一种检测香蕉枯萎病病原菌的引物组、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测香蕉枯萎病病原菌的引物组、试剂盒及应用。

背景技术

香蕉枯萎病自19世纪末爆发以来，曾对香蕉产业造成毁灭性影响，其是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc)侵染所引起的毁灭性土传病害。抗枯萎病香蕉Cavendish的出现，曾一度使世界香蕉产业恢复生机。然而，上世纪六十年代起，香蕉枯萎病菌4号生理小种(Race 4)的出现使世界香蕉产业再次受到严重打击。

依据病原菌对寄主的致病性，目前侵染香蕉的香蕉枯萎病菌分为1号(Foc R1)、2号(Foc R2)和4号生理小种(Foc R4)。其中Foc R1主要侵染香蕉的栽培种‘大蜜哈’(Grosmichel，AAA)、‘粉蕉’(Fenjiao，ABB)等，曾导致主裁品种‘大蜜哈’绝产；Foc R2主要侵染‘棱香蕉’(Bluggoe，ABB)；而Foc R4 可侵染几乎所有栽培蕉，其又可根据致病性条件分为热带4号(Foc TR4)和亚热带4号(Foc ST4)。该病可通过种苗、土壤、流水、农用器械等传播，在缺少寄主的情况下，仍可在土壤中存活长达30年。目前，因缺乏有效防治药剂和适宜的抗病品种，该病害已在世界主要香蕉种植区广泛传播。

目前，基于PCR的分子检测技术仍是香蕉枯萎病快速检测最主要的方法。正如我们所知，引物的特异性是PCR检测技术成功的关键。然而，不同区域的 Foc遗传背景往往有差异，因此，在引物设计过程中采用的菌株样本的来源区域范围和遗传背景的丰富程度在很大程度上决定了Foc分子检测引物在不同区域的适用性和准确性。

本发明基于中国及周边地区的香蕉枯萎病菌菌株，对香蕉枯萎病菌分子检测引物进行评价，筛选出适用于中国香蕉枯萎病菌检测的特异性引物，并整合建立一套能精确到生理小种的香蕉枯萎病菌标准化分子检测体系，可用于香蕉种苗及田间病株检测，为阻断香蕉枯萎病的种苗传播以及田间精准防控提供技术支持。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测香蕉枯萎病病原菌的引物组、试剂盒及应用，其检测结果可精确到生理小种，可为阻断香蕉枯萎病的种苗传播及田间防控提供技术支持。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明的第一个目的在于保护一种检测香蕉枯萎病病原菌的引物组，包括4 对特异性引物，分别是引物对SIX9-Foc-F和SIX9-Foc-R、引物对Foc-1和Foc-2、引物对W2987F和W2987FR、引物对SIX6b-210-F和SIX6b-210-R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.8所示的序列。

本发明的第二个目的在于保护一种试剂盒，所述试剂盒包含有所述的引物对，所述试剂盒还包括2×PCR Mix(Dye)、Template DNA以及ddH

本发明的第三个目的在于保护所述引物组用于检测香蕉枯萎病病原菌及其生理小种的应用。

作为优选，所述香蕉枯萎病的病原菌为Foc；所述香蕉病病原菌的生理小种包括Foc R1、Foc R4、Foc TR4和Foc ST4。

本发明的第四个目的在于保护利用所述引物组检测香蕉枯萎病病原菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检测香蕉或病原菌样品的总DNA，利用所述引物对SIX9-Foc-F 和SIX9-Foc-R进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若泳道的 260bp片段处出现明亮的特征条带，则判定香蕉枯萎病病原菌为Foc；

(2)在步骤(1)的基础上，取待检测样品的总DNA，利用所述引物对Foc-1 和Foc-2进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若泳道的242bp 片段处出现一明亮的特征条带，则判定香蕉枯萎病病原菌的生理小种为Foc R4；

(3)在步骤(2)的基础上，取待检测样品的总DNA，利用所述引物对 W2987F和W2987FR进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若泳道的452bp片段处出现一明亮的特征条带，则判定香蕉枯萎病病原菌的生理小种为Foc TR4；若未出现明亮特征条带，则判定香蕉枯萎病病原菌的生理小种为Foc ST4；

(4)在步骤(1)的基础上，取待检测样品的总DNA，利用所述引物对 SIX6b-210-F和SIX6b-210-R进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若泳道的210bp片段处出现一明亮的特征条带，则判定香蕉枯萎病病原菌的生理小种为Foc R1。

作为优选，步骤(1)-(4)中PCR扩增体系为：2×Taq Plus MasterMix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板DNA 1μL，加ddH

作为优选，步骤(1)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸10s，进行35个循环；72℃终延伸10min；

步骤(2)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸90s，进行35个循环；72℃终延伸10min；

步骤(3)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃终延伸10min；

步骤(4)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸10s，进行35个循环；72℃终延伸10min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明以中国及周边地区香蕉枯萎病菌代表性菌株对相应的PCR扩增引物进行了适用性评价，分别筛选出了可以准确检测Foc、Foc R1、Foc R4及Foc TR4 的特异性引物，建立了一套香蕉枯萎病菌的分子检测体系，可应用于中国及周边地区香蕉种苗及田间香蕉枯萎病的检测，检测结果可精确到生理小种，对香蕉枯萎病的田间防治及蕉园的种植管理具有指导性意义。同时该检测体系也可为其它国家和地区的香蕉枯萎病检测提供参考。

附图说明

图1为引物W2987F/R对供试菌株的扩增结果；

图2为引物Foc-1/2对供试菌株的扩增结果；

图3为引物Foc-SIX8b-F/R对供试菌株的扩增结果；

图4为引物SIX8b-206-F/R对供试菌株的扩增结果；

图5为引物SIX9-Foc-F/R对供试菌株的扩增结果；

图6为引物SIX6b-210-F/R对供试菌株的扩增结果；

图7为香蕉组织中Foc的检测结果；

图8为香蕉枯萎病菌的分子检测流程图；

有关附图标记的说明：

图7中，A：引物SIX9-Foc-F/R检测结果；B：引物Foc-1/2检测结果；C：引物SIX6b-210-F/R检测结果；D：引物W2987F/R检测结果；

M为DNA分子量标，左侧数字标记为DNA分子量标大小；1，2为接种 Foc TR4的香蕉组织，3，4为接种Foc ST4的香蕉组织；5，6为接种Foc R1的香蕉组织；7为未接种Foc的健康香蕉组织，8为无DNA对照。

具体实施方式

下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述。

1.材料与方法

1.1供试菌株

选用不同生理小种的香蕉枯萎病菌共103株，包含Foc R157株，Foc R446 株。其中，76株香蕉枯萎病菌采集自广西、广东、云南、海南和福建等中国的全部产蕉省份，是从本研究团队建立的403株香蕉枯萎病菌资源库中选出的代表性菌株，菌株的遗传背景多样性涵盖所有已报道的中国香蕉枯萎病菌的营养亲和群；16株来自于缅甸，6株来自越南，5株来自尼泊尔。镰刀菌属的不同种及其他常见香蕉病原真菌菌株共12株。具体详见表1。

表1供试菌株及来源

1.2培养基

PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，H

PDB培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，H

1.3方法

(1)菌株活化与培养

将所有供试菌株移至PDA培养基上，28℃培养5d后，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌块，转接至装有100mL PDB培养基的锥形瓶内，放入 28℃摇床内，90rpm培养5d。随后用真空抽滤的方法收集菌丝，并用无菌滤纸进行干燥，-20℃保存备用。

(2)DNA提取

使用北京索莱宝科技有限公司真菌基因组DNA提取试剂盒提取供试菌株基因组DNA，经Thermo Nanodrop测定DNA浓度后，使用TE Buffer调整DNA 浓度至10ng/μL，-20℃保存备用。

(3)PCR扩增

PCR扩增体系见表2，具体引物序列及扩增条件见表3。

表2 PCR扩增体系

表3具体引物序列及扩增条件

PCR反应结束后，每个样品扩增产物分别取2μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像仪中观察记录扩增结果，并计算各对引物的检出率及假阳性率。每个样品、每对引物重复实验3次。

1.4香蕉植株接种与检测

分别选择对Foc R4敏感的香蕉品种Williams(AAA)和对Foc R1敏感的香蕉品种Cachaco(ABB)进行接种试验。

将5叶龄香蕉苗移栽至以蛭石为基质的直径20cm、高22cm的塑料盆内，每盆一株，室温培养，每隔3d淋水1次。移栽定植10d后，Williams(AAA)蕉苗分别接种两株Foc TR4(1408，1624)菌株和两株Foc ST4(16107，16266) 菌株，Cachaco(ABB)蕉苗接种两株Foc R1(1565，15102)菌株。每株蕉苗淋入40mL浓度为1×10

室温培养40d后，采集球茎，用北京索莱宝科技有限公司真菌基因组DNA 提取试剂盒提取总DNA，使用上述针对不同生理小种筛选出的引物进行PCR扩增，反应结束后用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2.结果

2.1Foc TR4扩增引物的评价

供试菌株共115株，其中Foc TR4菌株37株，其它菌株78株。Foc TR4扩增引物对供试菌株的检测结果见表4，引物W2987F/R对供试菌株的扩增结果见图1。

表4 Foc TR4扩增引物对供试菌株的检测结果

由表4可知，4对候选引物对中，引物SIX1a-266-F/R对目标菌株的检出率仅为35.14％，远低于其它3对引物，不宜用于Foc TR4的检测。引物 VCG01213/16F1/R2、FocTR4-F/R和W2987F/R对目标菌株的检出率都很高，分别为100％、97.30％和91.89％。

从对非目标菌株的扩增结果来看，引物W2987F/R的假阳性率远低于引物VCG01213/16F1/R2和FocTR4-F/R。因此，综合来看，4对引物中W2987F/R对目标菌株的检出率较高，且假阳性率低，因此，该引物更适用于Foc TR4的检测。

2.2Foc R4扩增引物的评价

Foc R4扩增引物对供试菌株的检测结果见表5，引物Foc-1/2对供试菌株的扩增结果见图2。

表5 Foc R4扩增引物对供试菌株的检测结果

由表5可以知，两对检测Foc R4的候选引物Foc-1/2和Foc-SIX8-F/R对供试的46株Foc R4菌株检测中，结果呈阳性的分别为42株和43株，检出率分别为91.30％和93.48％。在69株非目标菌株中，引物Foc-SIX8-F/R有20株检测结果呈阳性，假阳性率高达28.99％；而引物Foc-1/2的扩增结果中仅有1株呈假阳性，假阳性率为1.45％。因此，引物对Foc-1/2更适合于Foc R4的检测。

2.3Foc ST4扩增引物的评价

Foc ST4扩增引物对供试菌株的检测结果见表6，引物Foc-SIX8b-F/R和 SIX8b-206-F/R对供试菌株的扩增结果见图3和图4。

表6 Foc ST4特异性引物对供试菌株的检测结果

结合表6、图3及图4可知，在9株Foc ST4菌株中，两对Foc ST4候选引物Foc-SIX8b-F/R和SIX8b-206-F/R均只有1株菌株检测结果呈阳性，检出率仅 11.11％。此外，在106株非目标菌株中，引物Foc-SIX8b-F/R检测的假阳性率为3.77％，SIX8b-206-F/R未出现假阳性。这两对检测Foc ST4特异性引物对Foc ST4的检出率过低，均不适用于Foc ST4的检测。

2.4Foc扩增引物的评价

引物SIX9-Foc-F/R对供试菌株的扩增结果见图5。

由图5可知，在103株Foc菌株中，有101株菌株出现特异性条带，检出率为98.06％；12株非目标菌株中均未出现特异性条带。因此，该引物可用于检测Foc。

2.5Foc R1扩增引物的评价

引物SIX6b-210-F/R对供试菌株的扩增结果见图6。

由图6可知，供试的57株Foc R1菌株中有54株菌株检测结果呈阳性，检出率为94.74％；在58株非目标菌株中，有3株Foc ST4菌株检测结果呈阳性，假阳性率为5.17％。因此，Foc R1可使用该引物进行检测。

2.6香蕉组织中香蕉枯萎病菌的检测结果

结果见图7。

由图7可知，6份接种Foc的染病香蕉组织样品，经Foc检测引物 SIX9-Foc-F/R扩增后，均出现阳性条带，而未接种的香蕉组织检测结果呈阴性；

使用Foc R4特异性引物Foc-1/2进行检测时，4份接种Foc R4的香蕉组织检测结果为阳性，而接种Foc R1和未接种的香蕉组织检测结果为阴性；

使用Foc TR4检测引物W2987F/R扩增时，只有2份接种Foc TR4的样品结果呈阳性；

使用Foc R1检测引物SIX6b-210-F/R检测时，只有2份接种Foc R1的样品检测结果为阳性。

结果表明，这4对检测引物在检测过程中均可排除Foc寄主基因组DNA的干扰，可用于染病香蕉组织样品的检测。

根据以上结果，建立起一套香蕉枯萎病菌的分子检测流程，流程图见图8。在该检测流程中，引物SIX9-Foc-F/R用于Foc的检测，引物SIX6b-210-F/R用于区分Foc R1和FocR4，引物W2987F/R进一步将Foc R4区分为Foc TR4和 Foc ST4。该流程可应用于中国及周边地区香蕉种苗及田间香蕉枯萎病的检测，检测结果可精确到不同生理小种。

3.讨论

目前用于设计Foc分子检测引物的基因区段主要分为两大类，一类是ITS、 IGS、TEF等高度保守区段，然而这类基因几乎存在于所有真菌中，尽管不同物种间这类基因存在一定差异，但其精度往往不足以准确区分Foc的不同生理小，本发明中选用的基于IGS区段设计的引物对VCG01213/16F1/R2和引物对 FocTR4-F/R在检测过程中均表现出较高的假阳性，也证明了这一观点；另一类是Foc致病相关基因，由于这类基因与致病性密切相关，在不同生理小种中具有独特性，因此该类基因更适于区分病原菌的种下类群。本发明筛选出的四对引物中，检测Foc TR4的引物W2987F/R、检测Foc的引物SIX9-Foc-F/R和检测Foc R1的引物SIX6b-210-F/R均是依据致病相关基因设计，这也说明基于致病相关基因设计的引物更加准确、稳定。

木质部分泌蛋白(Secreted in Xylem，SIX)是F.oxysporum目前广泛报道的毒力因子之一，可作为特异的标记用于区分不同的F.oxysporum专化型。目前， Foc中已报道了9个SIX基因，其中SIX8基因被认为仅存在于Foc R4中，可作为分子标记将Foc R4和其他生理小种区分开来。此外，SIX8基因的SNP变异还可以进一步用来区分Foc TR4和Foc ST4。然而，本研究中选用的依据SIX8 基因设计的Foc R4扩增引物Foc-SIX8-F/R在对供试菌株的扩增中，有46.15％的Foc R1菌株呈假阳性；Foc ST4扩增引物Foc-SIX8b-F/R和SIX8b-206-F/R的检出率均只有7.69％。有研究表明，Foc的SIX基因在Foc谱系中既有垂直遗传，也存在水平遗传。而不同地区的Foc菌株受到多种因素的影响，遗传进化和基因转移存在一定的差异，这可能是造成这些引物不适用于检测中国Foc菌株的重要原因。

对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 一种检测香蕉枯萎病病原菌的引物组、试剂盒及其应用

<130> 2022

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgctgaag cccagaacaa 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctgtccgt cgatcgttcc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggggatgt atgaggaggc t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgacagcgt cgtctagttc c 21

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgccgagacc ctgacaa 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccgatgttc gtcaggta 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgcttccca ataccgtctg t 21

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aagttggtga gtatcaatgc 20