一种利用毒三素链霉菌发酵生产尼泊司他汀的培养基和培养方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种利用毒三素链霉菌发酵生产尼泊司他汀的培养基和培养方法。

背景技术

尼泊司他汀是一种用于生产减肥药奥利司他的医药中间体。奥利司他是由发酵物尼泊司他汀经一步加氢还原制得。奥利司他目前是全球唯一的减肥类药品，是长效和强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活而发挥治疗作用，失活的酶不能将食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身体吸收，从而减少热量摄入，控制体重。

目前国内采用发酵模式实现了尼泊司他汀的工业化生产，主要是通过工业应用比较多的微生物毒三素链霉菌发酵产尼泊司他汀，存在的问题主要是：

1国内文献资料公开了尼泊司他汀培养基配方中的碳源是植物油，氮源有蛋白胨(包含动物蛋白和植物蛋白)。发酵培养结束，发酵液粘度较高，其粘度>100mpa.s，为提取纯化利普斯他汀带来一定的难度。

2目前，国内相关文献资料公开了尼泊司他汀培养基配方和配伍比例，其适用于实验室条件或进行验证类试验，缺少完整的工业化大生产的培养基配方和配伍比例。同时，文献资料公开了尼泊司他汀种子培养、发酵和补料工艺。利用公开的文献资料，进行了工业化大生产验证，确认培养基配方和配伍比例后，在100m

发明内容

本发明的目的之一就在于提供一种有效降低尼泊司他汀发酵液粘度和生产成本，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现尼泊司他汀稳定、高效生产的培养基；本发明的另一目的在于提供一种尼泊司他汀发酵生产的培养方法。

本发明第一方面涉及一种利用毒三链霉菌发酵生产尼泊司他汀的培养基，具体方案是：

一种利用毒三素链霉菌发酵生产尼泊司他汀的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，

所述一级种子培养基组成为：

粗妥尔油酸6～10kg/m

所述二级种子培养基组成为：

粗妥尔油酸8～12kg/m

所述发酵培养基组成为：

粗妥尔油酸10～14kg/m3、米糠油9～14kg/m3、水解羽毛粉21-25kg/m3、牛肉骨粉23-27kg/m3、干黄酒糟16-20kg/m3、硫酸铵6-10kg/m3、十二烷基葡萄糖苷0.4-0.8L/m3、轻质碳酸钙1-5kg/m3、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂1-5L/m

本发明第二个方面是涉及一种利用上述培养基生产尼泊司他汀的培养方法，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养，至菌体浓度PMV至8-10％移种；

(2)二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养，至菌体浓度PMV至8-10％移种；

(3)发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，尼泊司他汀发酵单位＞13g/L时终止发酵。

所述步骤(3)中还包括通过加入饮用水、10-20％硫酸溶液调节发酵液pH至6.1-6.3，控制发酵液粘度为20-40mpa.s的步骤。

所述培养好的毒三素链霉菌摇瓶种子液质量要求为菌体浓度6～10％，镜检无杂菌，接种量为5-7％。

所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：20～60m

所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：60～100m

所述发酵培养条件为：

a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.4～6.6；

b温度：培养温度26～28℃；

c搅拌转速：转速控制在60～80r/min；

d压力控制：罐压0.05～0.06MPa；

e pH控制：发酵过程中pH控制在6.1～6.3；

f空气流量：120～160m

g粘度控制：使用数字式粘度计检测发酵液粘度，控制粘度20-40mpa.s。

所述补料工艺是指在发酵周期30-32h时，补入米糠油，用量是发酵液体积的3-5％；发酵周期92-94h时，补入米糠油，用量是发酵液体积的1-3％。

本发明取得了如下的至少一项有益效果：

1.原材料优势

碳源原材料：粗妥尔油是以松木为原料的纸浆厂从纸浆废液中回收的一种副产品，经减压精馏可分离得到粗妥尔油。它含有脂肪酸，占比30％-40％，脂肪酸主要由油酸和亚油酸组成。米糠油是稻谷加工大米的副产品米糠中的一种植物油，其脂肪酸组成比较完整，其脂肪酸中饱和脂肪酸占20％，不饱和脂肪酸占80％，不饱和酸中的油酸占38％，亚油酸占40％，它是典型的油酸—亚油酸型油脂。粗妥尔油和米糠油都是副产品，依据尼泊司他汀生化合成原理，使用它们替代常规植物油(葵花籽油、菜籽油、花生油、豆油、棕榈油)、油酸、亚油酸和其它脂肪酸，能够合成尼泊司他汀碳链骨架，并且有利用降低原料使用成本。

氮源材料：水解羽毛粉含粗蛋白质80％-85％，高于鱼粉，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的含量分别约为7.23％、6.78％、4.21％，高于其他动物性蛋白质；牛骨粉中骨蛋白是可溶性蛋白，其氨基酸含量达到了20％以上，亮氨酸和异亮氨酸的含量分别达到2％以上；干黄酒糟是酿黄酒过程中经过发酵蒸馏、干燥后得到的主要副产物，其中粗蛋白含量高达30％，氨基酸种类齐全，亮氨酸占氨基酸总量的9.54％，脂肪含量为16.7g/kg(DW)，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的57.77％，其中油酸占25.00％，亚油酸和α-亚麻酸2种必需脂肪酸占脂肪酸总量的11.27％。

综上所述，本专利阐述的培养基配方中，种子培养基和发酵培养基中碳源的总用量约72kg/m

2.尼泊司他汀发酵生产技术水平高。本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了尼泊司他汀最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产尼泊司他汀，在100m

具体实施方法

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

下述实施例的菌种来源：

生产使用的菌种来源为毒三素链霉菌摇瓶发酵液，质量要求为菌体浓度6～10％；镜检无杂菌，接种量为5-7％。

实施例1

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸12kg、米糠油8kg、水解羽毛粉46kg、牛肉骨粉56kg、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙2kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：20m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸80kg、米糠油60kg、水解羽毛粉200kg、牛肉骨粉210kg、干黄酒糟140kg、硫酸铵60kg、轻质碳酸钙10kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：60m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1000kg、米糠油900kg、水解羽毛粉2100kg、牛肉骨粉2300kg、干黄酒糟1600kg、硫酸铵600kg、十二烷基葡萄糖苷40L、轻质碳酸钙100kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂100L、硫酸镁1kg/、硫酸锌0.3kg、磷酸二氢钾2kg、硫酸亚铁0.2kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.4；培养温度26～28℃；转速控制在60r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：120m

实施例2

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸14kg、米糠油10kg、水解羽毛粉48kg、牛肉骨粉58kg、硫酸铵10kg、轻质碳酸钙4kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：30m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸90kg、米糠油70kg、水解羽毛粉210kg、牛肉骨粉220kg、干黄酒糟150kg、硫酸铵70kg、轻质碳酸钙20kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：70m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1100kg、米糠油1000kg、水解羽毛粉2200kg、牛肉骨粉2400kg、干黄酒糟1700kg、硫酸铵700kg、十二烷基葡萄糖苷50L、轻质碳酸钙200kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂200L、硫酸镁2kg/、硫酸锌0.4kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸亚铁0.3kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.4；培养温度26～28℃；转速控制在65r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：130m

实施例3

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸16kg、米糠油12kg、水解羽毛粉50kg、牛肉骨粉60kg、硫酸铵12kg、轻质碳酸钙6kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：40m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸100kg、米糠油80kg、水解羽毛粉220kg、牛肉骨粉230kg、干黄酒糟160kg、硫酸铵80kg、轻质碳酸钙30kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：80m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1200kg、米糠油1100kg、水解羽毛粉2300kg、牛肉骨粉2500kg、干黄酒糟1800kg、硫酸铵800kg、十二烷基葡萄糖苷60L、轻质碳酸钙300kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂300L、硫酸镁3kg/、硫酸锌0.5kg、磷酸二氢钾4kg、硫酸亚铁0.4kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.5；培养温度26～28℃；转速控制在70r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：140m

实施例4

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸18kg、米糠油14kg、水解羽毛粉52kg、牛肉骨粉62kg、硫酸铵14kg、轻质碳酸钙8kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：50m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸110kg、米糠油90kg、水解羽毛粉230kg、牛肉骨粉240kg、干黄酒糟170kg、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙40kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：90m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1300kg、米糠油1200kg、水解羽毛粉2400kg、牛肉骨粉2600kg、干黄酒糟1900kg、硫酸铵900kg、十二烷基葡萄糖苷70L、轻质碳酸钙400kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂400L、硫酸镁4kg/、硫酸锌0.6kg、磷酸二氢钾5kg、硫酸亚铁0.5kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.6；培养温度26～28℃；转速控制在75r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：150m

实施例5

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸20kg、米糠油16kg、水解羽毛粉54kg、牛肉骨粉64kg、硫酸铵16kg、轻质碳酸钙10kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：60m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸120kg、米糠油100kg、水解羽毛粉240kg、牛肉骨粉250kg、干黄酒糟180kg、硫酸铵100kg、轻质碳酸钙50kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：100m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1400kg、米糠油1300kg、水解羽毛粉2500kg、牛肉骨粉2700kg、干黄酒糟2000kg、硫酸铵1000kg、十二烷基葡萄糖苷80L、轻质碳酸钙500kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂500L、硫酸镁5kg/、硫酸锌0.7kg、磷酸二氢钾6kg、硫酸亚铁0.6kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.6；培养温度26～28℃；转速控制在80r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：160m

实施例6

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸12kg、米糠油8kg、水解羽毛粉54kg、牛肉骨粉64kg、硫酸铵16kg、轻质碳酸钙8kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：25m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸80kg、米糠油60kg、水解羽毛粉240kg、牛肉骨粉250kg、干黄酒糟180kg、硫酸铵100kg、轻质碳酸钙30kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：60m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1000kg、米糠油900kg、水解羽毛粉2500kg、牛肉骨粉2700kg、干黄酒糟2000kg、硫酸铵1000kg、十二烷基葡萄糖苷70L、轻质碳酸钙300kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂200L、硫酸镁1kg/、硫酸锌0.4kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸亚铁0.3kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.4；培养温度26～28℃；转速控制在70r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：130m

实施例7

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸20kg、米糠油16kg、水解羽毛粉46kg、牛肉骨粉56kg、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙30kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：50m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸120kg、米糠油100kg、水解羽毛粉200kg、牛肉骨粉210kg、干黄酒糟140kg、硫酸铵60kg、轻质碳酸钙40kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：100m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1400kg、米糠油1300kg、水解羽毛粉2100kg、牛肉骨粉2300kg、干黄酒糟1600kg、硫酸铵600kg、十二烷基葡萄糖苷70L、轻质碳酸钙400kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂400L、硫酸镁3kg/、硫酸锌0.6kg、磷酸二氢钾6kg、硫酸亚铁0.6kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.5；培养温度26～28℃；转速控制在70r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：150m

实施例8

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸14kg、米糠油10kg、水解羽毛粉54kg、牛肉骨粉64kg、硫酸铵16kg、轻质碳酸钙20kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：45m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸90kg、米糠油70kg、水解羽毛粉240kg、牛肉骨粉250kg、干黄酒糟180kg、硫酸铵100kg、轻质碳酸钙20kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：90m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1100kg、米糠油1000kg、水解羽毛粉2500kg、牛肉骨粉2500kg、干黄酒糟1800kg、硫酸铵900kg、十二烷基葡萄糖苷90L、轻质碳酸钙300kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂300L、硫酸镁4kg/、硫酸锌0.7kg、磷酸二氢钾5kg、硫酸亚铁0.4kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.5；培养温度26～28℃；转速控制在75r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：150m

实施例9

一级种子培养：种子液体积2m

粗妥尔油酸20kg、米糠油12kg、水解羽毛粉52kg、牛肉骨粉62kg、硫酸铵14kg、轻质碳酸钙10kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：40m

二级种子培养：种子液体积10m

粗妥尔油酸120kg、米糠油100kg、水解羽毛粉230kg、牛肉骨粉240kg、干黄酒糟170kg、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙30kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：80m

发酵培养：发酵培养基体积100m

粗妥尔油酸1400kg、米糠油1300kg、水解羽毛粉2400kg、牛肉骨粉2300kg、干黄酒糟1600kg、硫酸铵900kg、十二烷基葡萄糖苷80L、轻质碳酸钙400kg、SXP-107有机硅聚醚复合消泡剂300L、硫酸镁1kg/、硫酸锌0.7kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸亚铁0.3kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.5；培养温度26～28℃；转速控制在70r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：140m

上述实施例1-9按照以下工艺进行补料

发酵周期30-32h时，补入米糠油，用量是发酵液体积的3-5％；发酵周期92-94h时，补入米糠油，用量是发酵液体积的1-3％。

对比实施例1

一级种子培养：种子液体积2m

甘油40kg、豆油80kg、黄豆粉60kg、蛋白胨40kg、酵母粉20kg，硫酸铵6kg、轻质碳酸钙10kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：40m

二级种子培养：种子液体积10m

甘油200kg、豆油400kg、黄豆粉300kg、蛋白胨200kg、酵母粉100kg、硫酸铵30kg、轻质碳酸钙40kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：80m

发酵培养：发酵培养基体积100m

甘油2000kg、豆油4000kg、黄豆粉3000kg、蛋白胨2000kg、酵母粉1000kg、硫酸铵300kg、卵磷脂40kg、轻质碳酸钙400kg有机硅消泡剂500L、硫酸镁2kg/、硫酸锌0.6kg、磷酸二氢钾4kg、硫酸亚铁0.4kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.5；培养温度26～28℃；转速控制在70r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：140m

补料工艺：发酵周期30-32h时，补入甘油，用量是发酵液体积的3-5％；发酵周期92-94h时，补入甘油，用量是发酵液体积的1-3％。

发酵培养结束，尼泊司他汀发酵单位9.1g/L。

对比实施例2

一级种子培养：种子液体积2m

甘油20kg、葡萄糖80kg，脱脂豆粉70kg、麦芽提取物40kg、酵母提取物20kg，琼脂20kg,硫酸铵6kg、轻质碳酸钙10kg。

首先将一级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的毒三素链霉菌母瓶液接入一级种子培养基中进行培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：50m

二级种子培养：种子液体积10m

甘油200kg、葡萄糖400kg、脱脂豆粉350kg、麦芽提取物200kg、酵母提取物100kg、琼脂100kg、硫酸铵20kg、轻质碳酸钙30kg；

首先将二级种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后接入一级种子培养基中进行培养。二级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温27～28℃；空气流量：70m

发酵培养：发酵培养基体积100m

甘油2000kg、豆油4000kg、脱脂豆粉3500kg、麦芽提取物2000kg、酵母提取物1000kg、琼脂1000kg、硫酸铵300kg、卵磷脂30kg、轻质碳酸钙400kg有机硅消泡剂400L、硫酸镁3kg/、硫酸锌0.5kg、磷酸二氢钾5kg、硫酸亚铁0.3kg。

先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，发酵培养基灭菌后pH控制在6.5；培养温度26～28℃；转速控制在70r/min；罐压0.05～0.06MPa；发酵过程中pH控制在6.1～6.3；空气流量：140m

补料工艺：发酵周期30-32h时，补入亚油酸，用量是发酵液体积的3-5％；发酵周期92-94h时，补入亚油酸，用量是发酵液体积的1-3％。

发酵培养结束，尼泊司他汀发酵单位7.5g/L。