一种植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其应用。

背景技术

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为乳杆菌属(Lactobacillus)革兰氏阳性细菌。兼性厌氧，生长温度区间位于15℃-45℃。植物乳杆菌底物适应性广，在植物源发酵食物、肠道中丰度高，通过产D、L两种构型乳酸实现对其他物种的拮抗，是较好的益生菌候选菌株。

据报道，植物乳杆菌具有显著的抗氧化活性，也有助于保持肠道通透性。能够抑制肠道内产气的细菌的生长。植物乳杆菌已经在实验中被发现可以增加海马体的脑源性神经营养因子，具有治疗退行性神经疾病的潜力。植物乳杆菌在人类的胃肠道中具有大分子固持能力，可以作为药物运送辅助载体。

糖尿病是一类严重的慢性疾病，血糖浓度过高为典型症状。其中ii型糖尿病患者占糖尿病患者的90％以上，心血管、肾脏、神经、视网膜病变以及糖尿病足等并发症危害巨大，糖尿病患者肠道微生态系统失衡已成为临床医学界的公知。口服益生菌制剂作为糖尿病辅助治疗也广泛应用于临床治疗。目前，广泛应用于食品和药品的双歧杆属(Bifidobacterium)，乳杆菌属(Lactobacillus) 部分菌株均被证实有不同程度的降糖效果，但是菌株之间的益生活性差异较大，常见商用菌株普遍存在摄入后定殖率不高，肠道表皮细胞吸附能力不明。乳酸菌资源的开发和利用需要大量菌株水平的活性验证和临床试验。发酵食品在我国传统食谱中占比较大，其中大量具有较高益生活性的的益生菌株资源亟待开发利用。

发明内容

为了解决目前存在的问题，本发明提供一种能够有效缓解糖尿病的植物乳杆菌及其应用。

本发明的第一个目的在于提供一株能有效缓解糖尿病的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，菌株号为ZKWD-0907，所述植物乳杆菌菌株已在2021年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC21895，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的第二个目的是提供一种所述的植物乳杆菌ZKWD-0907的发酵液。

本发明的第三个目的是提供一种所述的植物乳杆菌ZKWD-0907或其发酵液制备用于缓解糖尿病的制品中的应用

本发明的又一个目的是提供一种食品或食品添加剂，其含有所述的植物乳杆菌ZKWD-0907菌粉。

优选地，所述植物乳杆菌粉的活菌数＞50亿/g。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的一种植物乳杆菌ZKWD-0907，由沈阳中科微道生物科技有限公司自延边自治州发酵酸菜中分离筛选获得。中国科学院沈阳应用生态研究所鉴定为植物乳杆菌，将其命名为ZKWD-0907。保藏编号为：(CGMCC21895)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏日期为2021年3月11日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编： 100101，菌种的分类命名为ZKWD-0907，微生物(株)：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)其分类单元为：芽孢杆菌纲Bacilli，乳杆菌目Lactobacillales，乳杆菌科Lactobacillaceae，乳杆菌属Lactobacillus。核糖体16s rDNA序列已获得NCBI Genebank登记序列号Accession No.：MW513938。

2、相比植物乳杆菌模式菌株ATCC 14917，植物乳杆菌ZKWD-0907对胃酸屏障有更好的耐受作用，具有更高的肠道定殖能力。服用后能够显著增加肠道有益细菌的含量，驱动肠道微生态系统向好转化。

3、本发明中的所述的含有植物乳杆菌ZKWD-0907发酵液具有改善人血糖代谢功能，提高胰岛素耐受性等生物学功能。该菌株发酵液饲喂高糖尿病果蝇 (胰岛素受体缺陷型)，InR

附图说明

图1为植物乳杆菌ZKWD-0907与模式菌株(ATCC 14917)的16s rDNA 扩增片段(左)和RAPD指纹图谱(右)。

图2为果蝇在饲喂植物乳杆菌ZKWD-0907和ATCC 14917后雌雄果蝇的生存曲线及log-rank检验图。

图3为果蝇CK对照组及在饲喂植物乳杆菌ZKWD-0907和ATCC 14917 后雄果蝇寿命及血糖代谢相关基因的表达图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例及附图对本发明作具体阐述。

本发明提供的一种植物乳杆菌ZKWD-0907来自于延边自治州发酵酸菜中分离筛选获得的，通过鉴定植物乳杆菌属于植物乳杆菌属，将其命名为 ZKWD-0907，保藏编号为：(CGMCC 21895)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏日期为2019年7月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，菌种的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)其分类单元为：芽孢杆菌纲Bacilli，乳杆菌目Lactobacillales，乳杆菌科Lactobacillaceae，乳杆菌属Lactobacillus。核糖体16s rDNA序列已获得NCBI Genebank登记序列号：MW513938。

本发明中所用对照菌株为Lactobacillus plantarum模式菌株，保藏编号为ATCC14917，购买自美国典型培养物保存中心(American type culture collection)。

细菌基因组提取试剂盒(PureLink

细菌定殖细胞活性测定试剂盒(Live-or-Dye

实时荧光定量PCR试剂盒购自赛默飞科技(北京)有限公司，PowerUp

胃液模拟培养基采购自：PERFEMIKER，货号：PM10004；

植物乳杆菌ZKWD-0907培养基配方：

固态培养基(改良MRS固态培养基)：琼脂15g、MnSO4.H2O 0.05g、牛肉膏10g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、葡萄糖4.5g、NaAc 5g、(NH4)2HC6H5O7 2g、Tween80 1g、K2HPO4 2g、MgSO4.7H2O 0.2g、CaCO3 20g、蒸馏水1.0L。盐酸调pH 6.2±0.2。

液态培养基(改良MRS液态培养基)：组分组分与上述培养基相同，无琼脂。

实施例1

本发明提供一种植物乳杆菌。

1.菌种筛选流程

1)样品来源：

来自于延边自治州发酵酸菜。

2)菌种制备：

样品酸菜匀浆，取1g匀浆后的酸菜，加入0.7％灭菌生理盐水。5ml，充分震荡混匀，形成混合液。在厌氧条件下取10ul混合液体划线接种至上述改良 MRS液态培养基，35℃，厌氧培养48h(O

2.菌株鉴定

取菌苔至无菌离心管中，灭酶PBS缓冲液重悬2次。离心收取细菌细胞，采用试剂盒(PureLink

①按50μLPCR扩增体系加入38μL去离子水、5μL Buffer、1μL上游引物、 1μL下游引物、1μLdNTP(10mM)、0.5uL Taq酶、0.5uL菌株DNA-A，混合均匀、形成PCR扩增液；

②PCR反应参数设定：A、94℃预变性5min；B、30个循环：94℃变性30s、 55℃退火30s、72℃延伸30s；C、72℃充分延伸10min，反应结束，得到PCR 产物Ⅰ；

③将PCR产物Ⅰ由中科院沈阳应用生态研究所进行测序。目标产物与Gene Bank中相关序列进行blast比对，确定本申请中，相关物种的16S rDNA序列与 NCBI收录的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum序列的相似度达到99.9％，认定为植物乳杆菌同源菌株，该菌株16s rDNA序列已获得NCBI Genebank登记序列号：MW513938。

3)菌种的鉴定(基因图谱)

以菌株DNA为模板，采用细菌通用多态性扩增引物5'-GACGGATCAG-3'，对ZKWD-0907和ATCC 14917进行RAPD。采用QIAGEN QIAxcel毛细管电泳仪对扩增产物进行检测；结果见图1；

结果显示(图1)：植物乳杆菌ZKWD-0907与模式菌株(ATCC 14917) 的基因组结构有所不同，属于同一细菌物种下不同菌株；

实施例2

植物乳杆菌ZKWD-0907的胃酸屏障透过性

制备培养液，步骤为：取1mg植物乳杆菌ZKWD-0907和ATCC 14917的液体培养物接种到10ml胃液模拟培养基中，培养2个小时后各取3ml；分别用细菌活死菌染色试剂盒(Live-or-Dye

过性计算依据：存活率＝活菌细胞数/初始活菌细胞数×100％

结果和结论：通过胃酸屏障耐受试验结果显示，植物乳杆菌ZKWD-0907 在pH3.0的胃液模拟培养基中,2小时存活率达80.63％，ATCC 14917为76.62％ (显著性检验，p<0.05)，由此可知，植物乳杆菌ZKWD-0907在胃酸屏障及肠道肠道内的生存率显著高于ATCC14917。

实施例3

植物乳杆菌ZKWD-0907对血糖代谢和胰岛素耐受性的改善作用

以糖尿病模型的果蝇(胰岛素受体缺陷型InR

通过“全生命周期寿命延长”、“胰岛素敏感”、“氧化应激”等试验，检测植物乳杆菌ZKWD-0907对前列腺癌果蝇寿命的促进作用，同时以ATCC 14917 作为对照菌株；

试验样品：胰岛素受体缺陷型突变体的果蝇，来源于美国印第安纳Bloominton果蝇资源中心，编号：64349。

含植物乳杆菌ZKWD-0907培养物的培养液：取20ml改良MRS液体培养基和植物乳杆菌ZKWD-0907菌苔，混合均匀，35℃，厌氧培养48h(O

含有ATCC 14917的培养物的培养液：取2ml改良MRS液体培养基和20ug ATCC14917菌粉，混合均匀，制得含有ATCC 14917的基础培养基，其中ATCC 14917菌粉的活菌数为50亿/g；

试验方法：分别将雄性和雌性处女InR

表1荧光定量PCR检测涉及的基因和引物对

表2 ZKWD-0907对果蝇寿命及血糖代谢相关基因的表达的影响

结果和结论：相比对照菌株ATCC 14917，饲喂ZKWD-0907后，二型糖尿病果蝇的60日存活率显著上升(平均存活率上升3.39％，存活率中位数上升 8.15％Log-rank test p<0.01)。

同时，本发明中涉及的植物乳杆菌ZKWD-0907能够迅诱导胰岛素受体InR 的表达上调(2.74倍，显著高于对照1.25倍，p<0.01)。

同时，ZKWD-0907能够显著提高受试果蝇的超氧化物歧化酶的表达(1.85 倍上调，显著高于对照1.28倍，p<0.01)。相比ATCC 14917，植物乳杆菌 ZKWD-0907饲喂二型糖尿病果蝇后，果蝇促炎因子eiger呈现显著下调(0.54 倍，显著高于对照0.93倍，p＝0.015)。

综上所述，ZKWD-0907能够通过激活菌株可以通过靶向肠道微生态系统，提高胰岛素样肽表达水平，减少氧化胁迫，减少致炎因子表达，具有改善糖尿病患者血糖代谢功能。

以上所述的仅是本发明的优选实施方案，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以作出若干变化合改进，这些都属于本发明的保护范围。