc agccgctgat ctggatacgg 60

ctctgggtgc gcggacgtaa ggctccggcc tatcgaaaac gctggggtga acgttacggt 120

ttttaccgcc atccgctaaa aacaggcggc attatgctgc actccgtctc cgtcggtgaa 180

actctggcgg caatcccgtt ggtgcgcgcg ctgcgtcatc gttatcctga tttaccgatt 240

accgtaacaa ccatgacgcc aaccggttcg gagcgcgtac aatcggcttt cgggaaggat 300

gttcagcacg tttatctgcc gtatgatctg cccgatgcac tcaaccgttt cctgaataaa 360

gtcgacccta aactggtgtt gattatggaa accgaactat ggcctaacct gattgcggcg 420

ctacataaac gtaaaattcc gctggtgatc gctaacgcgc gactctctgc ccgctcggcc 480

gcaggttatg ccaaactggg taaattcgtc cgtcgcttgc tgcgtcgtat tacgctgatt 540

gctgcgcaaa atgaagaaga tggtgcacgt tttgtggcgc tgggcgcaaa aaataatcag 600

gtgaccgtta ccggtagcct gaaattcgat atttctgtaa cgccgcagtt ggctgctaaa 660

gccgtgacgc tgcgccgcca gtgggcacca caccgcccgg tatggattgc caccagcact 720

cacgaaggcg aagagagtgt ggtgatcgcc gcacatcagg cattgttaca gcaattcccg 780

aatttattgc tcatcctggt accccgtcat ccggaacgct tcccggatgc gattaacctt 840

gtccgccagg ctggactaag ctatatcaca cgctcttcag gggaagtccc ctccaccagc 900

acgcaggttg tggttggcga tacgatgggc gagttgatgt tactgtatgg cattgccgat 960

ctcgcctttg ttggcggttc actggttgaa cgtggtgggc ataatccgct ggaagctgcc 1020

gcacacgcta ttccggtatt gatggggccg catactttta actttaaaga catttgcgcg 1080

cggctggagc aggcaagcgg gctgattacc gttaccgatg ccactacgct tgcaaaagag 1140

gtttcctctt tactcaccga cgccgattac cgtagtttct atggccgtca tgccgttgaa 1200

gtactgtatc aaaaccaggg cgcgctacag cgtctgcttc aactgctgga accttacctg 1260

ccaccgaaaa cgcattga 1278