从头皮组织中分离并大量增殖真皮毛乳头细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种分离和扩增来自头皮组织的真皮毛乳头细胞的方法，更具体地，涉及一种通过剪切(chopping)由从头皮组织中分离出的毛球中分离真皮毛乳头细胞，然后通过传代使分离的真皮毛乳头细胞扩增的方法。

背景技术

脱发已知由疾病、营养不良、衰老、荷尔蒙失调等引起。尽管已经进行了许多研究，但脱发的根本机制尚不清楚。通常，毛发经历由三个阶段组成的一个毛发周期：通过刺激真皮毛乳头使角质形成细胞活跃分裂和增殖而生长毛发的生长期；毛球的血液供应被切断，并且真皮毛乳头与毛囊分离的退行期；以及细胞增殖停止并且毛发不生长的休止期。在休止期后，毛发重新进入生长期或进入毛发从头皮脱落的外生期。在人类中，毛发具有独立的生长周期，其中一些进入外生期而一些进入生长期，因此，毛发的总数保持在恒定水平。脱发是指这种平衡向外生期倾斜，并且在头发应当正常存在的区域中头发脱落的情况。

已经做出努力来治疗脱发。尽管如此，到目前为止，只有两种药物(非那雄胺和米诺地尔)被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗脱发。

普通人大约有100，000根至150，000根头发，并且头发在毛囊中形成。在毛囊中，存在其中分布有细小的血管并提供毛发生长所需要的营养物质的乳头，在乳头上方，存在提供油脂从而使毛发有光泽的皮脂腺。毛囊由数种不同的上皮细胞和真皮毛乳头细胞组成。真皮毛乳头细胞是位于毛囊底部的间充质来源的成纤维细胞，在毛发生长中起着重要作用。特别地，据报道米诺地尔对真皮毛乳头细胞具有增殖和抗凋亡作用。然而，在毛发生长中起重要作用的真皮毛乳头细胞很难从头皮中分离和培养，并且当大量培养真皮毛乳头细胞时，出现毛发再生能力降低的问题。

发明内容

技术问题

本发明旨在提供一种通过剪切由从头皮组织中分离出的毛球中分离真皮毛乳头细胞，并通过传代使分离的真皮毛乳头细胞扩增的方法。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供一种分离和扩增真皮毛乳头细胞的方法，该方法包括以下步骤：(A)从头皮组织中分离毛球；(B)从所述毛球中分离真皮毛乳头细胞；和(C)传代。

在本发明中，从头皮组织中分离毛球的步骤(A)可以包括以下步骤：(a1)用MEMα培养基填充灭菌的皮氏培养皿，使得从受试者收集的头皮组织(从表皮到真皮层)被浸没；(a2)使用MEMα培养基在皮氏培养皿的盖子上形成液滴，使用显微外科剪刀和镊子分离真皮的毛球，并将分离的毛球移动到所制备的液滴上；以及(a3)在体视显微镜下观察移动到制备的液滴上的毛球的同时，使用注射器和显微外科镊子从毛球的末端去除脂肪组织和毛干。

在本发明中，从毛球中分离真皮毛乳头细胞的步骤(B)可以包括以下步骤：(b1)将解剖培养基(dissection medium)和所述毛球置于细胞培养皿中，然后使用精密显微剪刀剪切毛球；以及(b2)将剪切的毛球收集在试管中，然后离心分离。

在本发明中，在步骤(b1)中剪切的毛球可以具有15μm至120μm的尺寸。

在本发明中，所述离心分离可以在2，200rpm下进行5分钟。

在本发明中，步骤(C)的传代可以包括以下步骤：(c1)根据细胞计数确定用来传代的培养皿，然后从培养皿中弃去培养基，然后用PBS洗涤；(c2)用0.25％的胰蛋白酶/EDTA处理细胞，然后在37℃、5％的CO

在本发明中，所述传代可以包括将步骤(c1)至步骤(c5)重复三次。

有益效果

根据本发明扩增的真皮毛乳头细胞可以在毛发生长中发挥重要作用，因此，涉及一种扩增真皮毛乳头细胞的方法的本发明可以用于各种工业领域中，包括医疗领域和化妆品领域。

附图说明

图1示出了从毛球中分离真皮毛乳头细胞的方法之间的细胞产量的比较。

图2示出了根据真皮毛乳头细胞分离方法和培养基组成的扩增的结果。

图3示出了根据各个传代的案例之间的细胞产量的比较。

图4示出了与根据各个传代的案例之间的真皮毛乳头细胞有关的生长因子的分泌水平的比较。

图5示出了根据剪切阶段的毛球尺寸变化。

图6示出了剪切阶段之间的细胞扩增的比较。

具体实施方式

本发明的一个实施方案提供一种分离和扩增真皮毛乳头细胞的方法，该方法包括以下步骤：(A)从头皮组织中分离毛球；(B)从所述毛球中分离真皮毛乳头细胞；以及(C)传代。

如本文所使用，术语“毛球”是指一种厚的棒状结构，其形成被毛囊包围的毛发根的下部，并且毛细血管、真皮毛乳头细胞、角质形成细胞等位于其中。

在本发明的另一实施方案中，从头皮组织中分离毛球的步骤(A)可以包括以下步骤：(a1)用MEMα培养基填充灭菌的皮氏培养皿，使得从受试者收集的头皮组织(从表皮到真皮层)被浸没；(a2)使用MEMα培养基在所述皮氏培养皿的盖子上形成液滴，使用显微外科剪刀和镊子逐个分离真皮的毛球，并将分离的毛球移动到制备的液滴上；以及(a3)在体视显微镜下观察移动到液滴上的毛球的同时，去除毛球末端的脂肪组织和毛干。

在本发明的另一实施方案中，从毛球中分离真皮毛乳头细胞的步骤(B)可以包括以下步骤：(b1)将解剖培养基和毛球置于细胞培养皿中，然后使用精密显微剪刀剪切所述毛球；和(b2)将剪切的毛球收集在试管中，然后离心分离。

在本发明的另一实施方案中，在步骤(b1)中剪切的毛球可以具有15μm至120μm的尺寸。

在本发明的另一实施方案中，所述离心分离可以在2,200rpm下进行5分钟。

在本发明的另一实施方案中，步骤(C)的传代可以包括以下步骤：(c1)根据细胞计数确定用来传代的培养皿，然后从培养皿中弃去培养基，然后用PBS洗涤；(c2)用0.25％的胰蛋白酶/EDTA处理细胞，随后在37℃、5％的CO

在本发明的另一实施方案中，所述传代可以包括将步骤(c1)至步骤(c5)重复三次。

下文中，将参照具体实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，并且对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的范围不应理解为受这些实施例的限制。

用MEMα培养基填充灭菌的90mm皮氏培养皿，使得从受试者收集的头皮组织(从表皮到真皮层)被浸没。接下来，使用MEMα培养基在90mm皮氏培养皿的盖子上形成多个液滴，并且使用显微外科剪刀和镊子将真皮的毛球逐个分离并移动到制备的液滴上。然后，在体视显微镜下观察移动到液滴上的毛球的同时，使用26-G注射器和显微外科镊子从毛球的末端去除脂肪组织和毛干，从而将毛球从头皮组织中分离出来。

为了选择从毛球中分离真皮毛乳头细胞的最佳方法，进行了下面的对比实验。

首先，分离方法1是如下方法：将1ml的解剖培养基置于35mm细胞培养皿中，在其中放置约50个毛球，使用精密显微剪刀剪切毛球，并将剪切的毛球收集在试管中，然后在2,200rpm下离心分离5分钟。

接下来，分离方法2是如下方法：将0.025％的I型胶原酶试剂加入到包含约50个毛球的35mm细胞培养皿中，然后在37℃的振动培育箱中培养2小时30分钟，并且将毛球收集在试管中，然后在2,200rpm下离心分离5分钟。

为了比较分离方法1和分离方法2的结果，轻拍各个颗粒物，用2ml的具有下表1所示组成的附着培养基(attachment medium)充分的移液，接种在35mm细胞培养皿中，并在37℃、5％的CO

[表1]

作为对比实验的结果，可以确认，与使用0.025％的I型胶原酶试剂的分离方法2相比，仅进行剪切而对毛球本身不进行任何其他处理的分离方法1的细胞尺寸更小且更均匀，并且细胞产量更高。

传代0和传代1如下进行。首先，根据在35mm细胞培养皿中收集的细胞数量确定用来传代的培养皿，然后从35mm细胞培养皿中弃去培养基，然后用PBS洗涤一次。接下来，使用0.25％的胰蛋白酶/EDTA处理细胞，并在37℃、5％的CO

[表2]

在细胞计数之后，将细胞以1,500个细胞/cm

接下来，传代1至传代4以与上述相同的方式进行。细胞在根据细胞计数确定的培养皿中传代至传代4。每次传代之后将细胞冷冻并解冻，然后以3,000个细胞/cm

根据于真皮毛乳头细胞分离方法和培养基组成的扩增的结果示于图2中。在图2中，案例1示出了通过剪切从毛球中分离真皮毛乳头细胞之后在扩增培养基1中扩增的结果；案例2示出了通过剪切从毛球中分离真皮毛乳头细胞之后在扩增培养基2中扩增的结果；案例3示出了通过用0.025％的I型胶原酶试剂处理从毛球中分离出的真皮毛乳头细胞之后在扩增培养基1中扩增的结果，案例4示出了通过用0.025％的I型胶原酶试剂处理从毛球中分离出的真皮毛乳头细胞之后在扩增培养基2中扩增的结果。作为对每种案例中细胞的形态的分析的结果，可以确认，在通过剪切从毛球中分离出的真皮毛乳头细胞之后使用扩增培养基2的案例2中，细胞的形态得到了很好的保持，并且真皮毛乳头细胞的扩增速率显著提高。

此外，在每个案例中，根据各个传代的扩增的细胞尺寸的变化示于下面表3中。

[表3]

参照上面的表3，案例2中的细胞尺寸最小并且保持在均匀的水平，而在除了案例1之外的其他组中，随着传代数的增加，细胞尺寸趋于增加。此外，在案例2中，P1至P4的细胞尺寸保持而没有显著变化，表明细胞的产量也会高。细胞产量的测量结果如图3中所示。参照图3，可以确认，在该案例中所有传代中的细胞产量最高，特别地，在P3收集到最多的细胞数量。

接下来，每个案例的每个传代中涉及真皮毛乳头细胞的生长因子的分泌水平如图4中所示。根据图4，作为测量已知为真皮毛乳头细胞生长因子的各种生长因子的分泌水平的结果，包括通过刺激人真皮毛乳头细胞促进上皮毛囊细胞的增殖的HGF、通过参与血管舒张来诱导毛发生长的VEGF、和促进毛囊组织生长的FGF(KGF)，可以确认，在这些案例中，案例2中的P3中分泌最大量的生长因子。

基于上述实验结果，进行实验以确定最佳剪切范围。首先，将从头皮组织中冲出的毛球收集在填充有PBS或基础培养基的皮氏培养皿中，将1ml的解剖培养基和毛球置于35mm的细胞培养皿中，并用精密显微剪刀将毛球剪切，然后在显微镜下观察根据剪切程度的毛球尺寸的变化。作为根据剪切阶段测量毛球尺寸的结果，可以确认，剪切前毛球尺寸为750μm至900μm，剪切阶段1为490μm至630μm，剪切阶段2为300μm至410μm，剪切阶段3为180μm至260μm，剪切阶段4为15μm至120μm(图5)。

之后，将剪切的毛球收集在试管中并在2,200rpm下离心分离5分钟，弃去上清液并收集颗粒物。将1ml的附着培养基置于35mm细胞培养皿中，在37℃、5％的CO

参照图6，作为在剪切范围内总共四个阶段中检查细胞扩增和附着形态的结果，可以确认，细胞附着形态根据剪切程度的不同而不同。图6的左侧示出了剪切后第3天的细胞的照片，右侧示出了剪切后第5天的细胞的照片。作为培养第3天观察的结果，可以确认，当剪切阶段低时，发生了细胞不均匀附着在细胞培养皿的底面上并以聚集状态生长的现象。另一方面，随着剪切阶段的增加，细胞在以规律的间隔附着在细胞培养皿的底面上的同时生长，并且以具有尖头的纺锤形式生长。此外，作为培养第5天观察的结果，可以确认，当剪切阶段低时，在细胞以聚集状态生长的区域和细胞未聚集的区域之间存在显著不同的细胞扩增，并且细胞倾向于在某些地方扩散和生长；然而，随着剪切阶段的增加，细胞均匀地分布在细胞培养皿的整个底面上。

此外，根据剪切阶段，细胞产量存在差异，如下面表4中所示。

[表4]

参照上面的表4，可以确认，根据剪切程度，不仅在细胞附着形态上有差异，而且在细胞产量上也有差异。可以认为，细胞在细胞培养皿上的附着的形态根据剪切程度而变化，并且细胞之间的间距和细胞扩增的模式对产量有很大影响。在剪切阶段1和剪切阶段2中，细胞以群落形式生长，因此，细胞倾向于扩散和生长，导致细胞产量为1.0E+05至1.3E+05。在剪切阶段3中，细胞聚集少于剪切阶段1和剪切阶段2，但是由于轻微聚集，在初始附着的过程中观察到细胞扩散。在剪切阶段4中，细胞从一开始就以单一状态良好地附着，没有观察到细胞的扩散或聚集，并且随着培养天数的增加，细胞均匀地附着在细胞培养皿的整个底部并生长，结果，该细胞产量是剪切阶段1的两倍左右。然而，当毛球被剪切至尺寸小于15μm时，存在的问题是，毛球内部的真皮毛乳头细胞受损，导致细胞产量显著下降。当毛球被剪切至尺寸大于120μm时，如上述实验所确认的，存在的问题是，发生细胞聚集并且细胞未均匀分布在培养皿的整个底部，导致细胞生长显著下降。这被认为是因为在聚集的细胞中的营养吸收比在均匀分布的细胞中的低，并且由于细胞密度增加，聚集的细胞中的外部压力增加。