一种蔗糖合成酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蔗糖合酶及其应用。

背景技术

甜菊糖苷(Steviol glycosides，又称甜菊醇糖苷)是从菊科草本植物甜叶菊叶中提取的天然甜味剂，是多种糖苷的混和物，不同甜菊糖苷在味质上存在较大的差异。甜菊糖苷具有纯天然(来自纯天然植物甜叶菊)、高甜度(蔗糖的250～450倍)、低热量(仅为白糖的1/300)、使用成本低(成本仅为蔗糖的三分之一)、稳定性好(耐热、耐酸、耐碱，不易出现分解现象)、安全性高(无毒副作用)等优点，以及抗高血糖、抗高血压、抗炎症、抗肿瘤、抗腹泻等潜在疗效。

甜菊糖苷(甜菊糖苷类化合物)的结构式如下：

上述甜菊糖苷，具有共同的糖苷配基：甜菊醇(Steviol)，区别在于C-13和C-19位置连接的糖基的数量和类型，主要包括甜菊苷(Stevioside)、莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，Reb A，简称RA)、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，Reb D，简称RD)、莱鲍迪苷E、杜克苷、甜菊双糖苷等八种糖苷。甜菊的叶子能够累积多达10-20％(基于干重)甜菊醇糖苷。甜菊叶子中发现的主要糖苷是莱鲍迪苷A(2-10％)、甜菊苷(2-10％)和莱鲍迪苷C(1-2％)。其他糖苷，如莱鲍迪苷B、D、E和F，甜菊双糖苷和甜茶苷，以低得多的水平被发现(大约0-0.2％)。

虽然甜菊糖苷是一种高倍甜味剂，但存在后苦涩味这一缺点，严重限制了其在食品、饮料等对口感要求较高的领域中的应用。而引起甜菊糖苷后苦涩味的本质原因是其内在分子结构引起的，甜菊糖苷中的R

莱鲍迪苷D是其中最有应用潜力的甜菊糖苷，与其它甜菊糖苷相比，其甜度高，约为蔗糖的300-350倍，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，没有苦味和甘草异味，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。甜叶菊叶子中莱鲍迪苷D的含量极少(少于5％)，采用提取法生产莱鲍迪苷D需要大量的甜叶菊原料，另外富集莱鲍迪苷D的工艺繁琐，提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶，并在生产过程中产生大量的废水，其生产成本较高，不适合工业化大生产。

莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，Reb M，简称RM)具有更好的口感特性，但其占叶子干重的含量小于0.1％，导致分离成本高、价格昂贵。生物催化法获得高浓度的莱鲍迪苷M已引起了学者的关注。目前报道，来源甜叶菊的重组酶能催化莱鲍迪苷D生成莱鲍迪苷M，但产量较低。以莱鲍迪苷D为底物，通过微生物产酶催化法可获得莱鲍迪苷M，该方法较传统的提取法，不仅改善了生产流程，并且降低了对环境的污染，提高了目的产物莱鲍迪苷M的产率。但目前以生物酶催化法主要存在以下几个问题：(1)以生物酶催化莱鲍迪苷D生产莱鲍迪苷M的成本较高，并且酶产率有待进一步优化；(2)用于催化的糖基转移酶不易与产物分离并回收利用，且易失活；(3)天然植物中莱鲍迪苷A含量很高，而莱鲍迪苷D含量非常低，以低成本由莱鲍迪苷A直接转化为莱鲍迪苷D也是亟待解决的难题。

葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶，该酶的作用机理是催化糖基供体的葡萄糖残基转移到糖基受体分子上，从而调节受体分子的活性。

“核苷(necleoside)”指包含核碱基(即含氮碱基)和5-碳糖(例如核糖或脱氧核糖)的糖基胺(glycosylamines)。核苷的非限制性实例包括胞苷(cytidine)、尿苷(uridine)、腺苷(adenosine)、鸟苷(guanosine)、胸苷(thymidine)和肌苷(inosine)。

“核苷二磷酸(nucleoside diphosphate)”指包含核碱基(即含氮碱基)、5-碳糖(例如核糖或脱氧核糖)和二磷酸(即焦磷酸)部分的糖基胺。“核苷二磷酸”可缩写为“NDP”。核苷二磷酸的非限制性实例包括胞苷二磷酸(CDP)、尿苷二磷酸(UDP)、腺苷二磷酸(ADP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)和肌苷二磷酸(IDP)。

UDP-葡萄糖是二磷酸尿苷葡糖(uridine diphosphate glucose)的简称，又简称为UDP-葡糖或者UDPG，是由尿苷二磷酸和葡萄糖组成的维生素，可看作“活性葡萄糖”，广泛分布于植物、动物和微生物的细胞内，在蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖合成中作葡萄糖基的供体，是最常见的一种糖基供体。除UDP-葡萄糖外，ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、dTDP-葡萄糖(deoxythymidine diphosphate glucose)、CDP-葡萄糖、IDP-葡萄糖或GDP-葡萄糖等也常作为糖供体化合物。这些糖基供体价格昂贵，不利于工业化生产。

蔗糖合成酶(sucrose synthase，SUS，也简称SuSy/SS等，EC2.4.1.13)，其可逆地催化化学反应NDP-葡萄糖+D-果糖到NDP和蔗糖，属于糖基转移酶-4亚家族在小麦(Triticum aestivum)胚芽中首次被鉴定。每个蛋白以四聚体的形式存在。每个亚基分子量在90kDa左右。基因大小一般为5.9kb,cDNA大小为2.7kb左右。编码氨基酸序列全长约800个氨基酸残基(Ross和Davies 1992)。蔗糖合成酶对NDP亲和力不同，亲和力大小依次为UDP>ADP>dTDP>CDP>GDP。

目前生物酶法合成莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M的方法需要外加昂贵的原料UDP-葡萄糖或ADP-葡萄糖，通过UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，简称UGT)的作用，以甜菊苷为起始原料，催化生成莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M；或者以莱鲍迪苷A为起始原料，催化生成莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M。但由于UDP-葡萄糖极高的售价，几乎完全限制了工业化制备莱鲍迪苷D的可行性，成本较高、缺乏市场竞争力。

如今，随着天然甜味剂甜菊糖的广泛应用，以及生物催化技术的日益发展，糖基转移酶被越来越多地应用在甜菊糖苷的生物催化制备的领域中来。亟待解决原料UDPG昂贵的问题，以提高甜菊糖苷生产效益。UDPG可由蔗糖合酶催化蔗糖和UDP而再生，因此，有必要对蔗糖合成酶进行改造，从而获得酶活更高、稳定性更好的改造酶，以便于更好的实现UDPG的再生，从而实现甜菊糖苷的工业化大生产。

发明内容

发明所要解决的技术问题是现有的蔗糖合成酶被应用于甜菊糖苷的生物催化制备时酶活低、稳定性差因而用于催化甜菊糖苷时转化率不高等缺陷，因此本发明提供一种蔗糖合成酶以及其在制备甜菊糖苷中的应用。本发明的蔗糖合成酶的酶活高、稳定性好；本发明以甜菊苷为原料，联合使用葡萄糖基转移酶(GT)与蔗糖合酶(SUS)催化合成RD或RM，实现级联反应；既可以使用蔗糖和UDP来实现UDPG再生，也可以使用蔗糖和ADP来实现ADPG再生，解决了糖基供体UDPG、ADPG价格昂贵的问题，也提供原料选择的多种可能性，为进一步实现大规模工业化生产提供更多工艺条件优化的选择，更利于实现大规模工业化。

本发明第一方面提供一种蔗糖合成酶，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列与SEQ IDNO:11相比包含选自以下一个或多个的残基位置处的氨基酸残基差异：

第36位氨基酸为V；

第43位氨基酸为E；

第179位氨基酸为A；

第395位氨基酸为R；

第447位氨基酸为P：

第455位氨基酸为L；

第654位氨基酸为R；并具有不低于如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示的蔗糖合成酶活性。

所述差异可以是在SEQ ID NO:11上进行突变，也可以是其它序列上进行突变，只要最终结果体现为其氨基酸序列与SEQ ID NO:11有上述差异即可。

较佳地，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:11相比的氨基酸残基差异为：

第36位氨基酸为V；或，

第43位氨基酸为E；或，

第179位氨基酸为A；或，

第395位氨基酸为R；或，

第447位氨基酸为P；或，

第455位氨基酸为L；或，

第654位氨基酸为R。

本发明第二方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶。

本发明第三方面提供一种重组表达载体，其包含如本发明第二方面所述的核酸。

本发明第四方面提供一种转化体，其为包含如本发明第二方面所述的核酸或如本发明第三方面的重组表达载体的宿主细胞。

较佳地，所述宿主细胞为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)例如E.coli BL21(DE3)。

本发明第五方面提供一种制备如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶的方法，所述方法包括在适于表达所述蔗糖合成酶的条件下培养如本发明第四方面所述的转化体。

本发明第六方面提供一种组合物，其包含如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶中的一种或多种。

优选地，所述组合物包括如SEQ ID NO:9、10和/或SEQ ID NO:11所示序列的酶。

本发明第七方面提供一种糖基供体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

在如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶的存在下，将蔗糖与核苷二磷酸进行反应，即得所述糖基供体；所述核苷二磷酸为UDP、dTDP、TDP、CDP、IDP、GDP或ADP，

较佳地，所述糖基供体的制备方法满足以下一种或多种条件：

所述蔗糖合成酶以蔗糖合成酶菌体、粗酶液、纯酶、纯酶液或固定化酶的形式存在；

所述蔗糖合酶菌体与蔗糖的质量比为1:(20-200)，优选3:200；

所述蔗糖与所述核苷二磷酸的质量比为100:0.5～300:0.1；优选为200:0.1；

所述蔗糖的浓度优选为50-300g/L例如200g/L。

本发明一较佳实施例中，上述蔗糖合成酶菌体的制备方法如下：(1)将含有点突变的蔗糖合成酶的基因工程菌培养至OD600达到0.5～1.0例如0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1～0.3mM例如0.1mM，20～28℃例如25℃诱导培养16～26h例如20h。(2)培养结束后，将培养液3000～5000rpm例如4000rpm离心10～30min例如20min，弃上清液，收集菌体。进一步将收集的菌体使用PBS(20～100mM例如50mM、pH 5～7例如6.0)按1:5～20例如1:10(M/V、g/mL)进行悬浮后使用高压均质机进行均质(例如550Mbar均质1.5min)，将均质后的酶液经离心例如12000rpm离心2min取上清即获得所述蔗糖合成酶菌体。

本发明第八方面所述一种莱鲍迪苷D的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶、SEQ ID NO:9、10和SEQ ID NO:11中的一种或多种的存在下，将莱鲍迪苷A、糖基转移酶、蔗糖和核苷二磷酸进行反应，即得莱鲍迪苷D；

较佳地：所述莱鲍迪苷D的制备方法满足以下一种或多种条件：

所述蔗糖合成酶以蔗糖合成酶菌体、粗酶液、纯酶、纯酶液或固定化酶的形式存在；

所述糖基转移酶以糖基转移酶菌体、粗酶液、纯酶、纯酶液或固定化酶的形式存在；

所述莱鲍迪苷A的浓度1-150g/L，优选50g/L、60g/L；

所述蔗糖的浓度优选为50-300g/L例如200g/L；

所述蔗糖合酶菌体与蔗糖的质量比为1:(20-200)；优选3:200；

更佳地，所述糖基转移酶菌体与所述莱鲍迪苷A的质量比为(0.1-2):1，例如0.24:1、0.3:1；

所述反应的反应溶剂为水，pH为5-8，优选6，所述pH由缓冲溶液控制，优选磷酸缓冲溶液；

所述反应时的转速为500-1000rpm，优选600rpm；

所述反应的反应体系的温度为20-90℃，优选60℃。

较佳地，所述糖基供体与莱鲍迪苷A的摩尔比为1:1～5:1；

所述糖基供体通过如本发明第七方面所述的制备方法获得。

本发明第九方面提供一种莱鲍迪苷M的制备方法，其包括根据如本发明第八方面所述的制备方法制备莱鲍迪苷D的步骤。

本发明第十方面提供一种如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶、SEQ ID NO:9、10和/或SEQ ID NO:11中的一种或多种在制备甜菊糖苷中的用途。

较佳地，所述甜菊糖苷为莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的蔗糖合成酶的酶活高、稳定性好；将其用于制备甜菊糖苷(例如莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M)时与蔗糖合成酶亲本相比，在催化活性方面有了明显的提高，转化率显著提升；本发明以甜菊苷为原料，联合使用葡萄糖基转移酶(GT)与蔗糖合酶(SUS)催化合成RD或RM，实现级联反应；本发明的蔗糖合成酶可以以ADP、UDP为底物，其中以ADP为底物时活性最高，即本发明可以使用蔗糖和UDP来实现UDPG再生，也可以使用蔗糖和ADP来实现ADPG再生，解决了糖基供体UDPG、ADPG价格昂贵的问题，也提供原料选择的多种可能性，为进一步实现大规模工业化生产提供更多工艺条件优化的选择，更利于实现大规模工业化。

附图说明

图1为本发明的一个实施方式的由甜菊苷制备莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M的路线示意图。

图2为底物莱鲍迪苷A对照品的图谱，保留时间14.186min。

图3为产物莱鲍迪苷D对照品的图谱，保留时间11.821min。

图4为产物莱鲍迪苷M对照品的图谱，保留时间12.316min。

图5显示了表7中第二轮筛选中亲本酶Enz.8催化合成RD(ADP为底物，反应时间30min)活性的HPLC图。

图6显示了表7中第二轮筛选中突变体Enz.11催化合成RD(ADP为底物，反应时间30min)活性的HPLC图。

图7显示了表8中亲本酶Enz.8催化合成RM(反应7H)活性的HPLC图。

图8显示了表8中Enz.11催化合成RM(反应7H)活性的HPLC图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。

表1

所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。

表2

KOD Mix酶购自TOYOBO CO.，LTD.，DpnI酶购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司；E.coli Trans10感受态细胞与E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。pGro7质粒购自上海北诺生物科技有限公司。蔗糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司。RebA对照品购自麦克林。RebD和RebM对照品购自青岛思远甜菊国际贸易有限公司。

转化率HPLC检测方法：色谱柱：ZORBAXEclipse plus C18(4.6mm*150mm，3.5um)。流动相：0.1％TFA水溶液为流动相A，0.1％TFA乙腈溶液为流动相B，按下表3进行梯度洗脱。检测波长：210nm；流速：1ml/min；进样体积：20μl；柱温：35℃。如附图2所示，RebA出峰时间：14.186min；如附图3所示，Reb D出峰时间：11.821min。如图4所示，Reb M出峰时间：12.316min。

表3

实施例1：第一轮蔗糖合成酶的制备

全基因合成表4中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的编号为Enz.1、Enz.2、Enz.3、Enz.4、Enz.5、Enz.6、Enz.7、Enz.8的蔗糖合成酶酶基因，并分别接入pET28a质粒载体(酶切位点NdeI、HindIII)，得到重组质粒pET28a-Enz.1、pET28a-Enz.2、pET28a-Enz.3、pET28a-Enz.4、pET28a-Enz.5、pET28a-Enz.6、pET28a-Enz.7、pET28a-Enz.8，经过测序验证基因成功连接到相应的载体上。基因合成公司为生工生物工程(上海)股份有限公司(上海市松江区香闵路698号)。

分别将各重组质粒pET28a-Enz.1、pET28a-Enz.2、pET28a-Enz.3、pET28a-Enz.4、pET28a-Enz.5、pET28a-Enz.6、pET28a-Enz.7、pET28a-Enz.8与pGro7质粒(该质粒表达伴侣蛋白，可以增加目标蛋白的溶解性)共转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，分别得到含有各蔗糖合成酶基因的工程菌株。分别将含有蔗糖合成酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素和25μg/mL氯霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养4h。按2％(v/v)接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素和25μg/mL氯霉素的新鲜TB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养20h。培养结束后，将培养液4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体。-20℃保存备用。

将收集的菌体使用PBS(50mM、pH 6.0)按1:10(M/V、g/mL)进行悬浮，之后使用高压均质机进行均质(550Mbar均质1.5min)，将均质后的酶液经12000rpm离心2min取上清即获得蔗糖合成酶反应酶液。

表4

实施例2：β-1,2-糖基转移酶的制备

根据如核苷酸序列SEQ ID NO:12所示的β-1,2-糖基转移酶(酶编号Enz.9，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列获得该酶的氨基酸序列)的基因，全基因合成一套β-1,2-糖基转移酶基因，该基因连接在pET28a质粒载体上得到重组质粒pET28a-1,2GT。基因合成公司：生工生物工程(上海)股份有限公司。

将质粒pET28a-1,2GT转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有β-1,2-糖基转移酶基因的工程菌株。

将含有β-1,2-糖基转移酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％(v/v)接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至其终浓度为0.1mM，24℃诱导培养22h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。

配制50mM、pH6.0的磷酸缓冲液(PBS)，将收集的菌体按照1:10(M/V，g/mL)进行悬浮，之后，进行高压均质(550～600Mbar、1min)，经12000rpm离心2min，取上清获得β-1,2-糖基转移酶的粗酶液。

实施例3：第一轮蔗糖合成酶的筛选

以Reb A(含量96％)为底物(购自毕得医药)，1mL反应体系中，加入β-1,2-糖基转移酶的反应酶液150μL，Reb A终浓度为50g/L，ADP或UDP终浓度为0.1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，蔗糖合成酶反应酶液30μL，最后加入50mM pH6.0磷酸缓冲液至终体积1mL。将配制好的反应体系置于金属浴中，60℃，600rpm下反应1h，然后取10μL反应液加入190μL pH2.0的盐酸进行涡旋，再加入800μL去离子水，混匀，13000rpm离心10min，取上清液进行HPLC分析Reb D的浓度(详见表5的RD％)。

表5

表5中结果显示：以ADP为蔗糖合成酶催化底物时，Enz.8酶活最高，其次是Enz.5、Enz.3；以UDP作为蔗糖合成酶催化底物时，Enz.3酶活最高，其次是Enz.5、Enz.8，且Enz.3、Enz.5、Enz.8采用ADP的活性都高于其采用UDP的活性，且Enz.8采用ADP时效果最好。所以，下一轮以ADP为蔗糖合成酶底物，在Enz.8的基础上进行突变和筛选。

实施例4：第二轮蔗糖合成酶突变体的制备

以重组质粒pET28a-Enz.8为模板，采用表6所示的引物序列，分别以Enz.X-F/Km-R和Km-F/Enz.X-R为引物(其中Enz.X为：Enz.10、Enz.11、Enz.12、Enz.13、Enz.14、Enz.15、Enz.16)采用KOD酶进行PCR扩增目标DNA片段和载体片段。

表6

PCR扩增反应体系为：

KOD Mix：25μL

ddH

引物：2μL*2

模板：1μL。

PCR程序：

(1)98℃3min

(2)98℃10s

(3)55℃5s

(4)68℃5s/kbp

(5)68℃5min

(6)12℃保温

(2)～(4)循环34次。

对PCR产物进行DpnI消化并进行跑胶及胶回收得到目标DNA片段。采用购自诺唯赞的两片段同源重组酶(Exnase CE II)进行重组连接，连接后转化至E.coli Trans 10感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上，于37℃倒置培养过夜；挑取单菌落至LB试管(Km抗性)，培养8～10h，提取质粒进行测序鉴定，得到含有目标突变体基因的重组质粒。

将测序正确的重组质粒转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有点突变的蔗糖合成酶基因工程菌株。将含有蔗糖合成酶基因的工程菌株经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养4h。按2％(v/v)接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜TB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养20h。培养结束后，将培养液4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体。-20℃保存备用。

将收集的菌体使用PBS(50mM、pH 6.0)按1:10(M/V、g/mL)进行悬浮，之后使用高压均质机进行均质(550Mbar均质1.5min)，将均质后的酶液经12000rpm离心2min取上清即获得反应酶液。

实施例5：第二轮蔗糖合成酶突变体的筛选

以Reb A(含量96％)为底物，1mL反应体系中，加入β-1,2-糖基转移酶的反应酶液150μL，Reb A终浓度为50g/L，ADP终浓度为0.1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，蔗糖合成酶反应酶液30μL，最后加入50mM pH6.0磷酸缓冲液至终体积1mL。将配制好的反应体系置于金属浴中，60℃，600rpm下反应30min后，分别取10μL反应液加入190μL pH2.0的盐酸进行涡旋，再加入800μL去离子水，混匀，13000rpm离心10min，取上清进行HPLC分析Reb D的浓度(RD％)；分析结果如表7所示。

表7

结果显示：反应起始的30min内，Enz.11的反应活性最高，其相较于亲本Enz.8提高了10％，其次是Enz.16、Enz.14、Enz.13，它们的反应活性相对于亲本Enz.8提高了5％-10％。

图5的A显示了表7中第二轮筛选中亲本酶Enz.8催化合成RD(ADP为底物，30min)活性的HPLC图，图5的B为A的峰图信息。

图6的A显示了表7中第二轮筛选中突变体Enz.11催化合成RD(ADP为底物,30min)活性的HPLC图，图6的B为A的峰图信息。

实施例6：β-1,3-糖基转移酶Enz.17的制备

根据如核苷酸序列SEQ ID NO:29所示的β-1,3-糖基转移酶(酶编号Enz.17，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列获得该酶的氨基酸序列)的基因，全基因合成一套β-1,3-糖基转移酶基因，该基因已连接在pET28a质粒载体上得到重组质粒pET28a-Enz.17。基因合成公司：生工生物工程(上海)股份有限公司。

将质粒pET28a-Enz.17转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有β-1,3-糖基转移酶基因的工程菌株。

将含有β-1,3-糖基转移酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2v/v％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，24℃诱导培养22h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。

配制50mM pH6.0的磷酸缓冲液(PBS)，将收集的菌体按照1:10(M/V,g/mL)进行悬浮，之后，进行高压均质(550Mbar、1.5min)，经12000rpm离心2min，取上清获得β-1,3-糖基转移酶的反应酶液。

实施例7：RM合成反应

以Reb A 60(Reb A含量为60％，甜菊苷含量约30％，晨光生物，产品规格TSG90/RA60)为底物，1mL反应体系中，加入β-1,2-糖基转移酶的反应酶液120μL，蔗糖合成酶反应酶液30μL，β-1,3-糖基转移酶的反应酶液150μL，RA60终浓度为100g/L，ADP终浓度为0.1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，最后加入50mM pH6.0磷酸缓冲液至终体积1mL。将配制好的反应体系置于金属浴中，60℃，600rpm下反应，分别在4h、7h、过夜后取10μL反应液加入190μLpH2.0的盐酸进行涡旋，再加入800μL去离子水，混匀，13000rpm离心10min取上清液进行HPLC分析Reb A、中间产物Reb D和产物Reb M的浓度(RA％、RD％、RM％)，反应结果如表8所示(其中RA％、RD％和RM％分别指底物、中间产物和产物在反应后反应液中的浓度)，该实施例中的反应路线如图1所示。

表8

结果：从反应4h、7h和过夜反应上看：Enz.14的反应效果(RM％)最好，其次是Enz.11，且均优于Enz.8。

图7的A显示了表8中亲本酶Enz.8催化合成RM(反应7H)活性的HPLC图，图7的B为A的峰图信息。

图8的A显示了表8中Enz.11催化合成RM(反应7H)活性的HPLC图，图8的B为A的峰图信息。

SEQUENCE LISTING

<110> 弈柯莱生物科技（上海）股份有限公司

<120> 一种蔗糖合成酶及其应用

<130> P21015903C

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2427

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.1的核苷酸

<400> 1

atggctaacg ctgaacgtat gatcacccgc gtgcactctc agcgtgaacg tctgaacgaa 60

accctggtga gcgaacgtaa cgaagttctg gctctgctgt ctcgtgttga agctaaaggt 120

aaaggcatcc tgcaacagaa ccagatcatt gcggagttcg aagcgctgcc ggaacagact 180

cgcaaaaaac tggaaggtgg cccgttcttc gatcttctga aaagcaccca ggaagcgatc 240

gtcctgccgc cgtgggtggc gctggcggtt cgtccgcgcc ctggtgtgtg ggaatacctg 300

cgcgtgaacc ttcacgcact ggttgtggaa gaactgcaac cggccgagtt tctgcacttt 360

aaagaagaac tggtggacgg cgttaaaaac ggcaacttta ccctggaact ggatttcgaa 420

ccgttcaacg caagcatccc gcgtccgacc ctgcataaat acatcggcaa cggcgtggac 480

ttcctgaacc gtcacctgag cgcgaaactg ttccatgaca aagaaagcct cctgccgctg 540

ctgaaatttc tgcgtctgca cagccatcaa ggtaaaaacc tgatgctgtc tgaaaaaatc 600

cagaacctga acaccctcca gcacaccctg cgtaaagctg aagaatatct ggcggaactg 660

aaatccgaga ctctgtatga agaatttgaa gcgaaattcg aagaaattgg tctggaacgt 720

ggctggggtg ataacgcgga acgcgtgctc gatatgatcc gcctgctgct ggacctgctg 780

gaggcaccgg acccgtgcac cctggaaacc ttcctcggcc gcgtaccgat ggtttttaat 840

gtagttatcc tgtccccgca cggctacttt gcgcaggaca atgtactggg ttacccggac 900

accggtggcc aggtggtcta cattctggat caggttcgtg cgctggaaat cgaaatgctg 960

caacgtatca aacagcaggg tctgaacatt aaaccgcgca tcctgattct gacccgcctg 1020

ctgccggatg ccgtaggcac cacctgcggc gaacgcctgg aacgcgtgta tgactctgaa 1080

tactgtgaca tcctgcgcgt tccgttccgc accgaaaaag ggatcgtgcg taaatggatc 1140

agccgcttcg aagtttggcc gtacctggaa acttacaccg aagatgcggc agttgaactg 1200

tctaaagaac tgaacggtaa accggacctg atcatcggca actactctga cggcaacttg 1260

gtggcgagcc tgctggctca caaactgggc gttacccagt gcaccattgc acacgcactg 1320

gaaaaaacca aatacccgga ttccgatatt tattggaaaa aactggacga taaataccac 1380

ttcagctgcc agttcaccgc ggacatcttc gctatgaacc acaccgactt catcatcacc 1440

tccacctttc aggaaattgc aggttctaaa gaaaccgtgg gccagtacga atcccacact 1500

gcattcactt taccaggtct gtatcgcgtt gttcacggca tcgatgtttt cgatccgaaa 1560

ttcaacatcg ttagcccagg cgccgatatg agcatctatt tcccgtacac tgaagaaaaa 1620

cgtcgtctga ccaaatttca ctctgaaatt gaagaactgc tgtatagcga cgttgaaaac 1680

aaagaacatc tgtgtgtgct gaaagataag aaaaaaccaa tcctgttcac gatggcccgc 1740

ctggaccgtg tgaaaaacct gtctggcctg gtggaatggt acggtaaaaa cacccgctta 1800

cgtgaactgg cgaacctggt ggttgttggt ggtgaccgcc gtaaagaatc taaagataac 1860

gaagaaaaag cggagatgaa aaagatgtat gatctgattg aagaatataa actgaacggc 1920

cagttccgct ggatttctag ccagatggac cgcgttcgta acggtgaact gtaccgttac 1980

atctgcgaca ccaaaggtgc gtttgttcag ccggctctgt atgaggcatt cggtctgacc 2040

gttgttgaag cgatgacctg cggcctcccg accttcgcga cgtgcaaagg cggtccggcg 2100

gaaatcatcg ttcacggcaa atctggtttc cacattgacc cgtaccacgg cgatcaggcg 2160

gctgataccc tggctgactt ctttaccaaa tgcaaagaag atccgtccca ctgggacgaa 2220

atctctaaag gtggtctgca acgtattgaa gaaaaatata cctggcagat ctatagccag 2280

cgtctgctga ccctgaccgg tgtttacggc ttctggaaac atgtaagcaa cctggatcgc 2340

ctggaagcgc gtcgctacct ggaaatgttc tatgcgctga aatatcgccc gctggcacaa 2400

gcggtgccgc tggcgcagga tgactaa 2427

<210> 2

<211> 2418

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.2的核苷酸

<400> 2

atggctgaac gtgtgctgac ccgtgtgcac tccctgcgcg aacgcgttga tgcgaccctg 60

gccgcacacc gtaacgaaat cctgctgttt ctgtctcgca ttgaatccca cggcaaaggc 120

attctgaaac cgcacgaact gctggccgaa tttgacgcga ttcgtcagga tgacaaaaac 180

aaactgaacg aacacgcgtt cgaagaactg ctgaaatcca ctcaggaagc gatcgtgctg 240

ccgccgtggg tagctctggc aattcgtctg cgtccaggcg tgtgggaata cattcgtgtg 300

aacgttaacg ccctggtggt cgaagaactg agcgttccgg aatatttgca gtttaaagaa 360

gaactggttg acggtgcctc caacggcaac ttcgtgctgg aactggactt tgaaccgttc 420

accgcgtctt tcccgaaacc gaccctgacc aaatccatcg gtaacggtgt tgagttcctg 480

aaccgccacc tgtccgcaaa aatgttccac gacaaagaaa gcatgacccc tctgctggaa 540

tttctgcgcg cacatcacta taaaggtaaa accatgatgc tgaacgatcg catccagaac 600

tccaacaccc tccagaacgt tctgcgtaaa gcggaagaat acctgatcat gttgccgccg 660

gaaaccccgt acttcgagtt cgaacacaaa ttccaggaga tcggcctgga gaaaggctgg 720

ggcgacaccg ccgaacgtgt tcttgaaatg gtgtgtatgt tgctggatct gctggaagcg 780

ccggatagct gcaccctcga aaaattcctg ggtcgcatcc cgatggtgtt taacgtcgtt 840

atcctgtctc cgcacggtta ctttgctcag gagaacgtcc tgggctatcc ggataccggc 900

ggccaggttg tatatatcct ggaccaggtt ccggcgctgg aacgtgaaat gctgaaacgt 960

atcaaagaac agggcctgga tattatcccg cgcattctga ttgttacccg tctgctgccg 1020

gacgcggtgg gcaccacctg cggtcagcgt atcgaaaaag tgtacggtgc ggaacactct 1080

cacattctgc gcgtgccatt tcgcaccgaa aaaggcattg tgcgcaaatg gatctcacgc 1140

ttcgaagttt ggccttacat ggaaactttc atcgaagatg tggcgaaaga gatctccgca 1200

gaactccagg cgaaaccgga tctgatcatc ggtaactatt ccgaaggcaa cctggccgct 1260

agcctgctgg cgcataaact gggcgttact cagtgcacta ttgcgcacgc gctggaaaaa 1320

accaaatatc cggattctga catctactgg aaaaaatttg atgaaaaata ccacttctca 1380

agccagttta ccgctgacct gatcgcaatg aaccacactg acttcatcat cacctccacc 1440

ttccaggaaa tcgctggttc aaaagacacc gtcggccagt acgaatccca catggcgttc 1500

accatgccgg gtctgtatcg cgttgttcac ggtattaacg tgttcgaccc gaaatttaat 1560

atcgtgtcgc cgggcgccga tattaacctg tacttcagct acagcgaaac cgaaaaacgc 1620

ctgactgcgt ttcacccgga aatcgacgaa ctgctgtatt ccgacgttga aaacgatgaa 1680

cacctgtgtg tgctgaaaga tcgtaccaaa ccgatcctgt tcactatggc ccgcctggat 1740

cgtgttaaaa acctgaccgg tctggttgaa tggtacgcga aaaacccgcg tctgcgcggc 1800

ctggtgaacc tggttgtggt aggtggtgat cgccgtaaag aatctaaaga tctggaagaa 1860

caggcggaaa tgaagaaaat gtatgaactg atcgaaaccc ataacctgaa cggccagttt 1920

cgttggatct ctagccagat gaaccgcgtt cgtaacggtg aactgtatcg ttacatcgct 1980

gacaccaagg gcgcgttcgt tcagccggca ttctacgaag cattcggcct gaccgttgtg 2040

gaagctatga cctgcggtct gccgactttt gcgactaatc atggcggtcc ggccgagatt 2100

atcgtacatg gtaaatctgg cttccacatt gatccgtacc acggcgaaca ggccgctgat 2160

ctgctggctg atttctttga aaaatgcaaa aaagacccgt cccattggga aaccatttct 2220

atgggcggcc tcaaacgtat cgaagaaaaa tacacctggc agatctactc tgaaagcctg 2280

ctgaccctgg cggctgtgta cggtttctgg aaacatgtgt ctaaactgga tcgtctggaa 2340

atccgtcgct acctggaaat gttctacgcg ctgaaatacc gtaaaatggc ggaagcggtg 2400

ccgctggcgg cggaataa 2418

<210> 3

<211> 2460

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.3的核苷酸

<400> 3

atgcaccatc atcatcatca tggcggtagc ggcatgactt gtgttctgtt aaaagcagtt 60

gtagaaagcg acgaacgtgc cgacctgcgc cagttttcac gcattctgca actgggcgaa 120

aaacgctacc tgctgcgcaa cgacattctg gatgcgtttg cagactattg ccgcgatcaa 180

gaacgcccgg tgccaccacc gagcgaaagc cgtctgagca aactggtctt ctatacccag 240

gaaattatcg tggataacga atcactgtgt tggatcgttc gtccacgtat tgcacagcag 300

gaagtgtgcc gtttactggt cgaagacctg accattgtgc cgatgaccat cccggagctg 360

ctggatctgc gtgaccgctt ggtgaaccat tatcatccga acgaaggcga cgtgtttgag 420

attgatgtgc aaccgtttta tgactatagc ccaatcatcc gtgatgcgaa aaacatcggt 480

aagggcgtcg agttcctgaa ccgctatctt agctcgaagc tgttccagga cccgcgccaa 540

tggcaacaga acctgttcaa cttcctgcgc attcatcgct acaatggcta ccagctgctg 600

attaacgagc gcattcgtag tccgcagcat ctgagcgaac aggtcaaaca agcactggtt 660

gtgctgagcg atcgtccacc aactgaagcc tatagcgagt ttcgcttcga gctgcaaaac 720

ctgggttttg aaccaggttg gggcaatacc gttgcacgtg ttcgtgacac cctggaaatt 780

ctggaccagc tgctggatag cccggaccat caagttctgg aagcgtttgt gagccgcatc 840

ccaatgctgt tccgcattgc actgatttcg ccgcatggtt ggttcggtca ggaaggtgtt 900

ctgggtcgtc cagatacggg tggtcaggtt gtgtatatcc tggaccaggt gaagagtctg 960

gagaaacaga tgcgcgaaga ccttgaactg gccggtttag gcgttctgga agcacagccg 1020

aagatcatcg ttctgacccg cctcattcca aatgcggaag gcaccctgtg taaccaacgt 1080

ctggaaaaga tttacggcac caatgatgcg tggattctgc gcgttccatt tcgcgagttc 1140

aacccgaaag tcacgcagaa ttggattagc cgctttgaga tctggccgta cctggaaacc 1200

tttgcgattg acgccgaacg tgaactgcgt gcagaatttg gtcatgtacc ggatctgatc 1260

atcggcaatt atagcgacgg taatttggtt gcgttcctgt tagcgcgtcg cttaaaggtg 1320

acccagtgta acatcgcaca tgccctggaa aagagcaagt acctgtttag caatctgtat 1380

tggcaggatc tggaagacaa gtaccacttt agcctgcaat ttacagccga tctgattgca 1440

atgaatgcag cgaatttcat cattagcagt acctaccagg agattgttgg cactccggat 1500

tccatcggtc aatacgagag ctatcaatcc ttcaccatgc cagacctgta ccatgtggtt 1560

aatggcattg aactgttcag tccaaagttt aatgttgttc caccgggcgt taatgaacag 1620

gtgtattttc cgtattatca ttataccgaa cgcctggaag gtgatcgcca acgcctggaa 1680

gaactgcttt ttactctgga agatccgcag cagatttacg gctacctgga agcacccgaa 1740

aaacgtccgt tgttcagtat ggctcgtctg gatcgcatca agaacctgac cggtttagcc 1800

gaagcatttg gccgtagcaa ggcactgcaa gaacgttgca acctcattct ggtagcgggc 1860

aaattacgca ccgcagatag cagcgaccgt gaagaaattg cggagatcga aaaactgtac 1920

cagatcatcc accagtataa cctgcatggc aagattcgtt ggcttggtat tcgccttccg 1980

aaagccgata gcggcgaaat ctaccgcatt atcgcagatc gccagggcat ttttgtgcaa 2040

ccggcgttgt ttgaagcgtt cggcctgact attctggagg cgatgattag cggtctgccg 2100

acttttggca cccgcttcgg tggtccgctg gagatcatcc aggatggtgt caacggcttc 2160

tacattaatc cgactcatct ggaagaaatg gctgagacga ttgtgcgctt cctggaagca 2220

tgtgaccgcg atccgcagga atggcagcgc attagcaagg cgggcattga gcgtgtttat 2280

agcacctaca cgtggaagat ccattgcacc cgcctgctga gcctggccaa aatctacggc 2340

ttttggaatt ttagcagcca agaaaaccgc gaagatatga tgcgttacat ggaagcactg 2400

ttccatctgc tgtataaacc gcgtgctcag gcactgctgg ccgaacatct tcagcgttaa 2460

<210> 4

<211> 2382

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.4的核苷酸

<400> 4

atgtctgatg aactgcgtcg ttacatcagc cagaacagcc actctgtttc cggtctgctg 60

cgtcacctgt tcaacctcca gcgcccgttc ctgctgtaca ccgacctcca gaaagcgttc 120

agccacttcg ctgaagatta cggtaacgat gcagacctgg ttgtgctcca ggagttcttc 180

tctcgtctgc aagaggctgt actggctgaa ccgtggatct gtctggcctg gcgtccaggt 240

ccgggtcgct ggaactacct gcgtctgcat cgtgaacagc tgcacctgga aactctgact 300

cctggcgact acctggcgtt taaagaaaaa caggttctgc cggcgaacga ccaggaaccg 360

gtgctgaccg tggatttcga agatttccgc gcggcgccgt accgtctgcg tgatgaagct 420

actattggtc agggtctggt atatatgaac cgtcgtctgg caggccagct gtttcgtgac 480

atcaaagccg gccgccaatc tatcttggat ttcctcgcgg ttcacaaact gaacggccag 540

tccctgatgg tgcgtgacca gccgccggat tttgaaaccc tgcgtcaaac cgttcagtac 600

ctgagcaccc tgccgaaaac caaaccgtgg tctgaatttg ctaccgaaat gagccgccgt 660

ggctttgctc cgggctgggg cgacattgct ggccgcgttc gtgaaaccat gcgcctgctg 720

atggatctgc tggacgcgcc gtctgcggaa tctttagaag cgttcattga tcgcatcccg 780

atgatcagcc gcatcctgat cgtgagcatc cacggctggt tcgcccagga caaagttctg 840

ggccgccctg atacgggcgg ccaggtggtg tacatcctgg atcaggcccg tgctttagaa 900

caggaaatgc gtcagcgtct ggcgcatcag ggcgtggata ttgttccgca cattctgatc 960

gctacgcgtc tgattccgga agcagatggc acgacctgtg accagcgcct ggagtctgtg 1020

cacggtgcag acaacgtacg tatcctccgt gtcccgttcc gccatccatc tggtgaaatc 1080

ctgccacact gggtgagccg ttttaacgtt tggccgtggc tggaacacta cgcggaggat 1140

cttgaacgcg aaaccttggc agaatttggt cgtcgcccag atctgattat cggtaattac 1200

tcagacggta atctggtagc ctccatgctg tccgaacgcc tgaacgtgac gcagtgcaat 1260

atcgcgcacg cgctggaaaa aagcaaatat ctgtatagcg atctgtactg gcgtgatcat 1320

gacgcgtccc accacttcgc ttgccagttc accgcagatc tgatcgcgat gaactctgcg 1380

gacatcatcg ttacctctac ctatcaagaa atcgctggca acgatcatga agtaggccaa 1440

tatgaaggtc atcagaacta ctccctgccg ggcttatacc gtgttgaaaa cggcatcgat 1500

gtgttcgata ctaaattcaa catcatcagt ccgggtgcgg atgcgcgtta ctacttcccg 1560

tactctgtta gcgaggaacg tttacgtttc ctgcacccgg acattgatgc actgctgttc 1620

ggtgaggagc cggccgcaga ccgtcgcggt gttctggaag atcgtaacaa accgattatt 1680

ttctctatgg cacgtatgga tcacatcaaa aacctgagcg gtctggctga actcttcggc 1740

gctagcgaac gtctgcgtga actggcaaac ctggtgatca ttggcggtca cgttaaccct 1800

caggattctc aggacgaaga agaacgtggt cagatccacc gtatgcacgg tattatggac 1860

cagtaccaac tcgatggcca gatgcgttgg atcggttccc tgctggacaa aaacgtggct 1920

ggtgaactgt accgcgttgt tggtgatact catggttgct tcgtgcagcc ggcgctgttc 1980

gaagcatttg gtctgaccgt gattgaggcg atgtcgtctg gtctgccggt attcgcaacc 2040

cgttttggcg gcccgctgga aatcatcgag gatggcattt cgggctttca catcgatccg 2100

aacaaccagc aggaaaccgc gacccgcctg gctgacttcc tgggcgcggc ggcggcggac 2160

attggcgttt gggaaaccat ctccgatggc gccctggcac gcgttcgtgc tcattatacc 2220

tggggtcatt acgccacccg tatgatgacc ctggctcgta tcttcggctt ctggcgtttc 2280

atgctgaaaa ccgatcatcg cgcggcgcgt cgctatttgc agatgttcca gcacctgcaa 2340

tggcgcccgc tggcgcacgc ggttccgctg ggtgaatctt aa 2382

<210> 5

<211> 2385

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.5的核苷酸

<400> 5

atgaccacca tcgataccct ggcgacctgc actcagcaga atcgtgatgc agtttatact 60

ctgctgcgtc gttacttcac tgcgaaccgt accctgctgt tacagtctga tctgcgtgaa 120

ggcctgctgc aaaccgaaca ggattgtggt cagtctgata tgctgcgtgc gttcgttttc 180

cgcctgcaag aaggcatctt ctcttccccg tgggcgtacc tggcactgcg tccagaaatc 240

gctaaatggg agttcatgcg catccaccag gaacacctga tcccggaaaa actgaccatt 300

tctgaatttc tgaaattcaa agaaaccgtg gtgaaaggcg aagctaccga atccgtgttg 360

gaagttgact tcggcccatt caaccgcggc ttcccgcgcc tgaaagaaag ccgtagcatc 420

ggtcagggcg ttatctttct gaaccgtaaa ctgtctagtg aaatgttctc ccgcattgaa 480

gcgggccaca cctctctgtt gcacttcctg ggtgttcatg ctatcgaggg ccagcagctg 540

atgttttcta acaacagcca cgacatccac gcggttcgta accagctgcg tcaggcgctg 600

gaaatgctgg aaaccctgga tggcaccacg ccgtggattg aactcgcgcc gaaaatgaac 660

caactgggct tcgcaccggg ctggggccat aatgctaacc gcgttgctga aaccatgaac 720

atgctgatgg acattctgga agccccgtcc ccatccgcac tggaagaatt tctggcgtgc 780

atcccgatga tcagccgtct gctgatcctt tccccacacg gctacttcgg ccaggacaac 840

gttctgggtc tgccagacac cggtggtcag gtggtgtata tcctggatca ggttcgtgcc 900

ctggaaaaag aaatgcatga tcgcctccag cttcagggtg tacaggttga accgaaaatc 960

ctgatcgtga cccgtctgat cccggacgca ggtgatacta cctgtaacca gcgtcttgaa 1020

aaagtgtccg gttgcaccaa cacctggatc ttgcgtgtgc cgttccgcaa acacaacggt 1080

gaaatcatac cgcactggat cagccgcttc gagatttggc cgcacctgga aatttttgca 1140

ggcgacgtcg aacgtgaagc actggcggag ctgggcggcc atccggatct gatcatcggt 1200

aactactccg atggcaacct ggttgccact ctgctgagcc gtcgtctggg tgttacccag 1260

tgcaacattg ctcacgcgct ggaaaaaacc aaatacctgc actctgacat ctactggcag 1320

gaaaatgaag ataaatatca cttctcctgc cagtacaccg ccgatctgct ggcgatgaac 1380

tctgcggact ttattgtgac cagcacctac caggaaatcg ctggtactcg tgaagcagaa 1440

ggtcagtacg aatcctacca ggctttctcg atgccggacc tgtaccgtgt tattcatggc 1500

atcgacctgt tcgatccgaa attcaatatt gtttctcctg gcgccaacgc agatatttac 1560

ttcccgtaca gcgatccgaa ccgccgcctg cactcactga tcccggagat cgaaagcctg 1620

atttttgatg acgctactaa tctgccggct cgtggttact tgcaggaccc ggacaaaccg 1680

ctgatcttta ctatggcacg tctggatcgt attaaaaaca tcaccggctt agtagaactg 1740

tatgccgcta gcccgcgcct gcgctccctg gcgaacctgg taattgttgg cggtaaaatc 1800

gatccgcagc acagctctga ccacgaagaa caggaacaga ttcatcgtat gcaccaactg 1860

atggacgaac acgaactgga ccagcaggtt cgctggctgg gtatgcgcct ggacaaaaac 1920

cttgctggcg aactgtatcg ttatattgca gataaacgtg gcattttcgt gcagccggcc 1980

ctgttcgaag ccttcggcct gaccatcatc gaagcgatgg cgtccggcct gccgaccttt 2040

gcaacccgtt acggcggccc gttggaaatc attcagaaca accgttctgg tttccacatc 2100

gacccgaacc agggtgcggc aaccgcggac ctgatcgcag atttcttcga gaaaaacctg 2160

gaaaacccgc aggaatggga acgtatttcc caaggtgcgc tggatcgtgt tgccagccgt 2220

tacacctgga aactgtacgc tgaacgtatg atgaccctgt cccgtatcta tggcttttgg 2280

aaattcgtaa gcggtctgga acgtgaagaa accgatcgct acctgaacat gttctaccac 2340

ctccagttcc gtccgctggc taaccgtctg gcgcatgaaa tctaa 2385

<210> 6

<211> 2382

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.6的核苷酸

<400> 6

atgatcaaag acatctacaa aaccgcggaa accttccata acgacttcta cgacttcctg 60

aaagccgtta gcactcagcc gaaaaaactg atgattaccg gtgaactgat taacctgtat 120

gttgcgagtg gctatgataa aaactccggc ctgtacgaat ttattgaaaa aattcaagaa 180

accattagcc tggaccatag cgtgattctg gatgtgcgta tcaaaatcgc gtccattaaa 240

ttttaccgca tttccctgga agagttcttg atcgaagaaa tctcatctaa ggaatttctc 300

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aagccgttct acgacaaatc cccggcggtt cgtgatatta aatacatcgg ctctggtgtt 420

gaatacctga accgttttct gagtagccag atgttcacta acgaagaacg ctggaagaaa 480

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tctcgtgcga aaatcctgct ggaagaacac atgaaacgtt aa 2382

<210> 7

<211> 2361

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.7的核苷酸

<400> 7

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tttgtgaccg tattcaccga caccctggac tacatggaag tttccccgac cgaataccag 300

gaagcaaaag aaaaaaccgt cctgggcgaa aacgcagcgt ggatgccgtc tgttgacctg 360

aaaccgttta accgtgattt cccgaaaccg agcagcgcgg atttcatcgg taaaggtgta 420

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cgtatcgata gcgtggataa actgaaaaaa gcgctgaaaa aagcacaggc cctgctgaaa 600

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tttctgaaca aacatctgag cctgcaactg ttcgacgaac tgggtgaagg tggtgaacgc 540

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Glu Ala Gln Pro Lys Ile Ile Val Leu Thr Arg Leu Ile Pro Asn Ala

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<223> Enz.8的氨基酸

<400> 11

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Gly Trp Gly Arg Glu Val Ala Arg Ile Arg Asp Thr Met Ser Leu Leu

245 250 255

Arg Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Arg Gly Leu Glu Thr Phe Leu

260 265 270

Ala Arg Leu Pro Met Val Phe Ser Leu Ala Ile Ile Ser Pro His Gly

275 280 285

Tyr Phe Gly Gln Ala Asn Val Leu Gly Arg Pro Asp Thr Gly Gly Gln

290 295 300

Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Thr Glu Met Arg

305 310 315 320

Ser Arg Leu Phe Glu Gln Gly Leu Asp Ile Glu Pro Gln Ile Val Val

325 330 335

Leu Thr Arg Leu Ile Pro Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asp Gln Arg

340 345 350

Leu Glu Pro Ile Ser Gly Thr Arg Asn Ala Arg Ile Leu Arg Val Pro

355 360 365

Phe Arg Asn Ala Ser Gly Glu Ile Val Thr His Trp Ile Ser Arg Phe

370 375 380

Glu Val Trp Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Thr Leu Asp Ser Glu Arg Glu

385 390 395 400

Leu Leu Ala Glu Leu Gly Gly Arg Pro Asp Leu Ile Val Gly Asn Tyr

405 410 415

Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr Leu Leu Ser Gln Arg Leu Gly Val

420 425 430

Thr Gln Cys Asn Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Arg His

435 440 445

Ala Asp Leu Phe Trp Gln Glu Asn Glu Ala Gln Tyr His Phe Ser Cys

450 455 460

Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Ala Ala Asp Phe Ile Ile

465 470 475 480

Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Thr Arg Glu Ser Val Gly Gln

485 490 495

Tyr Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Met Pro Lys Leu Phe Arg Val Val

500 505 510

Asn Gly Ile Asp Val Tyr Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly

515 520 525

Ala Asp Ala Ala Ala Tyr Phe Pro Tyr Thr Ala Val Glu Arg Arg Leu

530 535 540

Pro His Leu His Thr Glu Ile Glu Gln Leu Val Phe Gly Val Asp Glu

545 550 555 560

Arg Val Asp Ala Arg Gly Val Leu Thr Glu Arg Asp Lys Pro Leu Leu

565 570 575

Phe Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Ile Lys Asn Ile Val Gly Leu Val

580 585 590

Glu Trp Phe Gly Ala Cys Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Asn Leu Leu

595 600 605

Val Ile Ser Gly His Val Asp Pro Glu Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu

610 615 620

Leu Glu Gln Ile Arg Cys Met His Ala Leu Phe Asn Arg Tyr Asp Leu

625 630 635 640

Asp Arg Gln Val Arg Trp Leu Gly Leu Arg Leu Pro Lys Asp Leu Ala

645 650 655

Gly Glu Phe Tyr Arg Tyr Val Ala Asp Gly Arg Gly Ala Phe Val Gln

660 665 670

Pro Ala Leu Phe Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Met Ala

675 680 685

Ser Gly Leu Pro Cys Phe Ala Thr Cys Phe Gly Gly Pro Ser Glu Ile

690 695 700

Ile Glu Asp Gly Val Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Asn His Gly Asp

705 710 715 720

Ala Ala Ala Glu Arg Ile Ala Arg Phe Phe Glu Arg Thr Arg Gln Asp

725 730 735

Pro Glu Tyr Trp Asn Arg Ile Ser Glu Gly Ala Leu Lys Arg Val Ala

740 745 750

Glu Arg Tyr Thr Trp Gln His Tyr Ala Glu Arg Met Met Thr Leu Ser

755 760 765

Arg Val Tyr Gly Phe Trp Arg His Val Thr Asp Leu Glu Arg Arg Glu

770 775 780

Thr Gln Arg Tyr Leu Gln Ala Leu Tyr Ser Leu Gln Phe Arg Arg Leu

785 790 795 800

Ala Gln Ala Met Ala

805

<210> 12

<211> 1350

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.9的核苷酸

<400> 12

atgcaccatc atcatgaagg cgtgagcgac cagaccctga gagtaacgat gtttccgtgg 60

cttgggctgg gtcatgttaa cccgtttttg cgtatcgcta aacaactggc cgatcgtggt 120

ttcgttatct atttagttag taccgctatt aacctcgaaa tgatcaaaaa gagaatcccg 180

gagaaataca gtaatagcat ccatctggtt gagctgcgcc tgccagaatt accggaactg 240

ccaccacatt accatactac caacggttta ccaccgcatc tgaacaaaac cctgcacaag 300

gcactgaaga tgagcgctcc caactttagc aagatccttc aaaatattaa gccggacctg 360

gtcctttacg attttctggt tccgtgggca gaaaaagtcg cgcttgaaca gggcatcccg 420

gctgttccat tgctaaccag tggtgcggca ctgttcagct actttttcaa cttcctgaag 480

cgaccgggtg aagagtttcc gtttgaggca atccgcctgt cgaagcgaga acaggataag 540

atgcgcgaga tgtttggaac agagccgcct gaagaagatt ttttagcgcc ggcccaggcc 600

ggtatcatgc tgatgtgcac gagccgcgta attgaggcta agtacctgga ctattgtacc 660

gaactgacca atgtaaaagt tgttccggtt ggtccgccgt ttcaggatcc gctgaccgaa 720

gatattgacg accccgaact gatggattgg ttagatacca aacccgaaca tagtgttgtc 780

tatgtgtcgt ttggcagcga agcgttcctg agccgtgaag atatggaaga agtcgcgttc 840

ggcctggagc tgagcggcgt gaactttatc tgggttgcac gctttccgaa aggcgaagaa 900

cagcgtctgg aagacgttct gccaaaaggc ttcctggaac gcgttggtga tcgtggtcgc 960

gttctggacc atctggtgcc gcaggcccat attctgaacc atccgagcac gggtggcttc 1020

atctctcatt gcggttggaa cagcgtcatg gaaagcattg atttcggcgt tccgatcatt 1080

gcgatgccga tgcagtggga tcagccgatt aacgcgagac tgcttgtgga attaggcgtg 1140

gcagtggaga tcccgcgtga tgaagatggc cgggtccacc gcgccgaaat tgcccgtgtc 1200

ctgaaagatg tgatttcggg cccgactggt gagatactgc gcgcgaaagt acgcgacatt 1260

agcgcacgcc tgagagcgag acgcgaggag gaaatgaacg cagcggcgga agaactgata 1320

cagctgtgtc gcaaccgcaa cgcctacaag 1350

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.10-F

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<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.10-R

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.11-F

<400> 15

ttcagcgtga agaactgtgc gacgcgtttg 30

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<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.11-R

<400> 16

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.12-F

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<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.12-R

<400> 18

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> Enz.13-F

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<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.13-R

<400> 20

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.15-R

<400> 24

gcttcgttta gctgccagaa caggtcggcg 30

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<213> Artificial Sequence

<220>

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<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.16-R

<400> 26

ccgccagacg tttcggcaga cgcagaccc 29

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Km-F

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<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Km-R

<400> 28

gggtataaat gggctcgcg 19

<210> 29

<211> 1371

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Enz.17的核苷酸

<400> 29

atgccgaaca ctaacccaac taccgtgcgt cgtcgtcgtg ttattatgtt tccggttccg 60

ttcccgggcc acttaaaccc gatgctgcaa ctggcgaacg tgctgtaccg tagaggtttt 120

gaaatcacca ttctgcacac caacttcaac gccccgaaaa ccagccttta tccgcacttc 180

cagtttcgtt ttatcttgga caacgatccg caaccggagt ggttacgcaa cctgccgacg 240

actggtccgg gcgtgggtgc aagaatcccg gtaattaaca aacacggcgc ggatgaattc 300

cgtaaggagc tggaaatctg catgcgggat actccgagtg acgaggaagt tgcttgcgtg 360

attaccgatg cgctgtggta cttcgcgcaa ccggtggcgg acagcctgaa tctgaaacgt 420

ctggttctgc agaccgggag cctgtttaac ttccactgcc tggtgtgtct gccgaaattt 480

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ttcccgatgc tgaaggttaa agatatccgt cgcgcgtatt cgcacattca agaatcgaaa 600

ccaattctga tgaagatggt tgaagaaacc cgtgccagca gcggtgtgat ttggaacagc 660

gctaaagagc tggaggaaag cgagctggaa accattcagc gtgaaattcc ggcgccgagc 720

ttcctgcttc cgctgccgaa gcattatagg gcttcgagca ctagcctgct ggatactgat 780

ccgagcaccg cccaatggct ggaccagcag ccgccgagca gcgtgctgta cgttggcttt 840

ggcagccaga gctcgctgga ccccgcagat ttcctggaga ttgcgcgtgg tctggttgcg 900

agcaaacaaa gctttctgtg gctggttcgt ccgggcttcg tgaagggtta tgagtggatt 960

gagctgctgc cggatggttt tctgggtgaa aaaggtcgta tcgtgaagtc tgctccgcaa 1020

caagaagtgc tggcgcacaa ggcgattggt gcgttctgga cccacggcgg ttggaacggc 1080

accatggagg ccgtgtgcga aggcgtgccg atgatcttta gcgatttcgg tctggatcag 1140

ccgctgaacg cgcgttacat gagcgaggtt ctgcatgtgg gcgtttatct ggagaacggc 1200

ttcatccgtg gtgagatcat taatgcggtt aggcgtgtga tggttgaccc tgagggtgag 1260

gttatgcgcc aaaacgcgcg taaattgaag gataagttgg atcgaagcat tgctcccggt 1320

ggcagcagct acgagagcct ggaacgcctg cagagctata ttagcagcct g 1371