一种用于头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性和/或化疗预后评估的环状RNA标志物及试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性和/或化疗预后评估的环状RNA标志物及试剂盒。

背景技术

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是临床最常见的头颈部恶性肿瘤。尽管已经做出了许多努力，HNSCC患者的存活率仍然不理想，5年生存率仅40％–50％。顺铂和5-氟尿嘧啶联合使用，或CDDP、5FU和多西他赛三者联合使用是目前HNSCC最常用的化疗方案。然而研究显示，为逃避多种化疗药物的作用，肿瘤细胞已进化出多种功能，包括药物流入过少或外流过多、药物失活或缺乏激活、药物靶标表达水平的改变、激活适应性生存反应。这使得HNSCC对化疗药物的敏感性降低，最终导致HNSCC持续生长和转移扩散。因此，探究头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性降低的机制，发现头颈部鳞癌化疗预后的分子标记物，进而早期增强头颈部鳞状细胞癌的化疗敏感性对于改善患者化疗预后，提高其生活质量具有重要意义。遗憾的是，目前尚无有效预测及早期诊断头颈鳞癌化疗敏感性的分子标记物。

中国发明专利申请“CN108660207A用于头颈部鳞状细胞癌诊断的循环长链非编码RNA生物标志物和试剂盒及用途”提供了一种用于头颈部鳞状细胞癌诊断的RNA生物标志物。然而，该RNA生物标志物仅能够对HNSCC进行诊断，无法对头颈鳞癌化疗敏感性进行预测。

在真核细胞中，mRNA前体可以通过反向拼接，将3’段与5’端相结合，进而产生包含外显子或内含子序列的环状RNA。环状RNA的表达具有组织特异性和细胞特异性。因为环状RNA缺乏5’端帽状结构及3’端多聚腺苷酸尾部结构，目前生物学界普遍认为相比于普通线状RNA，该RNA的稳定性更佳。已有大量文献报道在不同种类的人类恶性肿瘤中,不同的环状RNA都发挥了重要作用。然而，目前尚未有环状RNA在HNSCC的化疗敏感性预测或诊断中应用的相关研究。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种用于头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性和/或化疗预后评估的环状RNA标志物及试剂盒。目的在于：提供一种新的标志物，实现对头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性和/或化疗预后的评估。

一种环状RNA，它是序列如SEQ ID NO.5所示的circTPST2。

本发明还提供检测上述环状RNA表达水平的试剂在预测或辅助预测头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性的试剂盒中的用途，和/或，在预测或辅助预测头颈部鳞状细胞癌化疗预后的试剂盒中的用途。

本发明还提供预测或辅助预测头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性和/或化疗预后的试剂盒，它包括用于特异性检测上述环状RNA的表达水平的试剂A。

优选的，所述试剂A用于特异性识别所述环状RNA逆转录得到的cDNA。

优选的，所述试剂A为引物对A，所述引物对A中，正向引物为SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列或者与前述序列具有95％同源性的核苷酸序列，反向引物为SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列或者与前述序列具有95％同源性的核苷酸序列。

优选的，所述引物对A中正向引物与反向引物的用量摩尔比为1:1。

优选的，还包括用于特异性检测GAPDH的试剂B。

优选的，所述试剂B为引物对B，所述引物对B中，正向引物为SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列或者与前述序列具有95％同源性的核苷酸序列，反向引物为SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列或者与前述序列具有95％同源性的核苷酸序列。

优选的，所述引物对B中正向引物与反向引物的用量摩尔比为1:1。

本发明还提供一种非诊断和治疗目的的头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性测评方法，以权利要求1所述的环状RNA在头颈部鳞状细胞癌细胞中的表达水平作为生物标志物。

所述非诊断和治疗目的的头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性测评方法可以用于头颈部鳞状细胞癌的医学研究和化疗药物开发等。

本发明中，提供了一种存在于头颈部鳞状细胞癌细胞中的环状RNA标志物circTPST2(circ-103188)，它是由TPST2基因第三个外显子独自环化形成，其序列如SEQ IDNO.5所述。

通过实验研究发现，在使用化疗药物后，本发明提供的标志物在头颈部鳞状细胞癌细胞中的表达含量与化疗药物对头颈部鳞状细胞癌细胞的IC

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为对circTPST2的测序结果；

图2为通过Rnase R酶消化试验确定其为环状RNA的结果；

图3为利用核质分离实验发现circTPST2定位于细胞核和的结果；

图4为利用TCGA数据库临床队列分析发现circTPST2与化疗后头颈鳞癌预后相关的结果；

图5为各细胞系中circTPST2的相对表达量与顺铂的IC

具体实施方式

以下实施例和实验例所用的材料均为市售，具体如下：

总RNA提取试剂盒，购自北京天漠科技。

TRIcom、RNA洗涤液1和RNA洗涤液2为总RNA提取试剂盒自带。

Oligo(dT)primer，Takara(日本)

dNTP，购自Takara(日本)

10xRT Buffer，购自Takara(日本)

RNase Inhibitor，购自Thermo Fisher(美国)

M-MuLV Reverse Transcriptase，购自Takara(日本)

SYBR标准反应缓冲液，购自Life-ABI(美国)

实施例1头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性和/或化疗预后评估

本实施例的标志物为头颈部鳞状细胞癌中的circTPST2(circ-103188)。图1为对circTPST2的测序结果。图2为通过Rnase R酶消化试验确定其为环状RNA的结果。图3为核质分离实验结果，该实验验证了circTPST2主要存在于细胞质的结果。图4为利用TCGA数据库临床队列分析发现circTPST2高表达与头颈鳞癌患者化疗较差相关。

为了检测circTPST2的表达含量，本实施例所用的试剂盒包括如下引物：

表1引物对

本实施例的化疗敏感性和/或化疗预后评估方法包括如下步骤：

1.采用总RNA提取试剂盒进行RNA的提取

(1)取生长状态良好的处于对数生长期的头颈部鳞状细胞癌细胞，加入1mlTRIcom，吹打静止5min，细胞脱壁后转移至提前灭菌好的RNase-free离心管中，300×g离心5分钟，小心吸出上清，注意不吸到下方沉淀。

(2)样品纯化(以下离心力均在10000-16000×g范围内进行)：

向上清中加入等体积的无水乙醇到上一步吸出的上清中。放入离心柱，离心1分钟，去除滤出液。添加400ul的RNA洗涤液1到离心柱里，离心1分钟。去除滤出液。添加700ul的RNA洗涤液2到离心柱里，离心1分钟。去除滤出液。空转2分钟去除残留乙醇。取出离心管，放入提前消好的RNA酶free EP管中，加入适量(10-20ul)RNase-free water，室温放置2分钟，离心1分钟，洗脱RNA，重复一次，使离心管上RNA充分溶解。得到含有circTPST2的细胞总RNA样品。细胞总RNA样品可暂时放置于-80℃冰箱，但应尽快将其逆转录。

2.进行cDNA的合成

(1)RT反应体系组成：

以上体系70℃反应5分钟，迅速转移至冰上，继续下一步反应。

(2)反应体系组成：

以上体系共40μl，42℃反应60分钟，95℃反应5分钟。得到cDNA模板的溶液，置于冰上。

3.进行qPCR反应

(1)配制如下反应体系组成：

其中，当正向引物和反向引物分别为circTPST2-F和circTPST2-R时，用于检测circTPST2的表达水平。当正向引物和反向引物分别为GAPDH-F和GAPDH-R时，用于检测GAPDH的含量。

(2)进行PCR检测，反应程序：

4、计算相对表达量

通过以上方法分别对4株HNSCC细胞进行检测。得到circTPST2和GAPDH的Ct值。

对于实验组(test)和对照组(control)通过如下公式计算得到ΔCt(test)和ΔCt(control)：

ΔCt＝Ct(circTPST2)-Ct(GAPDH)

再通过如下公式计算得到ΔΔCt：

ΔΔCt＝ΔCt(test)-ΔCt(control)

2

实验例1顺铂的IC50与circTPST2的相对表达量的关系

1、实验方法

转染后细胞培养24h后，将细胞置于96孔板(每孔6x104个细胞)中，用不同浓度(1、2、4、8、16、32mg/ml)的顺铂(sigma，美国)孵育48小时。用CCK8测定细胞增殖，即每孔加入10ul CCK8，用分光光度计在450nm处检测吸光度，然后分析顺铂对每个细胞系的IC

2、实验结果

如图5所示，各细胞系中，circTPST2的相对表达量与顺铂的IC

通过上述实施例和实验例可以看到，利用本发明提供的标志物的表达含量，能够对头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性和/或化疗预后进行评估。帮助临床医生合理选择治疗方案，提高患者生存率，具有很高的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种用于头颈部鳞状细胞癌化疗敏感性和/或化疗预后评估的环状RNA标志物

及试剂盒

<130> GYKH1622-2021P0113053CC

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

catggaggta ggcaaggaga a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggctcacatt tggacaggga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccatcaccat cttccaggag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgatgaccc ttttggctcc 20

<210> 5

<211> 930

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

augugagccu ggcgggcugc ccgcuaaccu gucgcugaag ccccagaagc gggcccucag 60

gccaggccua cccugccucc ggcccagcau gcgccugucg gugcggaggg ugcugcuggc 120

agccggcugc gcccuggucc uggugcuggc gguucagcug ggacagcagg ugcuagagug 180

ccgggcggug cuggcgggcc ugcggagccc ccggggggcc augcggccug agcaggagga 240

gcuggugaug gugggcacca accacgugga auaccgcuau ggcaaggcca ugccgcucau 300

cuucgugggu ggcgugccuc gcaguggcac cacguugaug cgcgccaugc uggacgcgca 360

ccccgaggug cgcugcggcg aggagacccg caucaucccg cgcgugcugg ccaugcgcca 420

ggccuggucc aagucuggcc gugagaagcu gcggcuggau gaggcggggg ugacggauga 480

ggugcuggac gccgccaugc aggccuucau ccuggaggug auugccaagc acggagagcc 540

ggcccgcgug cucugcaaca aggacccauu uacgcucaag uccucggucu accugucgcg 600

ccuguucccc aacuccaagu uccugcugau ggugcgggac ggccgggccu ccgugcacuc 660

caugaucacg cgcaaaguca ccauugcggg cuuugaccuc agcagcuacc gugacugccu 720

caccaagugg aacaaggcca ucgaggugau guacgcccag ugcauggagg uaggcaagga 780

gaagugccug ccuguguacu acgagcagcu ggugcugcac cccaggcgcu cacucaagcu 840

cauccucgac uuccucggca ucgccuggag cgacgcuguc cuccaccaug aagaccucau 900

uggcaagccc gguggugucu cccuguccaa 930