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蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 1型(PCSK1)变体及其用途

文献发布时间：2023-06-19 18:32:25

对序列表的引用

本申请包括作为文本文件以电子方式提交的序列表，所述文本文件被命名为18923804102SEQ，于2021年5月1日创建，大小为189千字节。所述序列表以引用方式并入本文。

技术领域

本公开提供了治疗患有肥胖症的受试者的方法、鉴定具有增加的发展出肥胖症的风险的受试者的方法、以及鉴定肥胖受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂进行治疗的敏感性的方法。

背景技术

肥胖及其心脏代谢并发症，特别是2型糖尿病和冠状动脉疾病，是全球大量发病率和死亡率的原因。对安全且有效的减肥方法存在大量未满足的医疗需求。

对饮食和身体活动的生活方式干预是用于肥胖和超重管理的首选项，但是效果可能有限，并且体重反弹很常见。减肥手术对于重度肥胖或高危患者的减肥非常有效，但是其使用受限于其侵入性、成本、围手术期不良事件(包括围手术期死亡)的风险。虽然一些药物已被证明在减重方面有效，但是用于治疗肥胖的药物疗法受到大多数药物引起的适度减肥、一些剂的副作用特征、禁忌症、低依从性以及包括处方不足在内的治疗障碍的限制。

PCSK1是枯草杆菌蛋白酶样蛋白原转化酶家族的成员，该家族包括加工经由分泌途径的调节或组成型分支运输蛋白质和肽前体的蛋白酶。PCSK1是七种碱性氨基酸特异性酶中的一种，其可在单个或成对的碱性残基处切割其底物。PCSK1被包装到致密的核心分泌颗粒中并被激活，并在神经内分泌系统和脑中表达。PCSK1在由成对的碱性氨基酸残基组成的位点处参与激素和其他蛋白质前体的加工。底物包括阿片黑皮质素原(proopiomelanocortin,POMC)、肾素、脑啡肽、强啡肽、生长抑素、胰岛素和AGRP。PCSK1活性对于牵涉食物摄取、葡萄糖稳态和能量稳态的调节的许多肽激素前体(例如，阿片黑皮质素原、胰岛素原、胰高血糖素原和胃饥饿素原(proghrelin))的激活切割至关重要。

发明内容

本公开提供了治疗患有肥胖症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂。

本公开还提供了治疗具有升高的身体质量指数(BMI)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂。

本公开还提供了在此类方法中检测在来自受试者的生物样品中与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子或PCSK1变体多肽以杂合状态存在或不存在。

本公开还提供了鉴定肥胖受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂进行治疗的敏感性的方法，所述方法包括检测在来自所述受试者的生物样品中与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1基因变体的一个拷贝的存在或不存在，其中当检测到PCSK1基因变体的一个拷贝时，则受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂进行治疗敏感。

本公开还提供了鉴定具有升高的BMI的受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂进行治疗的敏感性的方法，所述方法包括检测在来自所述受试者的生物样品中与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1基因变体的一个拷贝的存在或不存在，其中当检测到PCSK1基因变体的一个拷贝时，则受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂进行治疗敏感。

附图说明

被并入并构成本说明书的一部分的附图说明了几个方面并且与具体实施方式一起用于解释本公开的一些原理。

本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。本专利或专利申请公开的带彩色附图的副本将在进行请求并支付必要的费用后由专利局提供。

图1示出了来自基于英国生物样本库(UK Biobank,UKB)群体的同期群组和来自基于盖辛格健康系统(Geisinger Health System,GHS)医疗保健系统的同期群组的MyCode社区健康倡议(MyCode Community Health Initiative)同期群组中具有不同类别的BMI的个体中PCSK1 pLoF携带者的比例。

具体实施方式

在整个说明书和权利要求书中使用与本公开的多个方面相关的各种术语。除非另外指示，否则此类术语将被赋予其在本领域中的普通含义。其他特定定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式来解释。

除非另外明确说明，否则决不意图将本文陈述的任何方法或方面解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在权利要求书或说明书中，当方法权利要求没有确切地说明步骤是限于特定顺序时，在任何方面决非意图推断顺序。这适用于任何可能的非表达解释基础，包括相对于步骤排列或操作流程的逻辑事项、从语法组织或标点中得到的普通含义或者在说明书中描述的方面的编号或类型。

除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。

如本文所用，术语“约”表示所列举的数值是近似值，并且小的变化不会显著影响公开的实施方案的实践。在使用数值的情况下，除非上下文另外指示，否则术语“约”意指数值可变化±10％并仍然在所公开的实施方案的范围内。

如本文所用，在特定实施方案中，根据需要，术语“包含”可被替换为“由……组成”或“基本上由……组成”。

如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”可包括任何长度的核苷酸的聚合形式，可包括DNA和/或RNA，并且可以是单链的、双链的或多链的。核酸的一条链还指其互补物。

如本文所用，术语“受试者”包括任何动物，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(诸如例如，马、牛、猪)、伴侣动物(诸如例如，狗、猫)、实验室动物(诸如例如，小鼠、大鼠、兔)和非人灵长类动物(诸如例如，猿和猴子)。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是在医生护理下的患者。

如本文所用，当在特定氨基酸或核苷酸序列或位置的编号的上下文中使用时，短语“对应于”或其语法变型是指当将所述特定氨基酸或核苷酸序列与参考序列(例如，本文的参考序列是(野生型)PCSK1的核酸分子或多肽)相比较时，指定参考序列的编号。换言之，特定聚合物的残基(例如，氨基酸或核苷酸)编号或残基(例如，氨基酸或核苷酸)位置是相对于参考序列来指定的，而非通过所述残基在所述特定氨基酸或核苷酸序列内的实际编号位置来指定。例如，特定氨基酸序列或核苷酸序列可通过引入缺口以优化两个序列之间的残基匹配来与参考序列比对。在这些情况下，虽然存在缺口，但是对特定氨基酸或核苷酸序列中的残基的编号是相对于已经与其进行比对的参考序列来进行的。存在多种计算算法，所述计算算法可用于执行序列比对以鉴定出一个聚合物分子中与另一个聚合物分子中的核苷酸或氨基酸位置对应的核苷酸或氨基酸位置。例如，通过使用NCBI BLAST算法(Altschul等人，Nucleic Acids Res.,1997,25,3389-3402)或CLUSTALW软件(Sievers和Higgins,Methods Mol.Biol.,2014,1079,105-116)，可以执行序列比对。然而，序列还可手动地进行比对。

根据本公开已经观察到，在杂合状态的PCSK1中预测的功能变体丧失与发展出肥胖症或升高的BMI的风险相关联。PCSK1中的功能丧失变体的纯合携带者状态是伴有激素紊乱的重度肥胖的已知原因，但是杂合携带者状态之前尚未与更高的BMI或增加的肥胖症风险相关联，使得由PCSK1中的LOF变体赋予的肥胖表型被视为常染色体隐性性状。因为在UKB和GHS研究中的欧洲血统参与者中PCSK1 LOF突变的等位基因频率是0.027％，PCSK1中的杂合携带者是纯合携带者的大于7000倍(每约1,800人中1名杂合携带者对比每约13,500,000人中1名纯合携带者)。因此，杂合携带者状态与较高的BMI和肥胖症风险之间的关联的发现，意味着PCSK1 LOF变体对肥胖症的病因贡献比目前认为的要大。因此，可以治疗对于与肥胖症或升高的BMI相关联的PCSK1改变是杂合的人，以便抑制肥胖症或升高的BMI，减轻其症状，和/或阻遏症状的发展。此外，对于与肥胖症或升高的BMI相关联的PCSK1改变为杂合的人可以通过特定干预(诸如本文所公开的那些干预中的任何一种)来治疗以预防肥胖症。还认为，患有肥胖症或具有升高的BMI的人可以用促进MC4R信号传导的分子治疗，所述MC4R信号传导在具有PCSK1 LOF的人中是有缺陷的。

出于本公开的目的，任何特定的人都可以被归类为具有以下三种PCSK1基因型中的一种：i)PCSK1参考；ii)如本文中所探索的对于与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子为杂合的，和iii)对于与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子为纯合的。当人没有与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子的拷贝时，所述人是PCSK1参考。当人具有与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子的单拷贝时，所述人对于与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子是杂合的。具有拥有部分功能丧失(或预测的部分功能丧失)的PCSK1多肽的受试者对于PCSK1是亚等位基因的。当人具有与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的任何PCSK1变体核酸分子的两个拷贝时，所述人对于与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子是纯合的。

对于被基因分型或确定为对于与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子是杂合的受试者来说，此类受试者与发展出肥胖症和/或升高的BMI的几率增加相关联。对于被基因分型或确定为对于PCSK1变体核酸分子是杂合的受试者来说，此类受试者可以用有效治疗肥胖症，诸如1型肥胖症、2型肥胖症或3型肥胖症的剂和/或用有效治疗升高的BMI的剂来治疗。

在本文所述的实施方案中的任何一个中，与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子可以是编码具有部分功能丧失、完全功能丧失、预测的部分功能丧失或预测的完全功能丧失的PCSK1多肽的任何PCSK1核酸分子(诸如例如，基因组核酸分子、mRNA分子、或由mRNA分子产生的cDNA分子)。在本文所述的实施方案中的任何一个中，与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子也可以是被预测或显示为与较高的BMI、肥胖症风险相关联或导致体外或体内PCSK1功能丧失的任何PCSK1变体核酸分子(诸如例如，基因组核酸分子、mRNA分子、或从mRNA分子产生的cDNA分子)。在本文所述的实施方案中的任何一个中，与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子也可以是任何PCSK1蛋白质截短变体。

在本文所述的实施方案中的任何一个中，变体PCSK1多肽可以是具有部分功能丧失、完全功能丧失、预测的部分功能丧失或预测的完全丧失功能的任何PCSK1多肽。

PCSK1预测的功能丧失变体核酸分子可以是本文所述的变体核酸分子中的任何一种或多种。在一些实施方案中，与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子是蛋白质截短变体。与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCS K1变体核酸分子也是任何PCSK1有害错义变体核酸分子。所述PCS K1有害变体核酸分子可以是本文所述的变体核酸分子中的任何一种或多种。在一些实施方案中，受试者具有以下功能丧失变体PCSK1核酸分子中的一种或两种：5:96393172:A:C、5:96393258:G:A、5:96393366:G:A、5:96394941:G:A、5:96394988:C:T、5:96397351:CAA:C、5:96397358:C:T、5:96397377:C:A、5:96397382:C:T、5:96397390:AA C:A、5:96397440:C:A、5:96398877:A:G、5:96398887:GAAGT:G、5:96398922:A:C、5:96399952:C:A、5:96399993:T:A、5:96400071:G:A、5:96400106:C:T、5:96400170:G:A、5:96408221:A:C、5:96408288:C:C A、5:96408299:A:AG、5:96408310:A:AG、5:96408324:C:G、5:96410771:T:TA、5:96410773:C:T、5:96410797:C:A、5:96410840:G:C、5:96410840:G:T、5:96410844:CAGGGGGAT:C、5:96410910:T:TC、5:96410935:G:GC、5:96410974:TC:T、5:96410983:T:TC、5:96412437:C:CA、5:96412452:C:A、5:96412454:A:AT、5:96416067:G:T、5:96416072:T:A、5:96421879:CT:C、5:96421881:T:A、5:96421893:TG:T、5:96421905:G:A、5:96421940:TA:T、5:96421951:TG:T、5:96421954:AT:A、5:96423354:CA:C、5:96423401:CAA:C、5:96425819:C:G、5:96425827:C:T、5:96425843:TG:T、5:96425891:T:A、5:96425892:AC:A、5:96429256:CT:C、5:96429260:G:A、5:96429269:TG:T、5:96429310:G:T、5:96429319:T:C、5:96432082:C:T、5:96432861:A:C、5:96432869:CA:C、5:96432913:C:A、5:96432957:CT:C、5:96432971:AC:A、5:96432981:G:GCA、5:96432993:CAA:C、5:96433040:C:T、5:96433041:A:G。

在本文所述的实施方案中的任何一个中，肥胖症是1型肥胖症、2型肥胖症或3型肥胖症。在本文所述的实施方案中的任何一个中，肥胖症是1型肥胖症。在本文所述的实施方案中的任何一个中，肥胖症是2型肥胖症。在本文所述的实施方案中的任何一个中，肥胖症是3型肥胖症。在本文所述的实施方案中的任何一个中，受试者具有升高的BMI。

肥胖症的症状包括但不限于身体脂肪堆积过多(尤其是腰部周围)、呼吸急促、出汗增多、打鼾、无法应对突然的体育活动、每天感到非常疲倦、背部和关节疼痛、皮肤问题(来自皮肤褶皱中积累的水分)。

PCSK1参考基因组核酸分子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1中(涵盖GRCh38/hg38人基因组组件中的chr5:96,390,333-96,433,248的ENST00000311106.8；ENSG00000175426.11)，其长度为42,916个核苷酸。SEQ ID NO:1中所示的第一核苷酸对应于5号染色体的第96,390,333位处的核苷酸。

通过可变剪接产生的PCSK1参考mRNA分子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:2-12中。本文所述的变体基因组核酸分子在相应变体位置处的变体核苷酸还具有基于根据SEQ IDNO:2-12的PCSK1参考mRNA序列的变体mRNA分子在相应变体位置处的对应变体核苷酸。这些PCSK1变体mRNA分子中的任何一种都可以在本文所述的方法中的任何一种中检测到。

PCSK1参考cDNA分子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:23中。本文所述的变体基因组核酸分子在相应变体位置处的变体核苷酸还具有基于根据SEQ ID NO:13-23的PCSK1参考cDNA序列的变体cDNA分子在相应变体位置处的对应变体核苷酸。这些PCSK1变体cDNA分子中的任何一种都可以在本文所述的方法中的任何一种中检测到。

PCSK1参考多肽同种型的氨基酸序列示于SEQ ID NO:24-31中。使用PCSK1 mRNA或cDNA分子的经翻译的核苷酸序列，PCSK1变体多肽在变体位置(密码子)处具有对应的经翻译的变体氨基酸。这些PCSK1变体多肽中的任何一种都可以在本文所述的方法中的任何一种中检测到。

所附序列表中列出的核苷酸序列和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出的。所述核苷酸序列遵循从序列的5'末端开始并且前进(即，在每一行中从左到右)至3'末端的标准惯例。仅示出了每一个核苷酸序列的一条链，但应理解的是，互补链是通过对所展示链的任何参考而被包括在内的。所述氨基酸序列遵循从序列的氨基末端开始并且前进(即，在每一行中从左到右)至羧基末端的标准惯例。

本公开提供了治疗患有肥胖症和/或升高的BMI的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂。在本文所述的实施方案中的任何一个中，肥胖症是1型肥胖症、2型肥胖症或3型肥胖症。

在本文所述的实施方案中的任何一个中，瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂是MC4R激动剂或PCSK1激动剂。在一些实施方案中，瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂是MC4R激动剂。在一些实施方案中，瘦素-黑皮质素信号传导通路的激动剂是PCSK1激动剂。在一些实施方案中，瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂包括蛋白质、肽、核酸分子或小分子。

在一些实施方案中，MC4R激动剂是蛋白质，诸如重组MC4R。在一些实施方案中，MC4R激动剂是肽。在一些实施方案中，肽MC4R激动剂是塞美拉肽(setmelanotide)。在一些实施方案中，肽MC4R激动剂是具有氨基酸序列His-Phe-Arg-Trp(SEQ ID NO:32)的肽。在一些实施方案中，MC4R激动剂是肽模拟物，诸如(1,2,3R,4-四氢异喹啉-3-羧酸)。在一些实施方案中，MC4R激动剂是小分子，诸如ALB-127158(a)。

在一些实施方案中，PCSK1激动剂是蛋白质，诸如重组PCSK1。在一些实施方案中，PCSK1激动剂是PCSK1的肽类似物。在一些实施方案中，PCSK1激动剂是肽。

在本文所述的实施方案中的任何一个中，患有肥胖症和/或升高的BMI的受试者可以用附加治疗剂进行治疗。治疗或抑制肥胖症的治疗剂的示例包括但不限于西布曲明、奥利司他、芬特明加托吡酯、氯卡色林、安非他酮加纳曲酮、利拉鲁肽、芬特明加二乙胺苯丙酮、安非他酮、二甲双胍、普兰林肽、托吡酯和唑尼沙胺，或它们的任何组合。在一些实施方案中，治疗或抑制肥胖症和/或降低BMI的治疗剂是塞美拉肽与西布曲明、奥利司他、芬特明、氯卡色林、纳曲酮、利拉鲁肽、二乙胺苯丙酮、安非他酮、二甲双胍、普兰林肽、托吡酯和唑尼沙胺中的一种或多种的组合。

治疗或抑制肥胖症或升高的BMI的治疗剂的施用可重复，例如，一天、两天、三天、五天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、八周、两个月或三个月之后。重复施用可以以相同剂量或不同剂量进行。施用可以重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。例如，根据某些剂量方案，受试者可接受较长时间段(诸如例如6个月、1年或更长时间)的疗法。

治疗或抑制肥胖症或升高的BMI的治疗剂的施用可通过任何合适的途径发生，所述途径包括但不限于胃肠外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内。用于施用的药物组合物期望是无菌的且基本上等渗的，并且在GMP条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即，单次施用的剂量)提供。可使用一种或多种生理学和药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或助剂来配制药物组合物。制剂取决于所选择的施用途径。术语“药学上可接受的”表示载剂、稀释剂、赋形剂或辅助剂与制剂的其他成分相容，并且对其接受者基本上无害。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”以及“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”分别是指引发期望的生物反应，诸如治疗效果和预防效果。在一些实施方案中，治疗效果包括以下中的一种或多种：在施用剂或包含所述剂的组合物之后，肥胖症的减少/降低、BMI的降低、或两者；肥胖症严重程度的减少/降低、症状和肥胖症相关影响、BMI升高相关影响的减少/降低、或两者；延迟症状的发作和肥胖症相关影响、BMI升高相关影响、或两者；降低症状和肥胖症相关影响、或BMI升高相关影响的严重程度、或两者；降低症状和肥胖症相关影响、或BMI升高相关影响的数量、或两者；降低症状和肥胖症相关影响、或BMI升高相关影响的潜伏期、或两者；改善症状和肥胖症相关影响、或BMI升高相关影响、或两者；降低继发症状；降低继发感染；预防肥胖症、或BMI升高的复发、或两者；减少复发发作的次数或频率；增加症状性发作之间的潜伏期；增加达到持续进展的时间；加速恢复；和/或增加替代治疗剂的功效或减少对替代治疗剂的抗性。预防效果可包括在施用治疗方案后完全或部分避免/抑制或延迟肥胖症、或升高的BMI、或两者的发展/进展(诸如例如，完全或部分避免/抑制或延迟)。肥胖症、或升高的BMI、或两者的治疗涵盖已被诊断为在任何临床阶段或表现处患有任何形式的肥胖症、或升高的BMI、或两者的受试者的治疗；肥胖症、或升高的BMI、或两者的症状或体征的发作或演变或加重或恶化的延迟；和/或预防和/或降低肥胖症、或升高的BMI、或两者的严重程度。

在本文所述的实施方案中的任何一个中，所述方法可以进一步包括检测在来自受试者的生物样品中与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子或变体多肽的存在或不存在。应理解的是，群体内的基因序列和由此类基因编码的mRNA分子可由于多态性(诸如单核苷酸多态性)而变化。本文所公开的PCSK1变体核酸分子的本文所提供的序列仅是示例性序列。PCSK1变体核酸分子的其他序列也是可能的。与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子或变体多肽可以是任何PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体，诸如本文所述的那些中的任一种。

在一些实施方案中，检测与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子或变体多肽的存在或不存在包括确定受试者是否具有与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体基因组核酸分子、与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体mRNA分子、由所述mRNA分子产生的PCSK1变体cDNA分子、和/或与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体多肽。在一些实施方案中，此类确定是通过从受试者获得或已经获得生物样品，并且对所述生物样品执行或已经执行测定以确定所述受试者是否具有与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子或变体多肽来进行。

确定受试者是否在生物样品中具有与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体核酸分子或PCSK1变体多肽可以通过本文所述的方法中的任何一种进行。在一些实施方案中，检测步骤、确定步骤或测定是在体外进行的。在一些实施方案中，这些方法可以原位进行。在一些实施方案中，这些方法可以在体内进行。在这些实施方案中的任何一个中，核酸分子可存在于从受试者获得的细胞内。在一些实施方案中，所述测定是核酸分子的序列分析或基因分型测定。在一些实施方案中，所述测定是多肽的免疫测定。

所述生物样品可来源于来自受试者的任何细胞、组织或生物流体。样品可包括任何临床相关组织，诸如骨髓样品、肿瘤活检、细针抽吸物或体液样品，诸如血液、龈沟液、血浆、血清、淋巴液、腹水、囊液或尿液。在一些情况下，样品包括口腔拭子。在一些实施方案中，生物样品包括细胞裂解物。此类方法可以进一步包括从受试者获得生物样品。本文所公开的方法中使用的样品将基于测定形式、检测方法的性质以及用作样品的组织、细胞或提取物而变化。生物样品可取决于所采用的测定进行不同处理。例如，当检测任何PCSK1变体核酸分子时，可以采用被设计用来分离或富集样品的基因组DNA的初步处理。多种已知的技术可用于此目的。当检测任何PCSK1变体mRNA的水平时，不同的技术可用于富集生物样品的mRNA。可以使用检测mRNA的存在或水平或者特定变体基因组DNA基因座的存在的各种方法。

在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括确定受试者的具有与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体基因组核酸分子、与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体mRNA分子、由所述mRNA分子产生的PCSK1变体cDNA分子、和/或与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体多肽的一个拷贝的总负担。总负担是PCSK1基因在杂合状态下所有罕见变体的总和，这可以在与肥胖症的关联分析中进行。在一些实施方案中，受试者对于与发展出肥胖症和/或升高的BMI的风险增加相关联的PCSK1变体中的任何一种的一个拷贝是杂合的。关联分析的结果表明，PCSK1的罕见功能丧失和错义变体的杂合状态与肥胖症风险增加相关联。

在一些实施方案中，检测步骤、确定步骤或测定包括对生物样品中PCSK1核酸分子的核苷酸序列的至少一部分进行测序。测序部分包含对应于功能丧失变体位置的位置。当检测到功能丧失变体位置处的变体核苷酸时，则生物样品中的PCSK1核酸分子是PCSK1功能丧失变体核酸分子。任何特定PCSK1核酸分子内的功能丧失变体位置是变体核苷酸序列的与对应参考核酸分子的核苷酸序列相比不同的一个或多个位置。

在一些实施方案中，检测步骤、确定步骤、或测定包括：使生物样品与引物接触，所述引物与PCSK1核酸分子的核苷酸序列的邻近功能丧失变体位置的部分杂交；使所述引物延伸至少通过所述功能丧失变体位置；以及确定所述引物的延伸产物是否包含在所述功能丧失变体位置处的变体核苷酸。在一些实施方案中，检测步骤、确定步骤、或测定包括对整个核酸分子进行测序。

在一些实施方案中，检测步骤、确定步骤或测定包括对生物样品中PCSK1核酸分子的核苷酸序列的至少一部分进行测序。测序部分包含对应于错义变体位置的位置。当检测到错义变体位置处的变体核苷酸时，则生物样品中的PCSK1核酸分子是PCSK1错义变体核酸分子。任何特定PCSK1核酸分子内的错义变体位置是变体核苷酸序列的与对应参考核酸分子的核苷酸序列相比不同的一个或多个位置。

在一些实施方案中，检测步骤、确定步骤、或测定包括：使生物样品与引物接触，所述引物与PCSK1核酸分子的核苷酸序列的邻近错义变体位置的部分杂交；使所述引物延伸至少通过所述错义变体位置；以及确定所述引物的延伸产物是否包含在所述错义变体位置处的变体核苷酸。在一些实施方案中，检测步骤、确定步骤、或测定包括对整个核酸分子进行测序。

在一些实施方案中，所述测定包括使生物样品与引物诸如改变特异性引物接触，所述引物在严格条件下与PCSK1变体基因组序列、变体mRNA序列、或变体cDNA序列特异性杂交，而不与对应PCSK1参考序列特异性杂交。

在一些实施方案中，仅分析PCSK1基因组核酸分子。在一些实施方案中，仅分析PCSK1 mRNA。在一些实施方案中，仅分析由PCSK1 mRNA获得的PCSK1 cDNA。

核酸测序技术的说明性示例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。在一些实施方案中，所述测定包括RNA测序(RNA-Seq)。在一些实施方案中，所述测定还包括，诸如通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，将mRNA逆转录成cDNA。

在一些实施方案中，所述检测步骤、确定步骤或测定包括：扩增PCSK1核酸分子的至少一部分，其中所述部分包含功能丧失变体位置；用可检测标记对扩增的核酸分子进行标记；使标记的核酸分子与包含改变特异性探针的支持物接触，其中所述改变特异性探针包含在严格条件下与功能丧失变体位置杂交的核苷酸序列；以及检测所述可检测标记。在一些实施方案中，样品中的核酸分子是mRNA，并且在扩增步骤之前将所述mRNA逆转录成cDNA。

在一些实施方案中，所述检测步骤、确定步骤或测定包括：使生物样品中的核酸分子与包含可检测标记的改变特异性探针接触，其中所述改变特异性探针包含在严格条件下与功能丧失变体位置杂交的核苷酸序列；以及检测所述可检测标记。

在一些实施方案中，所述检测步骤、确定步骤或测定包括：扩增PCSK1核酸分子的至少一部分，其中所述部分包含错义变体位置；用可检测标记对扩增的核酸分子进行标记；使标记的核酸分子与包含改变特异性探针的支持物接触，其中所述改变特异性探针包含在严格条件下与错义变体位置杂交的核苷酸序列；以及检测所述可检测标记。在一些实施方案中，样品中的核酸分子是mRNA，并且在扩增步骤之前将所述mRNA逆转录成cDNA。

在一些实施方案中，所述检测步骤、确定步骤或测定包括：使生物样品中的核酸分子与包含可检测标记的改变特异性探针接触，其中所述改变特异性探针包含在严格条件下与错义变体位置杂交的核苷酸序列；以及检测所述可检测标记。

本文所述的改变特异性探针或改变特异性引物包含与PCSK1功能丧失变体核酸分子、PCSK1错义变体核酸分子、或其互补序列互补和/或杂交或特异性杂交的核酸序列。在一些实施方案中，改变特异性探针或改变特异性引物包含至少约5个、至少约8个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个或至少约50个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，改变特异性探针或改变特异性引物包含至少15个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，改变特异性探针或改变特异性引物包含至少15个核苷酸至至少约35个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，改变特异性探针或改变特异性引物在严格条件下与PCSK1功能丧失变体基因组核酸分子、PCSK1功能丧失变体mRNA分子和/或PCSK1功能丧失变体cDNA分子杂交。在一些实施方案中，改变特异性探针或改变特异性引物在严格条件下与PCSK1错义变体基因组核酸分子、PCSK1错义变体mRNA分子和/或PCSK1错义变体cDNA分子杂交。

改变特异性聚合酶链式反应技术可用于检测核酸序列中的突变，诸如SNP。因为当与模板存在错配时，DNA聚合酶将不延伸，所以可使用改变特异性引物。

在一些实施方案中，所述测定包括使生物样品与探针诸如改变特异性探针接触，所述探针在严格条件下与PCSK1变体基因组序列、变体mRNA序列、或变体cDNA序列特异性杂交，而不与对应PCSK1参考序列特异性杂交；以及确定杂交是否已经发生。

在一些实施方案中，所述方法利用足够核苷酸长度的探针和引物以结合至靶核酸序列，并且特异性地检测和/或鉴定包含PCSK1变体基因组核酸分子、变体mRNA分子或变体cDNA分子的多核苷酸。杂交条件或反应条件可由操作人员确定以达到此结果。核苷酸长度可以是足以用于所选择的检测方法(包括本文所述或例示的任何测定)的任何长度。此类探针和引物可在高严格杂交条件下与靶核苷酸序列特异性地杂交。探针和引物可具有与靶核苷酸序列内连续核苷酸的完全核苷酸序列同一性，但可通过常规方法设计不同于靶核苷酸序列并保留特异性地检测和/或鉴定靶核苷酸序列的能力的探针。探针和引物可与靶核酸分子的核苷酸序列具有约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的序列同一性或互补性。

在一些实施方案中，针对纯化的DNA、扩增的DNA和固定的细胞制备物(荧光原位杂交(FISH))的经标记的引物或探针可用于检测。在一些方法中，可在检测之前或在检测的同时对靶核酸分子进行扩增。核酸扩增技术的例示性实例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增反应(SDA)以及基于核酸序列的扩增反应(NASBA)。其他方法包括但不限于连接酶链反应、链置换扩增反应和嗜热SDA(tSDA)。

在杂交技术中，可采用严格条件，使得探针或引物特异性地与其靶标杂交。在一些实施方案中，在严格条件下的多核苷酸引物或探针将与其靶序列杂交，其程度可检测地比与其他非靶序列的杂交程度大，诸如是背景的至少2倍、至少3倍、至少4倍或更多倍，包括是背景的大于10倍。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。

促进DNA杂交的适当严格条件是已知的，例如在约45℃下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃下进行2X SSC的洗涤，或者可在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。通常，用于杂交和检测的严格条件将是其中如下所述的那些：在pH 7.0至8.3时的盐浓度低于约1.5M Na

在一些实施方案中，检测人PCSK1变体多肽的存在包括对从受试者获得的样品执行测定以确定受试者中的PCSK1多肽是否含有变异的一个拷贝，所述变异导致多肽具有功能丧失(部分或完全)或预测的功能丧失(部分或完全)、或由错义变体核酸分子产生、或为截短的变体多肽。在一些实施方案中，所述测定包括对包含变体位置的PCSK1多肽的至少一部分进行测序。在一些实施方案中，所述检测步骤包括对整个多肽进行测序。在PCSK1多肽的变体位置处鉴定出变体氨基酸表明PCSK1多肽是PCSK1功能丧失多肽、或是从错义变体核酸分子产生的。在一些实施方案中，所述测定包括用于检测变体多肽的存在的免疫测定。在PCSK1多肽的变体位置处检测到变体氨基酸表明PCSK1多肽是变体PCSK1多肽。

本文所述的探针和/或引物(包括改变特异性探针和改变特异性引物)包含约15个至约100个、约15个至约35个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，改变特异性探针或改变特异性引物包括DNA。在一些实施方案中，改变特异性探针或改变特异性引物包含RNA。在一些实施方案中，本文所述的探针和引物(包括改变特异性探针和改变特异性引物)具有与本文公开的任何核酸分子或其互补序列特异性杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述探针和引物(包括改变特异性探针和改变特异性引物)在严格条件下与本文所公开的核酸分子中的任何一种特异性杂交。在本公开的上下文中，“特异性杂交”意指探针或引物(包括改变特异性探针和改变特异性引物)不与编码PCSK1参考基因组核酸分子、PCSK1参考mRNA分子和/或PCSK1参考cDNA分子的核酸序列杂交。在一些实施方案中，所述探针(诸如，例如改变特异性探针)包含标记。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记、放射性标记或生物素。

本公开还提供了鉴定发展出肥胖症的风险增加的受试者的方法。所述方法包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1功能丧失变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。所述方法还可包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。当受试者具有PCSK1功能丧失变体核酸分子、或PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽的一个拷贝时，受试者发展出肥胖症的风险增加。在一些实施方案中，受试者对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的。在一些实施方案中，当受试者被鉴定为发展出肥胖症的风险增加(诸如对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的)时，进一步用治疗或抑制肥胖症的治疗剂和/或如本文所述的瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)来治疗受试者。可以向受试者施用本文所述的任何瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂。

本公开还提供了鉴定发展出升高的BMI的风险增加的受试者的方法。所述方法包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1功能丧失变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。所述方法还可包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。当受试者具有PCSK1功能丧失变体核酸分子、或PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽的一个拷贝时，受试者发展出升高的BMI的风险增加。在一些实施方案中，受试者对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的。在一些实施方案中，当受试者被鉴定为发展出升高的BMI的风险增加(诸如对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的)时，进一步用治疗或抑制升高的BMI的治疗剂和/或如本文所述的瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)来治疗受试者。可以向受试者施用本文所述的任何瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂。

本公开还提供了诊断受试者的肥胖症的方法。所述方法包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1功能丧失变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。所述方法还可包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。当受试者具有PCSK1功能丧失变体核酸分子、或PCSK1错义变体核酸分子、或由其产生的多肽的一个拷贝，并且具有肥胖症的一种或多种症状时，受试者被诊断为患有肥胖症。在一些实施方案中，受试者对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的。在一些实施方案中，当受试者被鉴定为患有肥胖症(诸如具有肥胖症的一种或多种症状并且对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的)时，进一步用治疗或抑制肥胖症的治疗剂和/或如本文所述的瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)来治疗受试者。可以向受试者施用本文所述的任何瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂。

本公开还提供了诊断受试者的升高的BMI的方法。所述方法包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1功能丧失变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。所述方法还可包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。当受试者具有PCSK1功能丧失变体核酸分子、或PCSK1错义变体核酸分子、或由其产生的多肽的一个拷贝，并且具有肥胖症的一种或多种症状时，受试者被诊断为具有升高的BMI。在一些实施方案中，受试者对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的。在一些实施方案中，当受试者被鉴定为具有升高的BMI(诸如具有肥胖症的一种或多种症状并且对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的)时，进一步用治疗或抑制升高的BMI的治疗剂和/或如本文所述的瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)来治疗受试者。可以向受试者施用本文所述的任何瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂。

本公开还提供了鉴定肥胖受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)进行治疗的敏感性的方法。所述方法包括确定或已经确定受试者是否具有如本文所述的PCSK1功能丧失变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。所述方法还可包括确定或已经确定受试者是否具有如本文所述的PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。当受试者对于PCSK1功能丧失变体核酸分子或PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽是杂合的时，受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)进行治疗是敏感的。在一些实施方案中，当受试者被鉴定为对治疗是敏感的(诸如对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的)时，进一步用如本文所述的瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)来治疗受试者。可以向受试者施用本文所述的任何瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂。

本公开还提供了鉴定具有升高的BMI的受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)进行治疗的敏感性的方法。所述方法包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1功能丧失变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。所述方法还可包括确定或已经确定受试者是否具有本文所述的PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽的任何一个拷贝。当受试者对于PCSK1功能丧失变体核酸分子或PCSK1错义变体核酸分子或由其产生的多肽是杂合的时，受试者对用瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)进行治疗是敏感的。在一些实施方案中，当受试者被鉴定为对治疗是敏感的(诸如对于PCSK1功能丧失变体或PCSK1错义变体是杂合的)时，进一步用如本文所述的瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂(例如，MC4R激动剂)来治疗受试者。可以向受试者施用本文所述的任何瘦素-黑皮质素信号传导通路激动剂。

本公开还提供了包含本文所述的PCSK1变体核酸分子(基因组核酸分子、mRNA分子或cDNA分子)或其互补序列中的任一者和本文所述的改变特异性引物或改变特异性探针中的任一种的分子复合物。在一些实施方案中，分子复合物中的PCSK1变体核酸分子(基因组核酸分子、mRNA分子或cDNA分子)或其互补序列是单链的。在一些实施方案中，PCSK1变体核酸分子是本文所述的变体基因组核酸分子中的任何一种。在一些实施方案中，PCSK1变体核酸分子是本文所述的变体mRNA分子中的任何一种。在一些实施方案中，PCSK1变体核酸分子是本文所述的变体cDNA分子中的任何一种。在一些实施方案中，分子复合物包含本文所述的PCSK1变体核酸分子(基因组核酸分子、mRNA分子或cDNA分子)或其互补序列中的任一种和本文所述的改变特异性引物中的任何一种。在一些实施方案中，分子复合物包含本文所述的PCSK1变体核酸分子(基因组核酸分子、mRNA分子或cDNA分子)或其互补序列中的任一种和本文所述的改变特异性探针中的任何一种。在一些实施方案中，分子复合物包含非人聚合酶。

以上或以下所引用的所有专利文献、网站、其他出版物、登录号等均出于所有目的以引用方式整体并入，其程度犹如每个单独项目均具体地且单独地被指示为以引用方式如此并入一样。如果序列的不同版本与不同时间的登录号相关联，则指在本申请的有效申请日与登录号相关联的版本。有效申请日是指实际申请日或优先权申请的申请日中较早的日期，如适用，请参考登录号。同样，如果出版物、网站等的不同版本在不同时间发布，则除非另有说明，否则指的是在申请的有效申请日最近发布的版本。本公开的任何特征、步骤、元件、实施方案或方面可与任何其他特征、步骤、元件、实施方案或方面结合使用，除非另有明确指示。尽管为了清楚和理解的目的已经通过说明和举例的方式对本公开内容进行了一些详细的描述，但是将显而易见的是，在所附权利要求的范围内可以实践某些变动和修改。

提供以下实施例来更详细地描述实施方案。它们旨在说明而非限制所要求保护的实施方案。提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供本文所述的化合物、组合物、制品、设备和/或方法如何制备和评价的公开内容和描述且旨在仅仅是示例性地而非旨在限制任何权利要求的范围。已经做出努力以确保关于数字(诸如例如，量、温度等)的准确性，但可能会考虑一些误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，温度是以℃计或处于环境温度，并且压力处于或接近大气压。

实施例

实施例1：总负担

实验设计

概述：遗传关联研究在英国(UK)生物样本库(UKB)同期群组(Sudlow等人，PLoSMed.,2015,12,e1001779)和来自盖辛格健康系统(GHS)的MyCode社区健康倡议同期群组(Carey等人，Genet.Med.,2016,18,906-913)中进行。UKB是一项来自英国22个测试中心的在40岁与69岁之间的人的基于群体的同期群组研究。招募发生在2006年与2010年之间(Sudlow等人，PLoS Med.,2015,12,e1001779)。本研究中纳入了总共142,720名具有可用全外显子组测序和临床表型数据的欧洲血统参与者。GHS MyCode研究是基于医院的GHS患者同期群组(Carey等人，Genet.Med.,2016,18,906-913)。招募发生在2007年与2019年之间。本研究中纳入了总共132,634名具有可用全外显子组测序和临床表型数据的欧洲血统参与者。

BMI的定义(UKB研究和GHS研究)：在UKB和GHS两者中，身体质量指数(BMI)被计算为基于在研究随访中的一次中取得的人体测量学测量值，以千克计的体重除以以米计的身高的平方。BMI类别是基于世界卫生组织分类定义的。

样品制备和测序

使用高通量自动化方法制备100ng的用于外显子组捕获的高质量基因组DNA。外显子组是使用针对GHS研究的一个子集的NimbleGen探针(SeqCap VCRome)(在本文中被称为GHS-VCRome)或用于GHS的第二子集的从Integrated DNA Technologies(IDT)获得的xGen设计的略微修改版本(在本文中被称为GHS-IDT)、或UKB捕获的。

在文库制备期间，将独特的6碱基对(bp)条形码(VCRome)或10bp条形码(IDT)添加到每个DNA片段，以促进多重外显子组捕获和测序。在外显子组捕获之前合并等量的样品。将所捕获的DNA通过聚合酶链式反应进行扩增。在Illumina v4 HiSeq 2500(GHS-VCRome子集和GHS-IDT子集的一部分)或NovaSeq(GHS-IDT子集的一部分和UKB)上使用75bp配对末端测序对多重样品进行测序。测序的覆盖深度(即，覆盖基因组的靶区域中的每个核苷酸的序列读段的数量)足以提供在96％的VCRome样品中的85％靶向碱基上的大于20倍覆盖率，以及在99％的IDT样品中的90％靶向碱基上的20倍覆盖率。

序列比对：将来自Illumina测序仪的原始序列数据上传到DNAnexus平台。数据处理步骤包括使用Illumina软件进行样品解复用；与GRCh38人基因组参考序列进行比对，包括生成二进制比对和映射文件(BAM)、处理BAM文件(例如，重复读段的标记和其他读段映射评估)；以及使用基因分型软件进行单核苷酸变体和读段内插入缺失调用。捕获每个样品的测序和数据质量计量统计以评估捕获性能、比对性能和变体调用性能。

生成了样品级和项目级的变体调用文件(variant calls file,VCF)。项目级的VCF包含所有样品的在同期群组中的任何样品相对于参考基因组携带变体的任何位点处的基因型和相关联度量信息。

LOF和预测的有害基因变体的变体注释和定义：使用Ensembl v85基因定义，用snpEff软件对单核苷酸变体和插入缺失进行注释，以确定它们对转录物和基因的功能影响。然后进一步处理功能注释以获得每个变体的单一效应预测(再生效应预测(RegeneronEffect Prediction)；REP)。

为了减少假阳性LOF基因变体调用的数量，对注释集中的转录物施加了限制。在Ensembl v85中考虑了总共198,002个转录物中的54,214个带有注释的起始和终止转录位点的蛋白质编码转录物的子集。

然后，通过为每个基因选择最有害的功能效应类别，将涉及具有注释的起始和终止的蛋白质编码转录物的snpEff预测组合成单一功能影响预测(即，REP)。表1中列出了用于确定功能效应类别的有害性的层级。

LOF基因变体被定义为预测会通过导致功能基因产物的拷贝的可能丧失来破坏基因功能的变体。这些包括导致移码的插入或缺失、导致引入过早终止密码子或导致转录起始位点或转录终止位点丧失的插入或缺失或单核苷酸变体，以及供体或受体剪接位点中的变体(有关变体定义和效应优先级的完整列表，请参见表1)。

表1：变体定义和效应优先级

错义变体根据其对PCSK1蛋白的预测影响被分类为以下三组：通过以下被预测为有害的(1)5/5计算机模拟预测算法(M3错义变体)、(2)1/5算法(M4错义变体)、或(3)0/5算法(M2错义变体)。所使用的预测算法是：1)SIFT(可在万维网上的“ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19561590”处获得)；2)Polyphen2_HDIV和Polyphen2_HVAR(可在万维网上的“ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20354512”处获得)；3)LRT(可在万维网上的“ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19602639”处获得)；和4)MutationTaster(可在万维网上的“ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20676075”处获得)。

统计学分析

感兴趣的基因和基因变体：本研究聚焦于PCSK1基因和MC4R基因中的LOF基因变体与临床结局的关联。

感兴趣的基因中的变体频率：对于具有全外显子组序列数据的每个欧洲血统个体，来自PCSK1或MC4R中的所有罕见(次要等位基因频率(MAF)<1％)LOF或LOF加错义(M2、M3或M4)变体的基因型信息被收缩成单个复合基因型，使得：1)对于感兴趣的基因中的所有LOF变体的人基因组参考等位基因(R)为纯合的个体被认为对于参考等位基因是纯合的(“RR”复合基因型)，2)对于感兴趣的基因中的至少1个LOF变体为杂合的个体被认为是杂合的(“RA”复合基因型)，并且3)具有相同的LOF变体的替代等位基因(A)的2个拷贝的个体被认为对于所述替代等位基因是纯合的(“AA”复合基因型)。变体没有分型，因此任何对于2个或更多个LOF变体为杂合的个体(即，复合杂合子)都被认为是杂合的(“RA”复合基因型)。鉴于LOF变体的复合杂合携带者的稀有性，这极不可能影响任何关联结果。

然后将针对给定研究(GHS-VCRome、GHS-IDT和UKB)的基因中LOF变体的频率估计为(N_RA+2*N_AA)/(2*N)，其中N_RA是具有“RA”复合基因型的个体的数量，N_AA是具有“AA”复合基因型的个体的数量，并且N是具有非遗失复合基因型的个体的总数。

基因变体与感兴趣的临床结局之间的关联：鉴于每个单独LOF或错义变体的稀有性，关联分析仅限于组合给定基因中所有LOF错义变体的复合基因型(如上所述)，而不是一次一个地测试单独LOF或错义变体的关联。

对于定量性状，通过拟合在BOLT-LMM v2.3.4中实施的线性混合模型进行关联分析(Loh等人，Nat.Genet.,2018,50,906-908)。对于BOLT-LMM的模型拟合步骤，使用根据外显子组测序数据MAF>0.5％的变体。年龄、年龄

表2汇总了PCSK1中的预测功能丧失(pLOF)变体或pLOF加错义变体的负担与身体质量指数的关联。结果来自包括UKB或GHS研究中的263,183名参与者的meta分析。

表2

图1示出了PCSK1 pLOF基因变体的携带者与非携带者在不同BMI类别中的个体比例。

表3至表6(M1-M4)列出了表1中报告的关联分析中包含的PC SK1变体(涵盖GRCh38/hg38人类基因组组件中的chr5:96,390,333-96,433,248的ENST00000311106.8；ENSG00000175426.11)。

表3

表4

表5

表6

除了本文所述的修改之外，所描述主题的各种修改对于本领域技术人员来说也将从前述描述显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。本申请中引用的每篇参考文献(包括但不限于期刊文章、美国和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、基因库登录号等)都出于所有目的以引用方式整体并入本文。

序列表

<110> 雷杰纳荣制药公司(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)

L·A·洛塔(LOTTA, Luca Andrea)

M·A·R·费雷拉(FERREIRA, Manuel Allen Revez)

<120> 蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 1型(PCSK1)变体及其用途

<130> 189238.04102 (3329) (10752WO01)

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42916

<212> DNA

<213> 智人(homo sapien)

<400> 1

actcagcctg gagaccgaag cgcttcactg agcgctcgcc gccgcccagc ctctcctctc 60

gcgcctccta gctcttcgca gagcaaccag gagccaggag tggtctagag cccgagggtg 120

ggaaggggga gtctgtctgg cttttctcct atcttgcttc tttttcctct tcccttccca 180

ctcttgttca agcgagtgtg tgagctatgg agcgaagagc ctggagtctg cagtgcactg 240

ctttcgtcct cttttgcgct tggtgtgcac tgaacagtgc aaaagcgaaa aggcaatttg 300

tcaatgaatg ggcagcggag atccccgggg gcccggaagc agcctcggcc atcgccgagg 360

agctgggcta tgaccttttg ggtcaggtaa gagtttccac tttcaagaaa ctttctgggg 420

ccccagggga ctggcgggac tggagcgcgg tcttccaagt gggagcccca ggttgcactc 480

tccagagccc agagtagcaa agagcaagga gctgctccag ccctcgcccc tgtcgcgctt 540

ggagagagag aaagcttgca ttatttactg tttaggctgg gcgcagccaa gcagaaggaa 600

gccgctgcag ctgggtaggg cttatgctta ctgttggccg ctctagaatt gaaatccgtt 660

cccgcgcggt ttggaagaaa aatccctcca cgcttgttca gggaacttga gatacactca 720

agctcttacc aaccaagcgc ccccgggaga agcagtgcgc tccatccccc gggactgagg 780

cggtctgcgt caggagccgg ctgttgcctt cttttcaata tggcagcatc agatccaagt 840

cctgatgcaa ggggctaagc aggcttgggg ctgtccgccc tggcagcctg taagggcacg 900

cccagggcat tggaagagtg ccagctgctg ggactcgcga ccaggaggtt gggaggccgc 960

ggagtagcct gggaagctgg ggggagaaat ggtgggtgaa agacacggga ccatctatcc 1020

ccgcgactct ctagggagct ccggcttttc actgggaact tataaagtcc aagcttcata 1080

actttgcccg gccagtccca ctgcagggtc gagatgccga actgactatg gggaagggat 1140

ctatttcttt cttgttcttc agccaagtac gtaatcgttt tcccgggaat ttcagcttat 1200

tgttgcctgt ccaagtgaag gcttggtcga taggtagctg gttggaggtg ggtgggcgtc 1260

aagacattaa gtgggagact gcttatagct gagcgattcc gaggggaccc tagggagtgt 1320

gacttctagt ctagagcttt cctttccttg gctcggaatc aagccctcgc cccctgcttg 1380

ggaagttggt ctgcattgaa gcgtgggagg aggcagttgt aaaacatttt ggcgcgtttt 1440

ttctggaggt ggtggttgag acgccgctgg agtcacggat gagtaatcgg cgggggcgtt 1500

ggcgattctg tagaccgaac cctctgggga attcgcctgc tcttgctaga ggcttcattc 1560

tcaactttat aaaccaaatt gtctttgaaa tgcccgaaag gaaaatcaat gcagattggc 1620

ttcctggtgt cccagcagca gatgagtctt ttgcttttgg ccagcccttg ccctcgtgcc 1680

aggctccgtg ttaggggctg aggaataaga ggagggaaag aaacgctctc aagtaatcaa 1740

gaatctagag gagactagct tagagataaa tgattgcaac tgattgtaat ttgtgtaatc 1800

atagaagttg tacttgaagt ctcaatattc attggttgaa ggaatgaaag tagtagggaa 1860

ttcgggaggg gtgaatgaaa actgcccaaa ggagaaaaca tttgctccgg gaacagaagt 1920

caaaggttgc caggagcaca taatgagatc ggagaagaca gtctaggcat agaaaacagc 1980

ttgtgggaaa acagtgagac ataatacagt ttagtagtaa gtctgggaat tgcacgcaat 2040

tattaggaat ttttgagacc caaagagggt atgagtagca gaggaaattg tgctggtggg 2100

tactgtggac atcatacaaa tcatgtatga cctatggggg tggacactgg ggatttaatt 2160

gtgtattcct tgagcagcta ctgaaaggct aaatagcact ggtaaccgtg taggaggaga 2220

ctggggaaga cagcaaaaac taaatctctc ttctttttcc cacctgttag ctctaggcat 2280

gcatctaaac ctagaccatt caatgtgaaa actgcttttc aaaataaata aacataaatc 2340

ttaatagtaa aaaacaatac atcatcattc ttgggaggat ctttgagtaa gggatagcat 2400

agtcacaaaa gcattaacaa atagtggggg aaaaccatct atatttatat atgatttaca 2460

atactatctt tcctctaacc atttttagtt aagatggcat tactaacaaa agttttaaaa 2520

caaacttaac aaaattattt tattagaata ataattcttt gtagaaggct gatagcacgt 2580

tcctggttct gcttatttct ctttttgttt aatattacta aaattacact aatttagcat 2640

tactatattg ggtaccttat tgcctcagga taaagcttgg attaaggtag tgacaagaag 2700

aaaaaccagt tgacagcaga gaaaacagag ctaagcactg gtgatctttt tctgcggctg 2760

ctgatttctc tccccagttc catccacagc ttataggaag attcactgag attcaggctt 2820

ggagcagggc ctaagcttct ctattttaaa attctctggg cgatgagaat caccaattta 2880

aagaacacgt ttcttctgta atatactgtt gtcaactgtt tgtttcttaa ttttaaaaat 2940

gcagggttac ctagaggatt tggtagcctc aaatttagta ctgagtaaag ggagactagc 3000

tcaaaagaat aatgaatata gtcctaaatg aaccaaagat gtcaatagat acccggagaa 3060

gtacaaaccc tctaaagtgg gacaactgcc ctaaatgtag catgttcttt tctgaaagcc 3120

ttgaattagt ggaaaatcaa acgatcacta atagtggcta atagcaattt atcactatga 3180

attcaatggc tacattttat aacaacgata atttatttta gtggaaagtg gcactgacca 3240

tagatagtat cccaggtgtt tgcctgctta ccacaaataa ttgttctttg aacagatata 3300

tttgattaaa tgagcatttt aatatgatat tgtcacacat gaaaaacatg tatttcctcc 3360

aatgtgtgta aaatagaagc atcactagcc tcctactgtg agctaatgaa tatactgtga 3420

actcaagcaa taatattctg agggtcatct taagacctct atcagtgcct tcttcatgaa 3480

gaatgtggat ggagctggag gccattattg ttggcaaact aacacaggaa cagaaaaccg 3540

aataccgcat gttctcactc acaagtgaga gctaaatgat gagaacacgt aaatacatag 3600

aggggaacaa catatactgg ggccttttgg agggtggagg gtgggagaag agaagggatc 3660

agaaaaaaat aactaatggg tattgggctt aatacctggg tgatgaaata atctgtacaa 3720

aaataccccg tgacacaagt ttacctatgt aacaaacctg tacttgtact gctgaactta 3780

aaagtttaaa aaaagaaaaa aaatattaat ttcagatacc aggaatgggc ttaataaaag 3840

ttgcctatct ctaagttagc tgagttttaa actagtccat atatacttgt ttgggaacgt 3900

ggatatttat tttatttctt tccttttata gattggttca cttgaaaatc actacttatt 3960

caaacataaa aaccacccca gaaggtctcg aaggagtgcc tttcatatca ctaagagatt 4020

atctgatgat gatcgtgtaa gtgttgtaca tttgtcttca aaccaatact ctagcttatc 4080

tgctttcttt atgatttcta ataaaaacag aagcattttg caaatgtggt ttttttttta 4140

ttgtgaccaa gattgtttat ctgtattatt tctaatttct ttccataaaa ttataatggc 4200

acataataat aacaagattg ggttgaattg gttgagccaa agttaatttt acacatatat 4260

acgcagttta attatataat tacatatata tctaaagtta attttatatg tacactcaca 4320

aattcagtct aagagcatga aagtgaatat ttaaaatgag agggcagcac taataaaaat 4380

gtttgacaat acagtcaatc aacaaccttt tattaggtac ctattatgta ccaaacactt 4440

taataccaat gtgggctcaa agaaatacat gggccttact ttcaataaca tttcagtata 4500

actgaaaaaa aagtctatta tttctatttg gttttgctgt ataaggagct agtgtttatg 4560

agagaactgt aaatccatgt cttcatgagg caaatgtttc cataagtaat ctattgttgg 4620

atccaaacca tctgatctct tttcatccta gtttgtatct tggttcaatg attaggttac 4680

agcagaaata aatataggta aataaggtag aggcagtttg aatagatagc taatgtacct 4740

attgattttg aagtctattt tcaaggtcaa caaacatatt agaaaatgtt tactatgttg 4800

ggagtattgt aattttcata cagtgttgcc ttttctcaaa gaaatgccat actggaagaa 4860

atttatcctg attcgcctga tatctgtgta cataattttt gttacctagg acaacctgga 4920

gaattagaat gagagatcct cttggtgaga ggattaaaaa catcctttca acttcccagg 4980

gggaaaatat atatatatgt atgtgacaga aaggtgatag aactgttgaa agtagacgaa 5040

attcatgagg actgtaagat aatttgccct tttattcatt ctgaaactga tagaattttt 5100

aaaagaagaa gaaaaagaca aattatgagg gtagggaatg ggaatggcct gggtcaccag 5160

tgttcgaatg taaaagaaac aacaacatcc tgacaatgct gtattaggac cacggacagt 5220

gaccgtatag ctcatctaca cccactgcta gctctttttt gtcaagttat tgcttgatgt 5280

gggagaccaa atcagaggcc ctggacctta ttacagaagt ttcttgtcca ctgaggtctt 5340

cccttactca cttcaaggga gagggctcat cgtgtgtggg ctctgaaaag cagaataact 5400

tctagcactc tggctaggct tagtccccgg gctaagcaga agagagattt ccttctttgc 5460

ctaaatgcat gcccaaactg catgcccatt aatgcacata gaactcaaac tgacctgcct 5520

tctcactttc ataggagaaa attggacaga atagagcata cctaactgtt attcttactc 5580

aaagtatctc atgacaatga agatggccca ttctactctt tatacatccc cttgatagct 5640

gatttggtgg gggaggggtg gaatctcaag acattatgaa aaaatgctaa gaattccttc 5700

tccagcacag gtataacttt gtaaaaaatt agcccaagaa taattttatt ttaggaaaca 5760

ttctggaacc atagaaactt gcattggaag gttgaattag atgatcttca atgctctttc 5820

cagatcaaaa gtattattta taattaagta catgatacct ataatgcata atagaaagac 5880

actaccaatt ttcctctata ccattcagcc tgctcttcta gagattaata catgattctg 5940

agttaatgac attaatcata acactgtttt ctacaattgg atgtttatct gatcagacgg 6000

cagagtgcct cctcttatat cccatttcca aaaaattgct cttggttttc attttattgc 6060

tcttttttga tggaggataa tattctttca aatcagccct gtgaaatgca gcaacagtct 6120

atctttacaa gtctgttaat aaaatctcca agtgtaagtg accctctacc tcaaagatta 6180

gtacttattc cctagcagtc agcttccaga gatcaactca gatgataggc agcattccaa 6240

gcattgaggt attttaagcc aaaacaatta agcttgaaaa tacaagcact ttaaaaataa 6300

atcatagtga ctaatttcta gctttcaggt tcttcccatt atttttaata ggtttgcagt 6360

atatttttaa ttgaaaattg agggcagtct tagtggatgg ttttatcctt cagttgcaaa 6420

ttatttttcg gtttttattt ttggagctga ttcatgagta ctctcacatt aacaatattc 6480

caccacacac tgaattgtca tcatgcatac agcagaaaag atgtgtttgg ggtaggaaat 6540

agtcatattg ccaagaaaaa taagagtata gaattatctc ataatgaata taactacaag 6600

gcagcccctc actctctcag ggcttcaagt ataatagtat tatgctgtaa atatggggca 6660

ggtaattttc gtattgtcag atctctttgc ataatacatg agactgaatt aatggtaagt 6720

gtgcgtggtc agtagtgctc attcatcacc caggatctgt gtctcatatt aaatactttt 6780

aagcagaggt cgaagcacag gggagggagt ttcaaatttg catggataca gcaccattct 6840

tactttataa aatatttgca atttctacct gttgtatgta aagacagaga aattaatcta 6900

taaaagcatt ataacagcag tctcttggct tgttgactca atccataaaa gcagacaaat 6960

tttcagccat ggagccctga aacctcaata taaaaatgag tattatggtc catttgctga 7020

tgaaagcaga ctgaactttt gcttccactg taaccacaat gtaaataatt tagggaatta 7080

tcatttcact gactgcttct cctcccccta aaggtgcact ttactgtaat agaggaaata 7140

ttcatctccc cagtgggcaa tcccttcttc tcactgaggt gccagtttaa tctgtagtca 7200

aatgaaaata ttgcagagct gcctgaactc tgatgggaag ggtactggag atagttagag 7260

gaagtataca gaggtagata tttgactttt gattttcttg ctataaaaat ccttgtaggt 7320

gatatgggct gaacaacagt atgaaaaaga aagaagtaaa cgttcagctc taagggactc 7380

agcactaaat ctcttcaatg atcccatgtg gaatcagcaa tggtacttgg taagtaccta 7440

cagaaggact atgtgggtgg gacctgggac ctggcttctt tatgttgtta catttgcaac 7500

atggattttt tttttttttt atgatggaga atttcatagg gagctatatt gtctggagat 7560

tagggctgat gggatcttct tgatctgcct cttctgtttt gctgagtaag gatgttggaa 7620

acagatatct ttagctgctg tgaaaaaaat aggttgtatt ttttgtcttc ttaagtttat 7680

ttgggataaa tgcagaaaaa taatatcttg caggttaggg tttccaaaaa cagtacttgt 7740

ggcaaaaatc tcatttggtt aaagttattc ttcagaaccc tttaaagcac tcacagagta 7800

tagtgaacat aatttggcat atacaaccct gaatgacaat tcttatatga cacagatgag 7860

aatctctgaa agaggttaaa agaaggaaca caagaaaagt ctattgcaaa tgtctagact 7920

tgcaaaccat tctaccttta agatagttac caaatccttg agcgaagaaa ttgttaagtg 7980

ttgctgtcta cctgcagggt gtcctctctt ctgtttaatg ttacgtctgt atggtagtag 8040

tataggctaa tagaaggatt tgttgttgag aattttataa aagattattt ctcttgaaaa 8100

acacaagcta agactttgat actcttgttg cataagggtt agaaaagggg atcagtttct 8160

cttgacccta cgttttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt 8220

ctttctttct ttctttcttt tctttctttc tctttctttc tttctttcta tctttctttt 8280

tttttttgac agagttttgc tcttgttgcc caggctggag tgcaatggca tgatctcagc 8340

tcactgcaat ctctgtctcc tggcttcaag cgattctcct gcctcagcct ctggagtagc 8400

ttggattaca gatgcccgcc accatgccca gctaattttt gtatttttaa tagagatggg 8460

gttttgtcac attggtcagt ctggtctcga actcctgacc tcaggtgatc cacccgcctt 8520

ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcat gagccaccgc accgggcctc ttgccactat 8580

cttaagtatt tgctcattgc agcagaagag acttatcagt taacacttgt gcatttcctg 8640

tgtgacaaac actattctaa aatgtttgat atgaattaat tcattttgtt ctcatgattg 8700

tctgtgttgt agaaatagta attatgccca tttaacagat ggaaaaacag agatattgga 8760

aagtagaata atttgccaaa atccatggct gctagtggtg ggactataat tcacgactcc 8820

agagtccata ctcttaacaa ctacagtcta aaattgttcc tgcaactgac atagaggcct 8880

tcttctctga ctttggccaa caatctgtgt acagttccag cctcctgtga ttcagcttca 8940

taccagcctg gcaaatactt gtcaccccac cccccaacct ctttatgggg aggagggcac 9000

aaaagcaaga gggcagctcc ttcactgaca cttttgattg tggttattta tagatttctt 9060

attgaccctt tcaccgggta cctggcattc ttttactgtc tctgtctcac atgcttagaa 9120

atgtgcttat atctgtgttc ccttgctacc ctgtacttat ctcctgtaca gtcccacact 9180

ctgactatca gaaaatgtat tttaaaagga aaaccctgaa tctcctctca cagacactta 9240

ccccctaaat cactcatact taaaaatagg caatcacatt gcaattcctg aggcaatcac 9300

agtctcctga gcattccagg ttctgctttt tcctttagaa taaaaattct aaaacattca 9360

tgaatgacta tgcaccaggc aatataatga gagctcaatg tggcaatgga gaatcaggat 9420

ttggggggag atgaaaacat cgactatcaa atagagcttc catagatgaa agggttgagc 9480

atgttattat aaatgaaaga aatttaggga taaaattctt caaagccatg tagttcaaag 9540

agaaggagca caggtgattc atcttttcaa gtgatgtcca tttgggacaa tcgggagaag 9600

agcagcactc tgggggttca tttggcctta ctctcaactt tgttttctca tttcactgaa 9660

ttggcttctt ctaaagagta gagtgaccca aggaaaaaga aagatgggtc tccaggttgg 9720

aactgaagtg cccattttgt agcaagcaaa tgataatttt atcaatgctt cgttgttttt 9780

ctttaccagc aagataccag gatgacggca gccctgccca agctggacct tcatgtgata 9840

cctgtttggc aaaaaggcat tacgggcaaa ggagttgtta tcaccgtact ggatgatggt 9900

ttggagtgga atcacacgga catttatgcc aactatgtaa gtgtgtgcct tctcatgact 9960

gtgacttagg gagctgtctg tgcagacaca cagttagggc tttccttctt ttcaagggga 10020

tgctgctctg gtgtcagtcc ctgggattat gggccaaggt tatgtccctt ctcccacttc 10080

ccactagctt atatgaattt attttgtacc agtgggcatt gaaataattc agtgggatca 10140

aaaattgtac aaaagtatat gtgttgggag aagaaggggc agtgcctaca ccaattaagt 10200

taccaaaatc tgatgacttt gagttgctca gtgtttgggg cattaaagta atcaaatcaa 10260

gccccttgcc tgagatcatt gtcacagttt ccctcctcac ctcttttatg agtctatatc 10320

cctgacattg taaaattata tgaatgtgat tccttccatg caaatccaaa gtgaatacca 10380

cacaatgcac ctatgccaag ctgagaaagg aaaagttttc tagaaatggg aaaataaata 10440

aataaaaaca atttgcttca ttgtttatta agtttataat ataatatgaa caccatcata 10500

tatcttaggt ctttagatca ggaggctggt gtttcatctt tcagattatc ccttgttttt 10560

ctctcatcct ttccacctat caaacattcc ccagctataa caccaagcta aagagccaag 10620

gaaaagagaa ggaaaaatag tagcacagag tagaaattag gaatgattga aatatacgga 10680

aagcattgaa aagtaacagt aagggtatgc gggaggcgtt taagtgtagc tattgggttg 10740

gaaaagggag tggagcctgg aagcttgtct tgaatttcaa gcaccctctc tcaaattaaa 10800

ttacatgttt atttagtgtg cctgggaggc tgaaggagag caccatggac ctgagtccca 10860

ccctcagcca cttctttgca cctatattca taagagagat gagtgtcaaa gtgtcactaa 10920

ctagctttat ggccttaggg aagtcattta acttctctgg gcctcaattt tctcatctga 10980

aaactgagat gactgaacta agtaaactaa ttccttccaa ctccaatatc ccatgagtgc 11040

ctgtgaacca taggcttggt aacattcact gagaattgaa tgctggctca cctggctgtg 11100

ttcatcatct ctgcctggtt tgtgagtaaa ataaatattc agtgactcgg ccagaaactc 11160

taaaatgcag gcttttgagc tatcagccag gatgggaagg catagggtaa gaggcttggg 11220

aagtgatgct tttttttttt tttttttttt tttttaatgc tgccacagtg ttatattttg 11280

ttgtctcttt aggatccaga ggctagctat gattttaatg ataatgacca tgatccattt 11340

ccccgatatg atcccacaaa cgagaacaag tgagtaaata tgcatttgtg tgaaataaag 11400

tactttacaa tgcttttatc ttgtttgaga aaattatacc atatatttca tccacattcc 11460

agtgctcagg aaatgttaat gcacaacatc cataccacaa tattttgttg cttttaaaac 11520

agaaaccaaa gtttctattt ttatattccc tttggtttat agaaccatat tttcattaaa 11580

cttcttacat tatgaaattc tcctctcaaa tgttactgaa ctgttgtagc tttagaaaga 11640

atgtttgaga cataaagagt acacactttg agcccatccc tcccctcaat tcctctatga 11700

atcttttact cttagcaaca tgctttatgt tagtcatgaa aagaaatata tgtaaagaaa 11760

tggatatgaa caatgcccac aacttctgac ggtggctaca gtcaccttca ccagttctct 11820

cagaagagca tggccaaact ccagacagag aaatgcctct gaggtctggc ccctgaatcc 11880

aacacagtct ccagggcatt gagccagccg gaagtctcct ccagagttcc tgctgctata 11940

aggccatagg aaagagagag gagacagcac ccgactccca gattaactct ctgtcccttg 12000

aagccacatt atggtgagag aggccaagag ccacagaggc caagagcaag atcttctaaa 12060

gggagaggtg aaagaaagac ccagaggcaa gagactttca acttctctcc tagccccaaa 12120

gaaacttcac gctctaggca tgtggaccct caaagtgtcc atgcccatgg gagagaccat 12180

ctttgctcat accgatgttc tcacagacat caaggagaca ctcaaacttt ccttttcatt 12240

ttctctacac agaagagact tgcaccaaaa tgatcaaagc caaggtcaaa attagggctt 12300

gttgctacaa gtgaggatgg aaaaagccaa gcatctaaca gctcttggta tatgtcacat 12360

gaagcgcttc tttattctct ctggatggca ctgtctcttg gactgttacc caacttgggt 12420

cagacaagtc tgtctctgtc tctctctctc tctctctctc tttctctctc tctctccctc 12480

tcttccttcc tccctccctc cctccctccc ttccttattc tccctcagaa ctcccaagtg 12540

gctggtgcag taatactgat ctaaagttat ttctttcttt ggatagtctt ccctccagaa 12600

agccaacaaa ccccaggatg ggaggctggg gtacatggac ttggcctcaa cttctgggtg 12660

tttatttctt ccttggggaa aatgggaggc ttgtggatag ttcagggata tgacttcttt 12720

ccgtaccatt tatttctttg agggtgacta aaggggttaa ccgcaaatat cccttagagg 12780

tgaaaacatt ccagtaaaaa cacaatagga accactggca agggtacctt tggagcaaag 12840

tgggagtgtt tcgagagctt acagcagacc ctcagacaaa ctttttgcta tatgtctgaa 12900

gcaggataat gcaggaccag taaggacatc tactcttttg gggcacagcc ttgcaatgta 12960

gttatggctt tgccaattcc cagagtaaag ggtgaccttg gagaaatcac ttacctctct 13020

ctgcctctat tccattttct tcccctaaac tgggtgacaa cgtaccttct ccctatgttt 13080

cttaaatgaa cttcctgagg aaatggctaa taagcacttg gaataataag ccttcttaga 13140

gtggagtaga aacaactttc attccacccc cttggttaag actacgggaa atctgttccc 13200

agacacttga ggagacttag atggaggcac tggctccttc ctaggcagta tacggtcctt 13260

ccaggcagat cctgggtctg gccccaggat ccagtgtggg tgataacttg tacgatggct 13320

gcatagtggg cgaattcttg atgaaatgac attctctgga gtttttccag tcaggagatg 13380

gaacactcag accttcctca aaacaaaggg gatctcacag cacagcattt ataatagttg 13440

ttttatatat atgaatataa taattaaaat aaaatataat ttccctgact cagggagtta 13500

cctgcaaagg ccctagggaa gcagcccata taatgctatt tgttttgtgc ctgaaagccc 13560

tgagcttcca gatcatagcc tgctgtgaat cttccacaca gcattgagag agcatgtcat 13620

agcccaacag ttaagagcag acttgggagc caaatttagg tcaaatttta gatctgccac 13680

ttagtagttg ggtgatcttg aggaaattat ttaacttctt tgtgcttaag ttttatcatc 13740

ttttgaaaaa gaatctctac ttccttgagt tagaggtatt aagtgagtgt atatatatat 13800

agagagagag agggagagag agagagagag agaggtatta agtgagttta tatatatata 13860

tataataagt attatataac atatataata cttcattgag ttaggggtta aagtgaggtt 13920

ttatatatat atatatatct cacttaatat atatatacat ataaactcat ttaatacctc 13980

taacttaatg aggtagatta tttatctata tctatatctg tatatctggc atttaaacaa 14040

attgatttgt ttaaaaatta ttccacaaga tatttaaata ctacccttat tctggttaaa 14100

atattcttgt cacacttgtt atttaagcca tatatgtata tgtgtgcata tgtatatata 14160

tggcttaaat aacatgtgtg acaaggatat ttggcttgga catacacata tatatggctt 14220

ggacactggt acacaaaaaa gttaagtaag tgtttgctgt ggtgatgatg atgatgataa 14280

tgatcacagc ttctcattta gtaactgagg tagaccttct ttcagtgaga aatcaacatg 14340

acaagaataa tatcatccga tgggagcagc agagacaagt caattttctg agccaattca 14400

gaatctgcta tttggaaatg acataatgag caactctctc tcaggatcct cttgactatc 14460

aaccaaaaag gtggcatcct tatcatttat cagaaggtat aataaaaagt agatttgcct 14520

tctagcatgt tgtcagacat aaagccctta ggtttagaaa atgaatggct ccattttgtc 14580

ttggccttta cagcaattgg agaggtatta taccccaatt ccaaggttat tatctcttca 14640

aactatcagt attgctgttg ttctttatta ccacgtaaat gagattaata gaagctacat 14700

ttgaatgcta ctctgaaagt caaaagagga atcactaaat aataaaatct taacagtgca 14760

ggtaatgctt accattaagc tggcataaat ctgtattcat tatttcaaca ccaattacag 14820

attgtttttc tagttaaata acaaatgtga caaggatatt ttaaccagaa taagggtagt 14880

atttaaacta tctcatggaa taatttttaa acaaatcatt ttgtttaaat gccagttact 14940

accattgttc taagataata gaaagttctt tactgcagca cctcacttag aaaagaaaaa 15000

gagctgcggc ctataaagaa tgacatagga acacttttct ttctctcaac gtttggaggt 15060

ggaacctgag gataagagga ggaaaacatg tcaatgcata tttgtaccat gatcctcctg 15120

cagctctcac tagagaatag tcgtccatat acaaggagag ataaataata ggtgctgtca 15180

cactgcatca ttttttagga caaaggcaca aacctgggga tgtctgtcag cagattgatt 15240

ctgttggctc aggctgaaga cctgcactgg attcttttgc tgacctgagc cttgtctccc 15300

atcctgtata catggaaata tataagaagg cagtggtgac ttctggaagt acatttctca 15360

gagatgacaa ctgaattact ccttctacta aggcaaagag cgttcatcca tccacaaagc 15420

ataagttgcc ttctgtatgt tcagatgtgt gcacttttct cagagaatgg tgtggtcagg 15480

acagcttcag ttgcaaatga aagaatccta actcaaagat taagtaacaa agggatttta 15540

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gcttcacttt caagagaatc ctgcctggca gagcaagacc catatgactc acatggaact 15720

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gaaagttgtc tgagaggagg ggccccatga ttgaaaaaaa tcacaaaaag tcaggagggc 15840

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acatgaagga gcaggaatct tattttgtgg aaggagacca ggaaatcatc tttgctactt 16020

caggaaaaag agaagttgaa caattcttct tgatggccag tcaatttagg aattttatat 16080

tccatgctat gctgaattaa tagatggcca gtatagtaga attgaaatgt aactggccaa 16140

cattattgct ccgagctaac ccttcctctc tttcactcta tgttggtata tctggtaggc 16200

tcctccaagc caccaacagc cttcacactc ttacaggttg tttccacaat agaataaaat 16260

cacgaaataa atgaattcac attaatgtgc ttttggcttg ttggccctcc tgagtcagga 16320

tggtggtggg aaaagacaat tatcatcctc agaatttcag aatagatgct ttagtggtgg 16380

aatttggtgt ttggaagacg catttttctt ccaaatactc tgaaatcata aattaccctc 16440

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catcttggct ttccaattag ctggtaatgt cttgcaaata tctcaagctc ctcttggtac 16560

cagataatct tcagacattt tagtgtggca tatatttaga ggagaggagg agggcttaat 16620

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tcactaggga gaaaagtgag gagccacttt gctaccaaaa agtacaaagc agaagccatt 16740

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tatgttatac taatttaaaa caaacaaaca aaaacagtaa caaggccgac aaaaagttaa 17040

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ttataattct tatttttcaa tcctcagaca cgggaccaga tgtgcaggag aaattgccat 17160

gcaagcaaat aatcacaaat gcggggttgg agttgcatac aattccaaag ttggaggtaa 17220

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ttgctacagg acttgaatat gatttgccag cgagtcaata gatatggatt cctagaaaat 17400

ggatagttga atatagccta tacatctttg caggaaaaaa aaatgtggaa atgttgaata 17460

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cttgctaagg aaacagaagg aggaggtaaa tttaggcaaa gacttttcct gcctctcaat 17580

tctgtagaag ttcttcactt tatagagaag aacagcttca aaatttaaaa aaagtacata 17640

cttattatat taaatagcca aattttatct tttatagcaa ggatgtagga tttaattgtt 17700

ttcatcagtg tccttatggg gaaacacatg gtaagttgca ttagggcaac tgtggacatt 17760

ttaataaaga aacgatttac aagaattaga gaaaaccaac aaggggctaa gaagtggtag 17820

gcagatgtta tcacctttag cctcaaggag caaagggaag aagtcagcag aaaatagaga 17880

gggaaagctg tggtcacagg agagagccac tggataggcc ttgagtacaa caacagagcc 17940

acttctaggc aaaggggatt caggggtata ggcacctcat tctcctcttg attcccaccc 18000

tcttgctggt gtcttcagtt ggctgaaccc aatgggaaga cagagcccat tgatgcagtc 18060

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tttagtttgg ttttcaaaaa ccataatcac aaaaagaatc aattgtagaa catttcaatt 18240

acaataaaac cccattaaac tctacatgag tataccttgc atttggttat gcatttcttt 18300

ttagaaacca aataaatata catcgtgaca tgtaatgcat ctttcatgaa tatagggcac 18360

tcttagaatt ttaagtgtca ttcctgattc ctttgatact aacatcttca aagtgttctg 18420

ttaattttta aaaaaaatga agggagaagc acaaattatg taattagcta gtaaaagaat 18480

tcactctttt agtcataatg aacgaaacag ctatagtttg tgaaagaatc atctgatccc 18540

ttcattttgt agagaaagaa tcagaagcaa gctgctcaag gtaatgaaag caagtttgtg 18600

gcagtgtaga actgaaacac aagattccaa gcctactgat gttttccatt actccatcct 18660

ttgatggtct ggccccaaat gcatttttta ccaataatct tcatttatta ggcacctatt 18720

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tttttttttt tttttttttt tttttgtatt tttagtggag acagggtttc atcatgttag 19320

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agctcactgc aacctctgcc tcccaggttc aagcatttct tgtgcctcag cctcctgagt 19560

agctgggatt ataggtgcgt gccagcatgc ctgactaatt tttgtatttt tagtaaagat 19620

ggggtttctc catgttggcc aggctggtct tgaactcctg gcctcaagtg atccacccac 19680

ctcggcctcc caaagtgttg gtattaaagg catgagccac tgcgcctggc tctaaatgca 19740

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ttttaccttt gctccatagt aaataagtgt gaaaatctaa ggctgtgcac tttattgtat 19860

tatgagcctg aagccagaaa taaccaggta gctgcctgta atctgtccag attgtttttg 19920

ccttcctggc tcttgaattc ataagtctga tgacgggtga cagcctgttg gaaagcacaa 19980

agagctaccg cacctacatt gtcctgatga aaaatgattc cccttggggg tgaaatccat 20040

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catccaagga tgctgctcca cttcagactc aatgcccaga gcttttgctg ggaagagagc 20460

cttgagtggg accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacatc acagctgcct acacagtgca 20520

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ttacctggtt tttgactctt aaaatccttt aaaaatacaa atagtaagag tattgggctt 20700

ttgtccatgt acatactgac atcaaccttt gtgtgtcttt gtttattttg tttctcaggc 20760

ataagaatgc tggatggcat tgtgacggat gctattgagg ccagttcaat tggattcaat 20820

cctggacacg tggatattta cagtgcaagc tggggcccta atgatgatgg gaaaactgtg 20880

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tttacacaga cccacatgaa atgaaacctg accatctgga tatgaggaga aggaaagaac 21000

acttaggtta catggaataa cattgttgtg gatttcttaa caaagtcctt tacaatttta 21060

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ttccctattt gtggccaggc gcgatggcca agggaggcag atcaattgag gccaggagtg 21180

gccaatatgg agaaacccca cctctactaa aaacacaaaa attagccagg tgtaactagg 21240

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agtcccagct actcgggagg ctgaggcaca agaattgctt gaacccagaa ggcggaggta 21360

gcagtgagct gagattgcag cattgcactc cagcctgggt gacagagtga gaccctgcct 21420

caaaactaaa tataaataaa taaaatgaat tttccctatt tgggtctgag gttgaatgga 21480

aatttattac ttttagcata tttattttaa aagtgcttct ggacatttct ttctccttac 21540

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aatacctgtg ccttggttgg attgctctgt cacttgggtt tactgtattc ttgcacagat 21720

tctaaagcct tgtgctccat aagatgaaac aaaagtagaa actctggaga gcacaaattg 21780

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gcttataata cacagccttg tgagatttcc aatatcgaag ccaaaagatc tggaattgaa 22140

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gagataattg tgactgtgat ggctacacag acagcatcta caccatctcc atcagcagtg 22380

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ttcccctctg tcatttttaa acccagcctt gagaagccac caaacctgtc attacacaca 22740

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caagggcatg acgatggagg ggcatttagg ggctttgaga acaaagggag acacctttaa 23160

tttaaaaaat gtaaggcccc caatttaact cctgacacag aaaggaccaa ctagctaaag 23220

tatatagatc ctatctcagt gaaatagcag gtcatgatct aattagaggg tgggtgaacc 23280

ctataataat gaccttggaa tgcgtgcaag attcctatta atggcatctc aacaaaattg 23340

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tgtggtctca acttagaagt gtgggcctgc ttctcacgcg catctcttca gctactcaag 23460

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tgggtgtcca gagctgcctt tagaaaatgg cctgttgggc atttcagaat caccatttca 23640

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gcagagccat cataacttga gaaattcagc aactccaagc aggaagccaa tggaggtgat 23940

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tcggtgctgg agcctgggtg ggtgtcttgt tagtaatccc ttggcccaac cagcagcgcc 24060

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acatattaag cattttttgt gcaagtagtt caaatggcta aggccaggat gtcttcatat 24480

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cagaatttct aaatatgcca gaccaaacac aatggacccg atgattaatg ggccagcatg 24600

attcacagtg attttgaaac tttgtttttt atagacagca tttcgtttgg gaatctcaga 24660

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aagataagct ctttcctgcc acttcgaggt cactaaccat agttaacatc tcaatgtaga 25200

tttaatacac acacatctta caaaattggg atcttaatat agacgttatt ttgtaatctg 25260

tttttaaaac ccattctaca atatattaaa catactttct cctgtctaaa tcaatatgct 25320

ttgaccttta aaactcatgc tatccctcaa atcttcttcc cactcagcta caacgccttt 25380

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acttaacaca gaggaaaaaa attgaactgt ctcacactgc acatcacagc tttttatgtg 26340

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tatggttgca tattagaaga agtgattaaa cttgtaaatt actattatcc ttcctaataa 26460

ggagattatc ctagaataaa ttacatattc tctagagaga gaacaaagca gtgtccttat 26520

gtcatattca gtagactcag ttcgtaataa cagaaaggaa aaatatcttg gcctttgcca 26580

tgactggaaa agccctgagg ttcctgagcc tttgtccagg agagtccagt ttatctctag 26640

gatccctggg gcttcctatg gagatggggt atattcctgg gtatctcggc tgtgagatgg 26700

ctacagtggc taagcaagga agtctagcaa ggctcttacc aagagtccac ctacttggag 26760

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attgggccct ccagaaaagc tatgttcaga atctaagttc acttataata ggaagtagat 26880

ggacaaaaga caaaaatcta tgaacacaag ctgagactgg catcagcaga tccaaattaa 26940

ccgagaaata attgtccaag cagtgaaaat tgcaaggaac acctggcttc aagttctagc 27000

tctaccacta gctatgtggc cttcggcaag ttaatttact tgtggggttc agtctttcca 27060

tctataaaat gaaggggtca aacgagacct ttttttacaa acttcttctc ttcctaagat 27120

tctcagagtt gagattgaaa atgtcagcct gcataggtaa tccaacatga attgttgggg 27180

tcagtgatga ggggtctgga ctggaagaaa atagggtcct atggattata ggatcctgtg 27240

caacagactt attatattta agatttcaaa acacagacta ctaccccagg gagctgttaa 27300

aagaaagcaa tcttaaaatt ttatgtctag agcctttctt ctctatccaa cacctgtcag 27360

atgcatgtaa atataactag ccgtgcctag cccatccttg tatagtgacc aatatagtag 27420

aaatatccat ctgctgaaca gaagtaatgc caattttatg taagagctga aattgtaaaa 27480

gtgcaatcct tggtttctaa aacctcaagg cttctttttc tgtatagtgg aaaatgatcc 27540

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cccaggctgg agtgcagtgg caagatctcg gctcactgca acctcaaccc ctccggttca 27660

agaaattctt atgcctcagc ctcctgagta gctgggatta caggcatgtg ccaccatgcc 27720

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tcattaatct cagtctctga tggacagtct ctaaagcagg tgtttcattt ctgtgaaaca 27840

ctcagatggg ttccaagggg tccatgaatc tctttgcaac taaatgcaga attgcttata 27900

aatgtatgta tggcatattt ctggggaatg gcttataggt ttcaccagat tctcagtgtt 27960

cgtgatttaa gagatattaa gagtctatga tctcccaggt gcttatcata agaatttaat 28020

tcccttcatt ttgactcaat tcatcagtaa gataagtatg actgatctat cttaacattt 28080

atatccttac tgccaaggta catagaggtt attaagattt ctgttctcaa ttgaacattt 28140

ttctgaactc tattcaattg tctataccaa agctgaatgc cagaatttct agacatgtga 28200

ccaagcttta tcccaaggca ctcaagaatg agaaaatcat ttaatcatgt gccatcccac 28260

aggaacaact atggagactg aagagccctt gcctaaactt atcaagaata atggcaccca 28320

atattgatta ggttcttact gtagaccaga cacagctggc ctctttatat acaatattaa 28380

ttataacgct tacaacattc ttatgacata gaaattatta atttcaccta taaatgggaa 28440

aaaataaggc ttagagaggt tgagatatat aaccaagatc ccacaaagaa attcaaactc 28500

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<212> DNA

<213> 智人(homo sapien)

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guucguugca acaaauugau gagcaaugcu uuuuuauaau gccaacuuug uacaaaaaag 60

uuggcaccau ggagcgaaga gccuggaguc ugcagugcac ugcuuucguc cucuuuugcg 120

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agauccccgg gggcccggaa gcagccucgg ccaucgccga ggagcugggc uaugaccuuu 240

ugggucagau ugguucacuu gaaaaucacu acuuauucaa acauaaaaac caccccagaa 300

ggucucgaag gagugccuuu cauaucacua agagauuauc ugaugaugau cgugugauau 360

gggcugaaca acaguaugaa aaagaaagaa guaaacguuc agcucuaagg gacucagcac 420

uaaaucucuu caaugauccc auguggaauc agcaauggua cuugcaagau accaggauga 480

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gcaaaggagu uguuaucacc guacuggaug augguuugga guggaaucac acggacauuu 600

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cccgauauga ucccacaaac gagaacaaac acgggaccag augugcagga gaaauugcca 720

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aaagagaacg ggauacaucu ccuaauggcu uuaagaauug ggacuucaug ucuguucaca 1740

cauggggaga gaacccuaua gguacuugga cuuugagaau uacagacaug ucuggaagaa 1800

uucaaaauga aggaagaauu gugaacugga agcugauuuu gcacgggacc ucuucucagc 1860

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