重组微生物及其用途、生产四甲基吡嗪的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地，涉及重组微生物及其用途、生产四甲基吡嗪的方法，更具体地，涉及重组微生物、生产乙偶姻的方法以及生产四甲基吡嗪的方法。

背景技术

四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine)又名川芎嗪，是中药川芎根茎的主要活性生物碱成分，具有扩张血管、改善微循环、抑制血小板黏附聚集和血栓形成等良好的药理作用，在治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肾小球疾病等方面具有一定疗效，已作为常备药品广泛应用于临床。此外，四甲基吡嗪天然存在于乳制品、豆制品、可可、咖啡、花生、榛子、和白酒中，具有烘烤和坚果的特殊香味。四甲基吡嗪也是中国白酒中的重要香气化合物，而且还赋予了中国白酒有益健康的功能。四甲基吡嗪香味阈值极低，国家标准GB2760-1996规定其为允许使用的食用香料，目前广泛应用于烘烤食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配。

四甲基吡嗪的生产方法可分为植物提取法、化学法和生物合成法。利用萃取的方法可从中药川芎根茎中提取四甲基吡嗪，但是川芎植物来源有限，而且川芎根茎中的四甲基吡嗪含量较低，无法实现大规模的商业化生产。化学法合成四甲基吡嗪的反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，普遍存在较严峻的环保问题，且产品不属于“天然”或“生物合成”范畴，安全性和品质问题受到不断的质疑。生物化工方法生产的四甲基吡嗪具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等优点，随着人们对绿色产品需求的日益提高，该法受到越来越多的关注。然而，由于利用微生物发酵生产乙偶姻并将其转化为四甲基吡嗪的相关研究起步较晚，生物技术方法生产四甲基吡嗪的技术远未成熟。

中国专利201010238685.5公开了一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株，该方法利用野生型菌株进行发酵，发酵过程中会积累各种副产物导致葡萄糖的转化率较低，影响了四甲基吡嗪的得率，且生产周期长达72h。出现上述问题是因为微生物发酵生产乙偶姻时，糖酵解过程会产生的大量还原型辅酶NADH，而乙偶姻及四甲基吡嗪的产生并不能消耗NADH，因此微生物细胞会启动乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸等副产物的合成途径来消耗过量的NADH，实现氧化型辅酶NAD+的再生，这些副产物的积累不但降低了原料的转化率和四甲基吡嗪产量，还会抑制微生物的生长和发酵。中国专利201710509031.3公开了一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株，该发明制备了可利用木薯粉和廉价氮源生产乙偶姻的工程菌，该工程菌菌株中合成副产物的关键基因gldA、frdABCD、ldhA和pta被沉默，在一定程度上提高了乙偶姻的得率，含有乙偶姻的发酵液在加热条件下与磷酸氢二铵反应可生产四甲基吡嗪，但该方法的问题在于微生物依然会产生甘油、甲酸、乙醇等副产物，且仅在加热条件下利用含乙偶姻的发酵液生产四甲基吡嗪的工艺生产效率较低。

因此，利用基因工程改造微生物合成乙偶姻的手段仍有待改进，利用乙偶姻生产甲基吡嗪的工艺也需要继续优化。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

四甲基吡嗪生产存在的副产物积累过多、四甲基吡嗪得率低、生产周期长，难以工业化生产等问题。利用代谢工程和辅酶调控对关键代谢节点进行合理的遗传改造，削弱主要副产物合成途径可以强化乙偶姻的合成途径，并有效调节胞内氧化还原状态，可以实现提高前体物质乙偶因产量，高产四甲基吡嗪的目的。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组微生物，根据本发明的实施例，所述重组微生物pflB、ahdE、PPS基因被沉默。根据本发明的实施例，所述pflB、ahdE、PPS基因被沉默后，所述重组微生物生成甲酸、乙醇、甘油途径被抑制，重组微生物乙偶姻合成显著增加。

根据本发明的实施例，上述重组微生物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，上述重组微生物进一步包括α-乙酰乳酸合成酶基因(budA)、α-乙酰乳酸脱羧酶基因(budB)以及NADH氧化酶基因(nox)基因的过表达以及gldA、frdABCD、ldhA、pta的沉默。所述budA、budB以及nox基因过表达后，所述重组微生物生成α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、NADH氧化酶水平被增强；所述gldA、frdABCD、ldhA、pta基因被沉默后，所述重组微生物菌株生成2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸的途径被抑制。

根据本发明实施例，budA、budB以及nox基因的过表达是通过以下方式实现的：将所述budA、budB和nox基因的核苷酸序列进行密码子优化，密码子优化的具体操作是在所述budA、budB和nox基因的前面添加含核糖体结合位点和间隔序列的核苷酸序列TAAGGAGGATATACA；将所述经密码子优化的budA、budB和nox基因进行拼接获得包含该三个基因的基因簇；将所述基因簇插入表达载体pTrc99A中获得多顺反子重组质粒，将所述多顺反子重组质粒导入宿主菌E.coli；获得过表达budA、budB以及nox基因的基因工程菌株。在细胞内，核糖体负责将mRNA翻译成蛋白质，16S rRNA是核糖体的一个亚基，可与核糖体结合位点利用碱基互补原则进行精确识别，在基因前面添加TAAGGAGGATATAC序列，可增强核糖体与mRNA的识别与结合能力，而适当的间隔序列也可以提高翻译效率，在相同的转录水平下，提高了α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和NADH氧化酶的活力，酶促反应加快，最终提高乙偶姻的合成能力。

根据本发明的实施例，上述重组微生物为大肠杆菌。根据本发明实施例，所述宿主菌E.coli为多基因缺失的突变菌株，通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得；所述副产物包括2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸、甲酸、乙醇和甘油，所述合成副产物的关键基因包括gldA、frdABCD、ldhA、pta、pflB、ahdE、PPS。根据本发明实施例，所述的budA、budB基因的来源菌株为Enterobacter cloacae；所述的nox基因的来源菌株为Lactobacillus brevis。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种生产乙偶姻的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括对第一方面所述的重组微生物进行发酵处理，以便获得乙偶姻。根据本发明实施例，所述重组微生物能有效利用来源广泛、成本低廉的原料进行发酵生产前体物质乙偶姻，并使得氧化型辅酶NAD+能够有效再生，可显著提高乙偶姻产量和生产效率。

根据本发明的实施例，所述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述方法将所述重组微生物在温度35℃～42℃、搅拌转速200rpm～800rpm、通气量0.5vvm～1.5vvm条件下进行发酵处理20-72h。

根据本发明的实施例，所述方法在发酵培养基中葡萄糖浓度降至40-50g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为120-140g/L。

根据本发明的实施例，所述方法需将重组微生物预先接种在添加有50-100μg/mL氨苄青霉素的培养基中。

根据本发明实施例所述方法中所述重组微生物的接种浓度为1％～10％。根据本发明实施例的接入所述重组微生物的比例进行发酵处理，可进一步提高乙偶姻得率。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种生产四甲基吡嗪的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：对第一方面所述的重组微生物进行发酵处理，以便获得含有乙偶姻的发酵液；所述发酵处理的条件如第二方面所限定的；将所述发酵液的上清液与铵根离子进行接触，以便获得所述四甲基吡嗪。根据本发明实施例，所述发酵处理条件下，可保持乙偶姻较高得率，乙偶姻可进一步与NH4+接触反应生成四甲基吡嗪，且根据本发明实施例结果显示底物转化率高。

根据本发明的实施例，所述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述铵根离子是由磷酸氢二铵提供的。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括，对所述发酵液进行离心处理，以便获得所述发酵液的上清液，进而获得包含乙偶姻的发酵液的上清液。

根据本发明的实施例，所述接触体系中，所述乙偶姻与磷酸氢二胺的摩尔比为1：1～1：3。根据本发明实施例，在所述乙偶姻与磷酸氢二胺的摩尔比例条件下，底物的转化率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述接触是在温度为110℃～210℃，转速为210rpm～1200rpm，PH为6.0～8.0，压力为0.2Mpa～3Mpa条件下进行1.5～5h。根据本发明具体实施例，在高压反应釜中进行所述接触可提高底物的转化率，获得较高四甲基吡嗪得率。

根据本发明的实施例，所述接触是在温度为100℃～180℃，转速为200rpm～750rpm，PH为6.0～8.5，压力为0.2Mpa～2Mpa条件下进行1～3h。根据本发明具体实施例，在微波合成器中进行所述接触可提高底物的转化率，获得较高四甲基吡嗪得率。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种生产四甲基吡嗪的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：对第一方面所述的重组微生物进行发酵处理，以便获得含有乙偶姻的发酵液，对所述发酵液进行离心处理，以便获得所述发酵液的上清液；将所述发酵液的上清液与磷酸氢二铵进行接触，以便获得所述四甲基吡嗪；其中，接触体系中，所述乙偶姻与磷酸氢二胺的摩尔比为1:1～1:3；所述接触是在温度为110℃～210℃，转速为210rpm～1200rpm，pH为6.0～8.0，压力为0.2Mpa～3Mpa条件下进行1.5～5h；或所述接触是在温度为100℃～180℃，转速为200rpm～750rpm，pH为6.0～8.5，压力为0.2Mpa～2Mpa条件下进行1～3h。具体地，所述发酵处理的条件如第二方面或第三方面所限定的。根据本发明实施例的方法所获得的四甲基吡嗪得率高。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例4的工程菌株ECTMP3发酵生产(R)-乙偶姻的结果图，其中，residual sugar为发酵培养基中剩余葡萄糖的浓度，AC为乙偶姻，OD

图2是根据本发明实施例5的工程菌株ECTMP3发酵生产(R)-乙偶姻的结果图，其中，residual sugar为发酵培养基中剩余葡萄糖的浓度，AC为乙偶姻，OD

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在一些实施方案中，所述E.coli MG1655ΔgldAΔfrdABCDΔldhAΔptaΔpflBΔahdEΔPPS/pTrc99A-budB-budA-nox是指通过叠加敲除gldA、frdABCD、ldhA、pta、pflB、ahdE、PPS基因获得的多基因缺失的突变菌株E.coli MG1655，且菌株中被导入budB-budA-nox基因过表达的pTrc99A质粒。

以下实施例中所涉及的材料：液化酶、糖化酶、蛋白酶为商业化产品，可购于诺维信(中国)生物技术有限公司等公司；棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉为商业化产品，可购于青岛科瑞培养基有限公司等公司。

下述实施例在生产四甲基吡嗪过程中，采用SBA-40C分析仪检测发酵液中葡萄糖浓度，利用液相色谱测定主要副产物的浓度，利用气相色谱测定乙偶姻、四甲基吡嗪的浓度。

下面将对实施例作具体介绍。

实施例1基因工程菌株ECTMP1的构建

将来源于Enterobacter cloacae菌株的budB、budA基因和来源于Lactobacillusbrevis菌株的nox基因的核苷酸序列进行密码子优化，将budB、budA和nox基因的始核苷酸分别与含核糖体结合位点的核苷酸序列5’-TAAGGAGGATATACA-3’的末端核苷酸进行连接，并利用人工合成的方法获得基因簇budB-budA-nox，其核苷酸序列长度为3841个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。利用双酶切与连接的方法，将基因簇budB-budA-nox插入质粒pTrc99A的启动子后面，获得多顺反子重组质粒pTrc99A-budB-budA-nox，再将重组质粒pTrc99A-budB-budA-nox导入宿主菌E.coli MG1655，获得基因工程菌株ECTMP1。

SEQ ID NO：1的具体序列为：

TAAGGAGGATATACATATGAACTCGGAGAAACAGTCGCGCCAATGGGCGCATGGCGCCGACATGGTTGTGGGCCAACTGGAAGCCCAGGGCGTGAAGCAGGTGTTTGGCATCCCGGGCGCGAAAATTGACAAGGTGTTTGACTCGCTGCTGGATAGCAGCATTGAGATCATTCCTGTGCGCCATGAGGCGAACGCCGCCTTTATGGCCGCCGCGGTTGGTCGTCTGACCGGTAAGGCCGGCGTGGCCTTAGTGACCAGCGGTCCTGGTTGTTCTAATCTGATTACCGGCATTGCGACCGCGAACTCGGAGGGCGATCCTGTGGTGGCCTTAGGCGGTGCGGTTAAGCGCGCGGATAAAGCCAAACTGGTGCACCAGAGCATGGATACCGTGGCGATGTTTAGCCCGGTGACGAAGTACGCCGTTGAAGTTAGCTCGCCGGACGCGATTGCGGAGGTGGTTAGCAACGCGTTTCGTGCCGCGGAACATGGCCGTCCTGGTGGCGCGTTCGTTTCGCTGCCGCAGGACATTGTTGATCAGCCTGCGACCGGTGCGATCTTACCGGCCAGCGGTCCTGCCCTGATGGGTCCGGCCCCTGAAAGCGCGATCAATGATGTTGCGAAATTAATTGACAATGCGAAAAACCCGGTGATTCTGCTGGGCTTAATGGCCTCGCAGCCTGCCAATAGCGCGGCGTTACGCAAACTGCTGGAGAAGAGCCGTATTCCGGTGACTTCTACTTACCAAGCCGCCGGCGCGGTGAATCAGGAACACTTTACCCGCTTTGCCGGTCGCGTGGGTCTGTTCAACAATCAAGCGGGTGACCGCCTGTTACACCTGGCGGATCTGATCATTTGCATTGGCTACAGCCCGGTTGAATACGAACCGAGCATGTGGAACAGCGGCGATGCC ACGCTGGTGC ATATCGATGT TCTGCCTGCG TACGAGGAACGCAATTATGTGCCGGATATCGAGCTGGTGGGTGACATTGCCGCGACCCTGAATTTACTGGCCTCGCGTATTGACCACAAGCTGGAACTGAGCCAACGCGCGTCGGAGATTCTGGTGGACCGCCAACATCAGCGCGATTTATTAGACCGCCGTGGTGCGTCGCTGAACCAGTTTGCGCTGCATCCTCTGCGCATTGTTCGCGCGATGCAGGATATCGTGAACAACGATGTGACCCTGACCGTGGACATGGGCAGCTTCCATATCTGGATCGCGCGTTATCTGTACAGCTTCCGCGCCCGTCAGGTGATGATCAGCAACGGCCAGCAGACTATGGGTGTTGCCTTACCGTGGGCGATCGGCGCGTGGCTGGTTAACCCGGGTCGTAAGGTTGTGAGCGTGTCGGGCGATGGCGGTTTCTTACAGAGCAGCATGGAGCTGGAAACGGCCGTGCGCCTGAACGCCAACGTGTTACATATTATTTGGGTGGATAACGGCTATAACATGGTGGCCATCCAAGAGGAGAAGAAGTATCAGCGCCTGAGCGGTGTTGCGTTTGGCCCGGTGGATTTCAAGGCCTATGCGGATGCCTTTGGCGCCCGTGGCTTCGCCGTGGAAAGCGCCGATGCGTTAGAAAGCACCCTGCGCGCGGCTATGGATGTTAATGGTCCGGCGGTTGTTGCGATTCCGGTGGATTACAGCGATAACCCGCTGCTGATGGGCCAGCTGCATCTGTCGCAGATTCTGTAATAAGGAGGATATACATATGATGCACAGCTCGGCGTGCGATTGTGAAGCGTCGCTGTGCGAAACCCTGCGCGGCTTTAGCGCCAAACATCCGGACAGCGTTATCTACCAGACCTCGCTGATGAGCGCGCTGCTGTCGGGCGTTTACGAAGGCGACACCACGATCGCCGATCTGCTGGCTCATGGTGATTTCGGTCTGGGCACCTTCAACGAACTGGACGGCGAAATGATTGCCTTTTCTTCTCAGGTGTACCAGTTACGCGCCGACGGCAGCGCGCGCGCGGCCAAACCGGAACAGAAAACGCCGTTCGCCGTGATGACGTGGTTCCAACCGCAGTATCGCAAAACGTTTGATGCCCCGGTTTCGCGTCAGCAGATTCATGACGTGATCGATCAGCAGATTCCGAGCGACAACCTGTTCTGCGCGCTGCGCATTGACGGCAATTTTCGCCACGCCCACACCCGCACGGTTCCTCGCCAAACGCCGCCGTACCGTGCCATGACCGATGTGCTGGACGACCAGCCGGTGTTTCGTTTTAACCAACGCGAAGGCGTGCTGGTTGGCTTCCGCACGCCGCAGCACATGCAGGGCATTAATGTTGCCGGCTACCATGAGCACTTTATTACCGACGATCGCCAGGGCGGCGGTCATTTACTGGATTATCAGCTGGAGAGCGGTGTGCTGACCTTCGGCGAGATTCACAAACTGATGATCGACCTGCCGGCCGACAGCGCCTTCTTACAAGCGAATCTGCACCCGAGCAACCTGGACGCCGCGATTCGTTCGGTGGAAAATTAATAAGGAGGATATACATATGAAAGTGACCGTGGTTGGCTGCACTCATGCTGGCACCTTTGCGATTAAACAGATCCTGGCGGAGCATCCGGATGCCGAAGTGACCGTGTACGAGCGCAACGACGTTATTAGCTTCCTGTCGTGCGGCATTGCGCTGTATCTGGGCGGTAAGGTGGCTGATCCTCAGGGCTTATTCTATTCTTCTCCTGAAGAGTTACAAAAGCTGGGCGCGAACGTTCAAATGAATCACAACGTTCTGGCGATTGACCCGGACCAGAAAACCGTTACCGTGGAGGATCTGACGAGCCATGCGCAGACCACCGAGTCGTATGATAAGCTGGTGATGACGAGCGGCAGCTGGCCGATCGTGCCTAAAATTCCGGGCATTGACAGCGACCGCGTGAAACTGTGTAAGAACTGGGCTCATGCTCAGGCGCTGATTGAAGATGCGAAAGAGGCGAAGCGCATCACCGTGATCGGCGCGGGCTATATTGGCGCCGAATTAGCGGAAGCCTATAGCACGACCGGCCATGACGTGACCCTGATCGACGCGATGGATCGCGTGATGCCGAAGTACTTTGATGCGGACTTCACCGACGTGATTGAACAGGACTATCGCGATCATGGCGTGCAGCTGGCCCTGAGCGAAACCGTGGAGTCTTTTACCGATTCGGCGACCGGCCTGACCATTAAAACCGACAAAAACTCGTACGAAACCGATCTGGCCATCCTGTGCATTGGCTTTCGCCCGAATACCGACCTGCTGAAAGGCAAAGTGGACATGGCGCCGAACGGTGCGATTATTACCGACGATTATATGCGTTCTTCTAACCCGGATATTTTTGCGGCGGGCGATAGCGCGGCGGTTCACTACAATCCGACCCACCAAAACGCGTACATTCCGCTGGCGACGAATGCCGTTCGCCAGGGCATTCTGGTGGGTAAAAACCTGGTTAAGCCGACCGTGAAATACATGGGCACCCAGAGCAGCAGCGGTCTGGCCCTGTACGACCGCACCATTGTTTCTACTGGTCTGACCTTAGCGGCGGCCAAGCAACAGGGCGTTAACGCCGAACAGGTGATCGTGGAGGACAATTATCGCCCGGAGTTTATGCCTTCTACTGAACCGGTGCTGATGAGCCTGGTGTTCGATCCGGATACCCATCGTATCCTGGGTGGCGCCCTGATGAGCAAATACGACGTTAGCCAGAGCGCGAACACCCTGAGCGTGTGCATCCAGAACGAAAACACCATCGACGATCTGGCGATGGTGGACATGCTGTTCCAGCCTAATTTTGACCGCCCGTTCAACTACCTGAATATCCTGGCGCAGGCGGCGCAAGCGAAAGTGGCGCAGTCGGTGAACGCGTAA。

实施例2基因工程菌株ECTMP2的构建

通过分析发现工程菌株ECTMP1发酵的主要副产物为2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸，其合成途径的关键基因是gldA、frdABCD、ldhA和pta。利用大肠杆菌噬菌体来源的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件的原理，先用两侧带有FRT位点的抗生素抗性基因取代上述目标基因，再通过诱导外源性温敏质粒表达FLP重组酶删除抗生素抗性基因达到敲除目标基因的目的，具体步骤如下：

将pKD46质粒转化入宿主细胞E.coli MG1655，制备电转化感受态细胞；利用表1所示引物进行PCR构建打靶序列(含氯霉素抗性基因)，并将其直接转化入含pKD46的宿主细胞；氯霉素平板筛选发生同源重组的克隆；利用测序技术验证、挑选目标基因被氯霉素抗性基因取代的克隆，制备电转化感受态细胞；电转导入pCP20质粒删除氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因删除的克隆连续划线传代三次，制备甘油管-20℃保存。通过叠加敲除，可获得多基因缺失的突变株E.coli MG1655/ΔgldAΔfrdABCDΔldhAΔpta，制备电转化感受态细胞。将实施例1构建的多顺反子重组质粒pTrc99A-budB-budA-nox电转导入多基因缺失突变株E.coli MG1655/ΔgldAΔfrdABCDΔldhAΔpta，获得工程菌株ECTMP2。

表1：

实施例3生产前体物质(R)-乙偶姻基因工程菌株ECTMP3的构建

通过分析发现工程菌株ECTMP2发酵的主要副产物为甘油、甲酸、乙醇，其合成途径的关键基因是pflB、ahdE、PPS。利用大肠杆菌噬菌体来源的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件的原理，先用两侧带有FRT位点的抗生素抗性基因取代上述目标基因，再通过诱导外源性温敏质粒表达FLP重组酶删除抗生素抗性基因达到敲除目标基因的目的，具体步骤如下：

将pKD46质粒转化入宿主细胞E.coli MG1655/ΔgldAΔfrdABCDΔldhAΔpta，制备电转化感受态细胞；利用表2所示引物进行PCR构建打靶序列(含氯霉素抗性基因)，并将其直接转化入含pKD46的宿主细胞；氯霉素平板筛选发生同源重组的克隆；利用测序技术验证、挑选目标基因被氯霉素抗性基因取代的克隆，制备电转化感受态细胞；电转导入pCP20质粒删除氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因删除的克隆连续划线传代三次，制备甘油管-20℃保存。通过叠加敲除，可获得多基因缺失的突变株E.coli MG1655ΔgldAΔfrdABCDΔldhAΔptaΔpflBΔahdEΔPPS，制备电转化感受态细胞。将实施例1构建的多顺反子重组质粒pTrc99A-budB-budA-nox电转导入多基因缺失突变株E.coli MG1655ΔgldAΔfrdABCDΔldhAΔptaΔpflBΔahdEΔPPS，获得工程菌株ECTMP3。

表2：

实施例4工程菌株ECTMP3生产(R)-乙偶姻工艺优化

1、配制发酵培养基

将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目的木薯粉；称取木薯粉200g三份，分别加入烧杯中，再分别加入70g棉籽蛋白粉，再加入1000mL自来水、1.2mL液化酶和0.5g氯化钙，充分摇匀后，90℃液化2h，静置冷却；温度降低至50℃以下时，加入0.3mL糖化酶和0.2g蛋白酶，在55℃糖化24h，调节pH 6.5，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基。

2、ECTMP3工程菌的活化

配制LB培养基，其配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。将ECTMP3工程菌株划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养15h。在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养12h，经上述操作可获得活化后的ECTMP3工程菌菌液。

3、利用ECTMP3工程菌发酵生产(R)-乙偶姻

(1)处理条件一

添加100μg/mL氨苄青霉素于发酵培养基中，取500mL含氨苄青霉素的发酵培养基添加至上海保兴5L发酵罐，在无菌条件下，取经活化的ECTMP3工程菌菌液以体积比为10％的接种量接入到上述发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速400rpm、通气量1.0vvm条件下进行发酵，当发酵培养基中葡萄糖浓度降至40g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为120g/L，发酵液中乙偶姻的浓度不再增加时发酵结束，R-乙偶姻产量为82.4g/L，具体结果如图1所示，发酵周期为45h，生产强度为1.83g/(L·h)，得率为0.45g/g。

(2)处理条件二

添加100μg/mL氨苄青霉素于发酵培养基中，取500mL含氨苄青霉素的发酵培养基添加至上海德国Sartorius 5L发酵罐，在无菌条件下，取经活化的ECTMP3工程菌菌液以体积比为10％的接种量接入到上述发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速500rpm、通气量1.5vvm条件下进行发酵，当发酵培养基中葡萄糖浓度降至50g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为140g/L，发酵液中乙偶姻的浓度不再增加时发酵结束，R-乙偶姻产量为83.58g/L(图2)，发酵周期为45h，生产强度1.86g/(L·h)，得率0.44g/g。

表3：

处理条件一、二下发酵合成(R)-乙偶姻的结果如表3所示，综上所述，两种发酵处理条件下乙偶姻的得率均较高。

实施例5利用高压反应釜合成四甲基吡嗪工艺优化

1、处理条件一

将实施例4利用处理条件一获得的含有(R)-乙偶姻的发酵液在8000rpm条件下离心10min，去除沉淀，分别取100mL含有(R)-乙偶姻的上清液加入3个烧杯中，然后加入浓度为(R)-乙偶姻2倍摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，调节体系pH至7.5，取20mL调节好PH的上述(R)-乙偶姻和磷酸氢二铵的混合物加入高压反应釜中，于温度为180℃，转速400rpm，压力0.5Mpa条件下反应3h，82.4g/L的(R)-乙偶姻发酵液可转化得到四甲基吡嗪61.03g/L，(R)-乙偶姻摩尔转化率为96.31％。

2、处理条件二

将实施例4利用处理条件一获得的含有(R)-乙偶姻的发酵液在8000rpm条件下离心10min，去除沉淀，分别取100mL含有(R)-乙偶姻的上清液加入3个烧杯中，然后加入浓度为(R)-乙偶姻2.5倍摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，调节体系pH至7.0，取20mL调节好PH的上述(R)-乙偶姻和磷酸氢二铵的混合物加入高压反应釜中，于温度为150℃，转速300rpm，压力1.0Mpa条件下反应2h，82.4g/L的(R)-乙偶姻发酵液可转化得到四甲基吡嗪50.36g/L，(R)-乙偶姻摩尔转化率为79.47％。

3、处理条件三

将实施例4利用处理条件一获得的含有(R)-乙偶姻的发酵液在8000rpm条件下离心10min，去除沉淀，分别取100mL含有(R)-乙偶姻的上清液加入3个烧杯中，然后加入浓度为(R)-乙偶姻1倍摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，调节体系pH至7.5，取20mL调节好PH的上述(R)-乙偶姻和磷酸氢二铵的混合物加入高压反应釜中，于温度为100℃，转速200rpm，压力0.5Mpa条件下反应1h，82.4g/L的(R)-乙偶姻发酵液可转化得到四甲基吡嗪39.46g/L，(R)-乙偶姻摩尔转化率为62.26％。

表4：

处理条件一、二、三合成四甲基吡嗪的结果如表4所示，综合上述结果，利用高压反应釜在条件一、二的处理条件下，(R)-乙偶姻的摩尔转化率和四甲基吡嗪的产量得到显著提高。

实施例六利用微波合成器合成四甲基吡嗪工艺优化

1、处理条件一

将实施例4利用处理条件二获得的含有(R)-乙偶姻的发酵液在8000rpm条件下离心10min，去除沉淀，分别取100mL含有(R)-乙偶姻的上清液加入3个烧杯中，然后加入浓度为(R)-乙偶姻3倍摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，取20mL调节好PH的上述(R)-乙偶姻和磷酸氢二铵的混合物加入微波合成器中，于温度为180℃，转速400rpm，pH 8.5，压力1.0Mpa条件下反应1.5h，83.58g/L的(R)-乙偶姻发酵液可转化得到四甲基吡嗪63.20g/L，乙偶姻摩尔转化率为97.84％。

2、处理条件二

将实施例4利用处理条件二获得的含有(R)-乙偶姻的发酵液在8000rpm条件下离心10min，去除沉淀，分别取100mL含有(R)-乙偶姻的上清液加入3个烧杯中，然后加入浓度为(R)-乙偶姻1.5倍摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，取20mL调节好PH的上述(R)-乙偶姻和磷酸氢二铵的混合物加入微波合成器中，于温度为150℃，转速800rpm，pH 7.5，压力3.0Mpa条件下反应2h，83.58g/L的(R)-乙偶姻发酵液可转化得到四甲基吡嗪50.39g/L，(R)-乙偶姻摩尔转化率为78.01％。

3、处理条件三

将实施例4利用处理条件二获得的含有(R)-乙偶姻的发酵液在8000rpm条件下离心10min，去除沉淀，分别取100mL含有(R)-乙偶姻的上清液加入3个烧杯中，然后加入浓度为(R)-乙偶姻2倍摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，取20mL调节好PH的上述(R)-乙偶姻和磷酸氢二铵的混合物加入微波合成器中，于温度为160℃，转速600rpm，pH 7.0，压力1.5Mpa条件下反应3h，83.58g/L的(R)-乙偶姻发酵液可转化得到四甲基吡嗪58.47g/L，(R)-乙偶姻摩尔转化率为90.52％。

表3：

处理条件一、二、三合成四甲基吡嗪的结果如表3所示，综合上述结果，利用微波合成器在条件一、三的处理条件下，(R)-乙偶姻的摩尔转化率和四甲基吡嗪的产量得到显著提高。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。