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弱化鸟苷酸激酶在提高菌株生产核苷或其衍生物的能力中的应用

文献发布时间：2023-06-19 18:32:25

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种弱化鸟苷酸激酶在提高菌株生产核苷或其衍生物的能力中的应用。

背景技术

核苷是一类糖苷的总称，是核酸和核苷酸的组成成分。核苷都是由D-核糖或D-Z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由D-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成，由D-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。D-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。

腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷除了可以用作治疗心脏的特效药物之外，还是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，广泛应用于医药等行业。

鸟嘌呤核苷，又名9-β-D-呋喃核糖鸟嘌呤，以下也称鸟苷，具有多种用途，在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷是鸟苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料

肌苷，化学名称：9-β-D-核糖次黄嘌呤。系细胞代谢改善药，参与体内核酸代谢，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，参与细胞的能量代谢和蛋白质合成，提高各种酶，特别是辅酶A与丙酮酸氧化酶的活性，从而使细胞在缺氧状态下继续进行代谢，活化肝脏功能，促进受损伤肝脏的恢复，可刺激体内产生抗体并促进肠道对铁的吸收。适用于各种慢性肝脏疾患、心脏疾患、白血球或血小板减少症、中心性视网膜炎等，并可预防接触锑剂引起的对肝脏心脏的副作用。

嘌呤核苷既可通过化学法合成，也可通过微生物发酵法合成，并且微生物发酵法由于其诸多的优势(条件温和、环境污染小)，已成为主流生产方法。但发酵法的缺点则是成本高、转化率低。因此，亟待通过代谢工程的手段，改善菌种性能。

目前核苷生产菌性能提升的主要手段是嘌呤操纵子的优化以及核苷外运蛋白基因pbuE改造。包括purF等嘌呤操纵子基因的过表达、嘌呤操纵子核糖开关优化、pbuE基因点突变优化等。鲜有文献报道其他基因位点对核苷生产菌性能提升的作用效果。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供弱化鸟苷酸激酶在提高菌株生产核苷或其衍生物的能力中的应用。

第一方面，本发明提供弱化鸟苷酸激酶在提高菌株生产核苷或其衍生物的能力中的应用。

进一步地，所述弱化鸟苷酸激酶为通过抑制所述菌株中鸟苷酸激酶的表达得到；优选地，所述鸟苷酸激酶包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述抑制所述菌株中鸟苷酸激酶的表达，包括如下任意一种或多种：

I)所述鸟苷酸激酶发生点突变导致弱化；

II)所述鸟苷酸激酶的编码基因发生基因片段缺失或提前终止导致弱化；

III)所述鸟苷酸激酶的编码基因发生起始密码子弱化导致弱化；

IV)所述鸟苷酸激酶的编码基因发生调控区弱化导致弱化。

进一步地，所述点突变为鸟苷酸激酶发生如下突变方式中的任意一种或多种：

第66位异亮氨酸突变为甲硫氨酸、第105位缬氨酸突变为亮氨酸、第133位天冬酰胺突变为赖氨酸；

和/或，所述起始密码子弱化为所述鸟苷酸激酶的编码基因的起始密码子由ATG变为GTG或TTG；

和/或，所述调控区弱化包括：替换所述鸟苷酸激酶的编码基因的启动子，或-10区和/或-35区发生突变。

进一步地，方式II)得到弱化鸟苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

方式III)得到的弱化鸟苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

方式IV)得到的弱化鸟苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，序列如SEQ IDNo.10所示。

进一步地，所述菌株为：

枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或产氨棒杆菌。

进一步地，所述核苷为苷、肌苷、鸟苷或黄苷中的一种或多种。

第二方面，本发明提供一种ylzA蛋白突变体，所述ylzA蛋白突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的ylzA蛋白经过如下任意一种或多种突变得到：

第77位亮氨酸突变为精氨酸、第81位谷氨酸突变为甘氨酸、第85位天冬氨酸突变为谷氨酸。

第三方面，本发明提供一种重组微生物，包括所述应用中述及的弱化鸟苷酸激酶和/或所述ylzA蛋白突变体

进一步地，所述重组微生物的出发菌株为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或产氨棒杆菌。

本发明进一步提供所述重组微生物在生产核苷或其衍生物中的应用。

本发明具备如下有益效果：

本发明发现在抑制菌株中鸟苷酸激酶表达或突变ylzA蛋白后，可以提高菌株的核苷生产能力，并进一步提供了鸟苷酸激酶和ylzA蛋白的突变体以及其对应的多个突变位点。本发明经过试验验证，在鸟苷酸激酶表达受到抑制或ylzA蛋白突变后，菌株的核苷产量显著提高，这说明弱化的鸟苷酸激酶或突变的ylzA蛋白在核苷合成过程中发挥显著作用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。本发明所用到的原始菌株B.amyloliquefaciens 13952(NCBI参考基因序列为CP009748.1)、B.subtilis A5为本实验室保存。本发明所用到的腺苷、鸟苷和肌苷标准品从Sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买，所用DNA聚合酶、DNA纯化试剂盒、限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Ther mo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

其中，各实施例涉及的引物序列如表1所示。

表1引物序列

实施例1：诱变筛选获得鸟苷高产菌株

本实施例中，B.amyloliquefaciens ATCC13952在前期经过多轮诱变筛选后，获得了B.amyloliquefaciens MHA诱变菌株，该菌在摇瓶产鸟苷水平为18g/L，转化率15％，为一株鸟苷高产菌。

通过比较基因组学分析，B.amyloliquefaciens MHA具有gmk

实施例2：工程菌株B.amyloliquefaciens G11(gmk

用引物gmk66-A-1f/1r和gmk66-A-2f/2r、gmk105-A-1f/1r和gmk105-A-2f/2r、gmk133-A-1f/1r和gmk133-A-2f/2r，以B.amyloliquefaciens 13952基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到gmk

用引物gmk66-A-1f/2r、gmk105-A-1f/2r、gmk133-A-1f/2r、和ylzA-A-1f/2r融合上下游片段分别得到A-gmk

通过电化学转化至B.amyloliquefaciens 13952(Δupp)中，用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含5μg/mL的氯霉素LB平板获得一次重组子。

将一次重组子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM 5-FU的LB平板筛选二次重组子，得到分别在B.amyloliquefaciens 13952Δupp引入gmk

实施例3：工程菌株B.amyloliquefaciens G14构建(引入Δgmk突变)

为了进行酶活实验的对比，本发明同时对鸟苷酸激酶进行失活改造，具体流程如下：

用引物Δgmk-A-1f/1r，以B.amyloliquefaciens 13952基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到Δgmk的上下游同源臂；

用引物Δgmk-A-1f/2r融合上下游片段分别得到Δgmk同源片段(含有402bp的敲除修饰，完整A-Δgmk*基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示共213bp，氨基酸序列如SEQID No.5所示共70个氨基酸序列)，将各片段分别与pKSU(工具载体)质粒经SalI/PstI双酶切、连接、转化等操作后分别得到质粒pKSU-A-Δgmk。筛选方法同实施例2。

实施例4：工程菌株B.amyloliquefaciens G11、G12、G13、G14和B.amyloliquefaciens13952鸟苷酸激酶活性对比

用引物gmk-S-f/r，分别以B.amyloliquefaciens G11、G12、G13、G14和B.amyloliquefaciens 13952菌株的基因组为模版，扩增得到野生型及突变型gmk片段，以BamHI/XbaI将获得的5种gmk基因片段与载体pET28a同时酶切，纯化，并使用T4连接酶连接转化大肠杆菌BL21，制备含有HIS标签的gmk过表达载体pET28a-gmk(wt)、pET28a-gmk

使用Bio-Scale Mini Profinity IMAC滤芯和Profinia蛋白质纯化系统(Bio-Rad)纯化蛋白质鸟苷酸激酶用于酶活测定。

反应条件：将50μMGMP，1.5mM磷酸烯醇丙酮酸，150μM NADH，4mM ATP，10mM MgCl

酶活测定结果见表2。从实验结果可以看出，同出发菌株B.amyloliquefaciens13952相比，工程菌株B.amyloliquefaciens G11、G12、G13、G14的鸟苷酸激酶活性显著降低，其活性分别降为对照菌的36.3％、44.9％、53.7％、4.2％。

表2工程菌株酶活测定

实施例5：工程菌株B.amyloliquefaciens G11、G12、G13、G14和B.amyloliquefaciens 13952核苷合成能力对比

1、培养基：

(1)种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。

(2)发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，谷氨酸钠10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。

(3)LB液体培养基配方(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaC10，调节pH至7.2，0.15Mpa压力下灭菌20min。

(4)LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入琼脂粉(终浓度18g/L)，121℃下灭菌20min。

2、培养方法

(1)将菌株三区划线LB平板，37℃过夜培养；

(2)挑单菌落接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；

(3)按10％接种量转接至30mL发酵培养基中，摇床转速130rpm，35.5℃培养70h；

发酵结果见表3(取3个生物学平行试验的平均值)，从结果可以看出，同出发菌株B.amyloliquefaciens 13952相比，工程菌的鸟苷积累量均有不同程度的提高。G11(gmk

表3工程菌株产核苷检测

这可能是由于gmk基因的弱化或失活，导致较少的GMP被分解成GDP，GDP可进一步生成GTP进入核黄素生物合成路径。而核酮糖5磷酸(Ru-5P)是嘌呤生物合成和核黄素生物合成路径的共用前体物质，因此gmk基因弱化，致使核黄素生物合成路径的前体GTP减少，减弱了嘌呤生物合成路径前体物质Ru-5P的竞争，促进了嘌呤从头合成。实验结果表明这些位点的突变有利于芽孢杆菌中核苷的积累。

基于此原理，该发明内容不仅适用于解淀粉芽孢杆菌，也适用于其近缘菌种枯草芽孢杆菌。因此，发明人对实验室保藏的一株来源于枯草芽孢杆菌168的腺苷生产菌进行了鸟苷酸激酶弱化修饰改造，同样达到了提高鸟苷产率的目的。

实施例6：工程菌株B.subtilis E11(gmk

用引物gmk

将质粒pKSU-S-gmk

将一次重组子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM 5-FU的LB平板筛选二次重组子，得到在B.subtilis A5引入gmk

实施例7：工程菌株B.subtilis E12构建(引入gmk

用引物gmk

实施例8：工程菌株B.Subtilis E11、E12和B.subtilisA5鸟苷酸激酶活性对比

用引物gmk-A-f/r，分别以B.subtilisA5、E11、E12菌株的基因组为模版，扩增得到野生型及突变型gmk片段，以BamHI/XbaI将获得的3种gmk基因片段与载体pET28a同时酶切，纯化，并试用T4连接酶连接转化大肠杆菌BL21,制备含有HIS标签的gmk过表达载体pET28a-gmk(wt)、pET28a-gmk

酶活测定结果见表4。从实验结果可以看出，同出发菌株B.subtilisA5相比，工程菌株B.Subtilis E11、E12的鸟苷酸激酶活性显著降低，其活性分别降为对照菌的68.2％、62.8％。

表4工程菌株酶活测定

实施例9：工程菌株B.Subtilis E11、E12和B.subtilisA5核苷合成能力对比

培养基及发酵方法同实施例5。

发酵结果见表5(取3个生物学平行试验的平均值)，从结果可以看出，同出发菌株B.subtilisA5相比，工程菌的腺苷积累量均有不同程度的提高。E11(gmk

表5工程菌株产腺苷检测

实施例10：工程菌株B.amyloliquefaciens G15(ylzA

ylzA编码一种假定蛋白，目前其功能尚未鉴定，也未有文献报道其对核苷生产的作用。本发明将比较基因组学分析得到的3种突变修饰重新引入B.amyloliquefaciens13952(Δupp)中进行验证，结果得到了意想不到的效果。

具体构建流程如下：

用引物ylzA-A-1f/ylzA77-A-1r和ylzA77-A-2f/2r、ylzA-A-1f/ylzA81-A-1r和ylzA81-A-2f/2r、ylzA-A-1f/ylzA85-A-1r和ylzA85-A-2f/2r，以B.amyloliquefaciens13952基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到ylzA的上下游同源臂；

用引物ylzA-A-1f/2r融合上下游片段分别得到A-ylzA

实施例11：工程菌株B.amyloliquefaciens G15、G16、G17和B.amyloliquefaciens13952核苷积累能力对比

培养基及培养方法同实施例5。

发酵结果见表6(三个生物学平行试验的平均值)，从结果可以看出，同出发菌株B.amyloliquefaciens 13952相比，工程菌的肌苷积累量均有不同程度的提高，其中G15(ylzA

这可能是由于ylzA基因突变，导致gmk基因表达弱化，进而减少嘌呤路径中间体GMP的消耗，促进鸟苷积累。而各工程菌株中腺苷及肌苷的积累量也有所提升，这是由于gmk基因表达受到影响后，核黄素生物合成路径减弱，增加了嘌呤从头合成路径的核酮糖5磷酸(Ru-5P)前体，促进了嘌呤及核苷物质的积累。实验结果说明这些位点的突变有利于芽孢杆菌中核苷的积累。

表6工程菌株产苷检测

本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。

本发明中的菌株代号如B.subtilis E11和B.subtilis E12等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。上述方法构建的包含有芽孢杆菌鸟苷酸激酶突变基因gmk

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 梅花（上海）生物科技有限公司

<120> 弱化鸟苷酸激酶在提高菌株生产核苷或其衍生物的能力中的应用

<130> KHP211117889.8

<160> 46

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Gly Arg Gly Asn Cys Arg Met Lys Glu Arg Gly Leu Leu Ile

1 5 10 15

Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Val Gly Lys Gly Thr Val Arg Gln Ala

20 25 30

Ile Phe Ser Gln Glu Asp Thr Lys Phe Glu Tyr Ser Ile Ser Val Thr

35 40 45

Thr Arg Asn Pro Arg Glu Gly Glu Val Asp Gly Val Asp Tyr Phe Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Asp Glu Phe Glu Arg Met Ile Glu Asn Asn Lys Leu Leu

65 70 75 80

Glu Trp Ala Glu Tyr Val Gly Asn Tyr Tyr Gly Thr Pro Val Asp Tyr

85 90 95

Val Glu Gln Thr Leu Gln Glu Gly Lys Asp Val Phe Leu Glu Ile Glu

100 105 110

Leu Gln Gly Ala Leu Gln Val Arg Asn Ala Phe Pro Glu Gly Leu Phe

115 120 125

Ile Phe Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Glu Leu Lys Asn Arg Ile Val

130 135 140

Thr Arg Gly Thr Glu Thr Asp Asp Leu Ile Glu Asn Arg Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Lys Ala Glu Ile Glu Met Met Asp Ala Tyr Asp Tyr Val Val Glu

165 170 175

Asn Asp Asp Ile Gln Thr Ala Cys Asp Lys Ile Asn Ala Ile Val Leu

180 185 190

Ala Glu His Leu Lys Arg Glu Arg Val Ala Pro Arg Tyr Lys Lys Met

195 200 205

Leu Glu Val Glu

210

<210> 2

<211> 89

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Ile Lys Leu Ile Asn Ile Gly Phe Gly Asn Ile Ile Ser Ala

1 5 10 15

Asn Arg Met Ile Ser Ile Val Ser Pro Glu Ser Ala Pro Ile Lys Arg

20 25 30

Met Ile Gln Asp Ala Arg Asp Arg Gly Met Leu Ile Asp Ala Thr Tyr

35 40 45

Gly Arg Arg Thr Arg Ala Val Val Val Met Asp Ser Asp His Ile Ile

50 55 60

Leu Ser Ala Val Gln Pro Glu Thr Val Ala His Arg Leu Ser Val Lys

65 70 75 80

Glu Glu Ile Met Asp Glu Gly Gln Gly

<210> 3

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaagaaa gagggttatt aatcgttctc tcaggtccct caggagttgg aaaaggaacg 60

gttcggcaag caatattttc acaagaagac acgaaatttg aatactcaat ttcagtcacg 120

acgagaaacc cgagagaggg cgaggtcgac ggcgtcgatt atttctttaa atcaagagat 180

gaattcgaac gcatgattga aaacaacaaa ctgcttgagt gggcggaata tgtcggcaac 240

tattacggaa cgcccgtcga ttatgtcgaa cagacgcttc aagaaggaaa agacgtcttc 300

ttagagattg aagtgcaggg cgcgctccaa gtgcggaatg catttccgga aggcctgttt 360

atcttcttag cgccgccgag tctttctgag ctgaaaaaca gaatcgtgac aagaggaact 420

gaaaccgacg atttaattga aaacagaatg aaggccgcaa aagctgaaat cgaaatgatg 480

gacgcgtatg attatgtcgt ggaaaacgat gatatccaaa cggcttgtga taagattaac 540

gcaattgttc tcgccgagca cttaaagcgt gaacgcgttg ctccgagata taagaaaatg 600

ctggaggtag aataa 615

<210> 4

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgacgatta aactgattaa tatcggattt ggcaatatca tctccgccaa tcggatgatt 60

tcgattgtca gcccggagtc tgcgccaata aagcgaatga ttcaggatgc aagagaccgc 120

ggaatgctaa tagacgctac atacggacga agaacccgtg cagttgtcgt catggatagt 180

gatcacatta tcttatctgc cgtccagcct gagacagttg cacacagact ttctgtgaaa 240

gaagaaatta tggatgaagg gcaggggtaa ttgccgcatg aaagaaagag ggttatt 297

<210> 5

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Val Thr Arg Gly Thr Glu Thr Asp Asp Leu Ile Glu Asn Arg Met

1 5 10 15

Lys Ala Ala Lys Ala Glu Ile Glu Met Met Asp Ala Tyr Asp Tyr Val

20 25 30

Val Glu Asn Asp Asp Ile Gln Thr Ala Cys Asp Lys Ile Asn Ala Ile

35 40 45

Val Leu Ala Glu His Leu Lys Arg Glu Arg Val Ala Pro Arg Tyr Lys

50 55 60

Lys Met Leu Glu Val Glu

65 70

<210> 6

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcgtgacaa gaggaactga aaccgacgat ttaattgaaa acagaatgaa ggccgcaaaa 60

gctgaaatcg aaatgatgga cgcgtatgat tatgtcgtgg aaaacgatga tatccaaacg 120

gcttgtgata agattaacgc aattgttctc gccgagcact taaagcgtga acgcgttgct 180

ccgagatata agaaaatgct ggaggtagaa taa 213

<210> 7

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Lys Glu Arg Gly Leu Leu Ile Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Val Gly

1 5 10 15

Lys Gly Thr Val Arg Gln Ala Ile Phe Ser Gln Glu Asp Thr Lys Phe

20 25 30

Glu Tyr Ser Ile Ser Val Thr Thr Arg Ser Pro Arg Glu Gly Glu Val

35 40 45

Asn Gly Val Asp Tyr Phe Phe Lys Thr Arg Asp Glu Phe Glu Gln Met

50 55 60

Ile Ala Asp Asn Lys Leu Leu Glu Trp Ala Glu Tyr Val Gly Asn Tyr

65 70 75 80

Tyr Gly Thr Pro Val Asp Tyr Val Glu Gln Thr Leu Gln Asp Gly Lys

85 90 95

Asp Val Phe Leu Glu Ile Glu Val Gln Gly Ala Leu Gln Val Arg Asn

100 105 110

Ala Phe Pro Glu Gly Leu Phe Ile Phe Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser

115 120 125

Glu Leu Lys Asn Arg Ile Val Thr Arg Gly Thr Glu Thr Asp Ala Leu

130 135 140

Ile Glu Asn Arg Met Lys Ala Ala Lys Ala Glu Ile Glu Met Met Asp

145 150 155 160

Ala Tyr Asp Tyr Val Val Glu Asn Asp Asn Val Glu Thr Ala Cys Asp

165 170 175

Lys Ile Lys Ala Ile Val Leu Ala Glu His Leu Lys Arg Glu Arg Val

180 185 190

Ala Pro Arg Tyr Lys Lys Met Leu Glu Val Glu

195 200

<210> 8

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgaaagaaa gagggttatt aatcgttctc tcaggtccct caggagttgg taaaggaacg 60

gttcgacaag cgatcttttc gcaggaagac acaaaatttg aatattcgat ttcagtaacc 120

acaagaagtc caagagaggg cgaagtgaac ggagtcgatt attttttcaa aacaagagac 180

gaattcgagc aaatgattgc ggacaacaag ctgcttgaat gggcagagta tgtcggcaat 240

tattacggca cgccagtcga ttatgttgaa cagacgcttc aagatggaaa agacgtcttt 300

ttagaaattg aagttcaagg ggctcttcaa gtgagaaatg ctttcccgga aggcctgttt 360

attttccttg cgcctccaag cctttctgaa ctgaaaaaca gaatcgtgac acgaggaaca 420

gaaacagacg ctctgattga aaatcgaatg aaagccgcaa aagctgagat cgaaatgatg 480

gatgcttatg actatgtcgt tgaaaacgat aatgtcgaaa cggcttgcga taaaatcaaa 540

gcaatcgttc ttgctgaaca tttgaagcgt gaacgcgttg caccaagata taagaaaatg 600

ctggaggttg aataa 615

<210> 9

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Lys Glu Arg Gly Leu Ser Ile Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Gly Thr Val Arg Gln Ala Ile Phe Ser Gln Glu Asp Thr Lys

20 25 30

Phe Glu Tyr Ser Ile Ser Val Thr Thr Arg Ser Pro Arg Glu Gly Glu

35 40 45

Val Asn Gly Val Asp Tyr Phe Phe Lys Thr Arg Asp Glu Phe Glu Gln

50 55 60

Met Ile Ala Asp Asn Lys Leu Leu Glu Trp Ala Glu Tyr Val Gly Asn

65 70 75 80

Tyr Tyr Gly Thr Pro Val Asp Tyr Val Glu Gln Thr Leu Gln Asp Gly

85 90 95

Lys Asp Val Phe Leu Glu Ile Glu Val Gln Gly Ala Leu Gln Val Arg

100 105 110

Asn Ala Phe Pro Glu Gly Leu Phe Ile Phe Leu Ala Pro Pro Ser Leu

115 120 125

Ser Glu Leu Lys Asn Arg Ile Val Thr Arg Gly Thr Glu Thr Asp Ala

130 135 140

Leu Ile Glu Asn Arg Met Lys Ala Ala Lys Ala Glu Ile Glu Met Met

145 150 155 160

Asp Ala Tyr Asp Tyr Val Val Glu Asn Asp Asn Val Glu Thr Ala Cys

165 170 175

Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val Leu Ala Glu His Leu Lys Arg Glu Arg

180 185 190

Val Ala Pro Arg Tyr Lys Lys Met Leu Glu Val Glu

195 200

<210> 10

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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