链霉菌菌株GZUIRF-Y1、制备纤维素酶发酵液的方法、及应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵及应用技术领域，具体涉及链霉菌菌株GZUIRF-Y1、制备纤维素酶发酵液的方法、及应用。

背景技术

随着自然界石化能源资源的枯竭，可再生能源越来越受到重视，特别是木质纤维素，作为自然界中储存量最为丰富的可再生资源，与其有关的生物炼制产业很有可能成为解决我国石化资源紧张的有效途径之一。在生物质原料的生物转化过程中，木质纤维素的难降解特性是将其转化可发酵糖类的重要障碍，而提高纤维素酶及半纤维素酶的表达量可有效降低木质纤维素生物转化的成本。

纤维素是一种多糖，其分子式为(C

因此，降低烟草中纤维素的含量不仅可以改善吸食品质，对吸食安全性也有一定的促进作用。

降解烟草中纤维素含量可以采取纤维素酶解法。如果能从烟草中提取能够产生纤维素酶的菌，则更能适应。目前尚无这方面的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有产纤维素酶能力的链霉菌菌株GZUIRF-Y1，其可以产生纤维素酶。

本发明的目的还在于提供一种利用上述链霉菌菌株GZUIRF-Y1制备纤维素酶发酵液的方法。

本发明的目的还在于提供一种上述链霉菌菌株GZUIRF-Y1在纤维素降解方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明第一方面实施例，提供一种链霉菌菌株GZUIRF-Y1，所述链霉菌菌株GZUIRF-Y1分类命名为Streptomyces sp，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日：2020.11.18，保藏编号：CCTCC M 2020758GZUIRF-Y1，所述链霉菌属于细菌界Bacteria，放线菌门Actinobacteria，放线菌纲Actinomycetia，链霉菌目Streptomycetales，链霉菌科Streptomycetaceae，链霉菌属Streptomyces。

根据本发明第二方面实施例，提供一种利用上述链霉菌菌株GZUIRF-Y1制备纤维素酶发酵液的方法，包括：

将所述链霉菌菌株GZUIRF-Y1接种到CMC发酵培养基中进行液体发酵，得到所述纤维素酶发酵液。

进一步地，在所述CMC发酵培养基中的接种量为1.5％-3％。

进一步地，在30-45℃下，以150-300r/min旋转的同时培养12-60小时。

根据本发明第三方面实施例，还提供链霉菌菌株GZUIRF-Y1在纤维素降解方面的应用。

进一步地，所述应用为对烟草进行处理。

进一步地，所述对烟草的处理包括如下步骤：

步骤S1，将所述链霉菌菌株GZUIRF-Y1接种到CMC发酵培养基中进行液体发酵，得到纤维素酶发酵液；

步骤S2，将所述纤维素酶发酵液添加到所述烟草中，在30-45℃下培养4-24小时，以对所述烟草中的纤维进行降解；

步骤S3，降解反应结束后，在80-85℃下进行加热，使其中的纤维素酶灭活，得到处理后的烟草。

进一步地，所述步骤S1中，所述步骤S1中，在所述CMC发酵培养基中的接种量为1.5％-3％。

进一步地，在所述步骤S2中，所述纤维素酶发酵液的添加量为5％-20％。

此外，所述应用还可以为进行堆肥发酵或生活垃圾降解处理。

本发明的上述技术方案至少具有如下有益效果之一：

根据本发明第一方面实施例的链霉菌菌株GZUIRF-Y1，具有较高的纤维素等生物质降解活性；

此外，利用根据本发明第一方面实施例的链霉菌菌株GZUIRF-Y1，能够制备出具有较高的纤维素降解活性的纤维素酶发酵液；

此外，根据本发明第一方面实施例的链霉菌菌株GZUIRF-Y1，用于烟草中的纤维素降解具有很好的适应性；

此外，根据本发明第一方面实施例的链霉菌菌株GZUIRF-Y1，在用于堆肥发酵、生活垃圾降解能获得很好的效果，缩短了堆肥发酵周期，且处理后的生活垃圾具有较高的腐解速率。

附图说明

图1为本发明提供的链霉菌菌株GZUIRF-Y1的通过系统发育树；

图2为本发明提供的链霉菌菌株GZUIRF-Y1在不同培养基上的生长情况，其中，(A)示出了在牛肉膏蛋白胨上的生长情况，(B)示出了在选择鉴别培养基上的生长情况；

图3为本发明提供的链霉菌菌株GZUIRF-Y1在CMC平板上刚果红染色情况示意图；

图4为本发明提供的纤维素酶发酵液的酶活性试验结果示意图；

图5为根据本发明提供的链霉菌菌株GZUIRF-Y1处理烟叶2个月后的烟叶纤维素含量试验结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 链霉菌菌株GZUIRF-Y1的筛选和鉴定

(1)培养基制备

富集筛选培养基：CMC-Na 10.0g，K

选择鉴别培养基：CMC-Na 1.0g，(NH

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，水1000ml，pH自然。

以上培养基均121℃，灭菌30min。

(2)筛选

产纤维素酶微生物菌株的初筛：称取陈化烟叶(云南保山A3C2D2)15g，剪碎，分别加入到含有150ml磷酸盐(PBS)缓冲液的250mL三角瓶中，置入28℃、180r/min，30min洗脱菌液。按2％的接种量吸取菌液到上述富集筛选培养基中，置入28℃、180r/min，培养3d，然后按同样的方法继续转接入富集培养基进行第二次富集培养。再将其二次富集培养后的菌液稀释到不同的浓度，分别吸取1mL 10

产纤维素酶微生物菌株的复筛：将分离得到的菌株接种在上述选择鉴别培养基上，28℃培养72h后，用0.2％刚果红染色30min，然后用蒸馏水洗去染液，再用1mol/L的NaCl溶液脱色30min，观察菌落周围是否有透明水解圈产生，其水解圈大小可大致反映出该菌株的酶活力高低。从而筛选出高酶活力微生物菌株，保存于斜面培养基中。

(3)鉴定

根据伯杰氏细菌鉴定手册，首先通过形态观察和生理化试验确定该菌株为链霉菌株。

此后，从根据上述筛选得到的菌株GZUIRF-Y1中提取基因组DNA，利用16SrDNA特定引物27F/1492R，通过PCR扩增和测序分析得到16SrDNA序列，其序列如Seq ID No.1所示。

Seq ID NO.1

tgggcgggtgcttaccatgcagtcgaacgatgaagcctttcggggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggataacactctgtcccgcatgggacggggttaaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggatgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggctagctagagtgtggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgttggcgacattccacgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatataccggaaagcatcagagatggtgccccccttgtggtcggtatacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaa

另外，对于所得到的序列，与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析，该菌株与Streptomyces sp.的基因序列同源性达到99％以上，图1示出了该菌株GZUIRF-Y1的16SrDNA系统发育树。

由图1可知，上述筛选得到的菌株GZUIRF-Y1生理生化结果与链霉菌相符，属于放线菌门下的链霉菌属。

(4)评价

将根据上述筛选出的菌株GZUIRF-Y1，采用划线法接种在上述牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃培养5天后，其结果如图2中(A)所示，菌落呈白色圆形，表面有绒状，干燥，会分泌咖啡色色素，同时产生一股浓烈生物土腥气味，表明该菌株属于放线菌类菌群，会产生土臭素等挥发性物质。

此外，将根据上述筛选出的菌株GZUIRF-Y1，接种在上述选择鉴别培养基上，在30℃培养3天后，其结果如图2中(B)所示，菌落呈白色圆形，表面有绒状，干燥，无色素产生。菌株GZUIRF-Y1革兰氏染色为紫色，表明该菌株GZUIRF-Y1为革兰氏阳性菌。

将该菌株GZUIRF-Y1接种在选择鉴别培养基上，30℃培养3天，此后用0.2％刚果红溶液染色，其结果如图3所示。由图3可知，在菌落周围出现透明水解圈，表明该菌株具有较高的纤维素等生物质降解活性。

实施例2 纤维素酶发酵液的制备及性能评价

(1)制备

首先，制备CMC发酵培养基:CMC-Na 10.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，水1000ml，pH自然。121℃，灭菌30min。

其次，将实施例1筛选得到的菌株GZUIRF-Y1接种到CMC发酵培养基中，30℃，200r/min培养活化24h。按照2％的接种量，将所培养的菌液再次转接到CMC发酵培养基中，在30℃下，以200r/min旋转培养48小时，此后以8000rpm离心10分钟，得到纤维素酶发酵液。

(2)评价

取上述发酵液分别测定CMC酶活、滤纸酶活、以及外切酶活。

标准曲线绘制：原理：DNS(3,5-二硝基水杨酸)与还原糖一起沸水浴后可生成棕红色的氨基化合物，因还原糖含量的不同其生成物的量也有差异，然后导致其反应颜色深浅不一，可通过其在540nm处的吸光值来判断生成物的量，进一步可换算成溶液中还原糖的量。方法：取9支25ml刻度试管，分别加人0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml的葡萄糖(lmg/mL)标准溶液，均补水至2ml，再加人1.5ml DNS试剂混合均匀，沸水浴中加热5min，取出用流动水冷却至室温，定容至25ml，混匀后置于540nm波长处测定OD值，以上每组至少做3个重复，然后以OD

表1 葡萄糖标准曲线绘制

内切纤维素酶活性(CMCase)测定：取纤维素酶发酵液1.0mL于25mL刻度试管中，加人0.5％CMC-Na的柠檬酸缓冲液(pH5.0，0.05mol/L)1.0mL，50℃恒温水浴30min后，按DNS法测定还原糖含量，对照标准曲线计算酶活。以高温灭活的发酵液作对照。在上述实验条件每30min产生1.0μg还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(U/mL)。

滤纸酶活性(FPase)的测定：取纤维素酶发酵液1.0mL于25mL刻度试管中，加人1.0mL柠檬酸缓冲液(pH4.5，0.05mol/L)，再加人滤纸条50mg，50℃恒温水浴1h后，按DNS法测定还原糖，对照标准曲线计算酶活。以高温灭活的酶发酵液作为对照。在上述实验条件下每1h产生1.0μg还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(U/mL)。

外切纤维素酶活性测定：取纤维素酶发酵液1.0mL于25mL刻度试管中加人50mg脱脂棉，再加人1.0mL柠檬酸缓冲液(pH5.0，0.05mol/L)，50℃恒温水浴24h后，按DNS法测定还原糖，对照标准的线计算酶活。以高温灭活的粗酶液作为对照。在上述实验条件下每24h产生1.0μg还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(U/mL)。

结果如图4所示，该纤维素酶发酵液的CMC酶活力达到111.00±1U/mL，滤纸酶活为105.00±1U/mL，外切酶活达到86.00±4U/mL。结果表明根据该纤维素酶发酵液具有很高的纤维素降解能力。

实施例3 烟草处理

(1)菌剂制备

首先，制备CMC发酵培养基:CMC-Na 10.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，水1000ml，pH自然。121℃，灭菌30min。

其次，将实施例1筛选得到的菌株GZUIRF-Y1接种到CMC发酵培养基中，30℃，200r/min培养活化24h。按照2％的接种量，将所培养的菌液再次转接到CMC发酵培养基中，在30℃下，以200r/min旋转培养48小时。吸取培养液，用无菌水稀释至100倍即为菌剂。

(2)烟叶处理：

将上述菌剂以10％(30mL)的接种量用喷雾器均匀喷施于300g的片烟(年份：2020，产地：贵州黔南，等级：A3CH2)表面，对照用无菌水代替。将喷施菌剂处理后的片烟置于30℃下进行平衡48h后，用纸箱包装密封后储存于22℃、65％的恒温恒湿箱中发酵培养，发酵2个月后取样检测烟叶纤维素含量。

(3)烟叶纤维素含量测定

试剂：2％蒽酮试剂：将2g蒽酮溶解于100mL乙酸乙酯中，贮放于棕色试剂瓶中；纤维素标准液：准确称取100mg纯纤维素，放入100mL量瓶中，将量瓶放入冰浴中，然后加冷的60％H

纤维素标准回归方程测定：①6支小试管，分别放入0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00mL纤维素标准液，然后分别加入2.00、1.60、1.20、0.80、0.40、0mL蒸馏水，摇匀，则每管依次含纤维素0，40，80，120，160，200ug。②向每管加0.5mL 2％蒽酮，再沿管壁加5.0mL浓H

烟叶样品纤维素含量的测定：①称取风干的烟叶粉末0.2g于烧杯中，将烧杯置冷水浴中，加入60％H

Y(％)＝X×10

式中：X－按回归方程计算出纤维素含量(ug)。W－样品重(g)。10

(4)评价

图5示出了利用实施例1筛选得到的菌株GZUIRF-Y1处理2个月后的烟叶纤维素含量，作为对照，以相同的方法测定了原始样、水处理样品的纤维素含量。

由图5可知，根据上述实施例1筛选得到的链霉菌GZUIRF-Y1处理2个月后的烟叶纤维素含量显著低于原始样(CK)和水处理样品的纤维素含量。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 贵州中烟工业有限责任公司

<120> 链霉菌菌株GZUIRF-Y1、制备纤维素酶发酵液的方法、及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 链霉菌菌株GZUIRF-Y1

<400> 1

tgggcgggtg cttaccatgc agtcgaacga tgaagccttt cggggtggat tagtggcgaa 60

cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct tcactctggg acaagccctg gaaacggggt 120

ctaataccgg ataacactct gtcccgcatg ggacggggtt aaaagctccg gcggtgaagg 180

atgagcccgc ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc ctaccaaggc gacgacgggt 240

agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300

gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga 360

gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgaa agtgacggta 420

cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa 480

gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcacg tcggatgtga 540

aagcccgggg cttaaccccg ggtctgcatt cgatacgggc tagctagagt gtggtagggg 600

agatcggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg 660

aaggcggatc tctgggccat tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga 720

ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gttgggaact aggtgttggc gacattccac 780

gtcgtcggtg ccgcagctaa cgcattaagt tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct 840

aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcagcgg agcatgtggc ttaattcgac 900

gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac atataccgga aagcatcaga gatggtgccc 960

cccttgtggt cggtatacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1020

ggttaa 1026

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 通用引物27F

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 通用引物1492R

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19