一种RARG基因敲减稳转细胞株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及医学分子生物学技术领域，具体来说，涉及一种RARG基因敲减稳转细胞株及其构建方法与应用。

背景技术

卵巢癌是全球第三大常见的妇科恶性肿瘤，其致死率居妇科恶性肿瘤之首。2020年，全球有31万余卵巢癌确诊病例，死于卵巢癌者超过20万。随着饮食模式变化、育龄延迟和产次下降等潜在危险因素不断增加，卵巢癌防治成为我国的公共卫生问题，研究显示，中国卵巢癌年发病率和死亡率分别居女性生殖系统肿瘤第3位和第1位，中国卵巢癌的发病率在过去10年间增长了30％。

中国卵巢癌死亡率的持续增长可能主要是由于缺乏经济有效的筛查策略。卵巢癌高死亡率的主要因素之一就是缺乏有效的筛查策略，患者早期无明显的临床症状，70％以上的卵巢癌患者就诊时已为晚期，加之晚期生存率不高，故死亡率高。目前国内外尚无行之有效的筛查方法可降低卵巢癌的死亡率。卵巢癌标准治疗以手术治疗为主，辅以化学治疗、放射治疗及免疫治疗等。尽管化疗治疗卵巢癌的短期效果明显，但一部分患者在经过多次化疗后，对药物的敏感性降低，产生耐药性从而无法达到满意治疗的效果。早诊困难和化疗耐药是导致晚期卵巢癌预后差的主要原因。因此针对这一现状，需要开发新的针对卵巢癌患者的治疗策略，亟需靶向治疗、免疫治疗及其相关联合治疗等替代治疗方式的革新。靶向治疗是指利用单克隆抗体或小分子化合物对肿瘤细胞的分子靶点进行特异性干扰以达到抗肿瘤目的，主要包括抗血管生成治疗、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribosepolymerase,PARP)抑制剂治疗及免疫检查点抑制剂治疗等。目前抗血管生成治疗存在不可避免的副作用，包括高血压、贫血、血小板减少等血液学毒性。因此，发现新的卵巢癌治疗靶点是临床中亟待解决的科学问题。

在前期工作中，我们联合TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的转录组数据和ICGC(International Cancer Genome Consortium)数据库中的卵巢癌组织数据分析发现，目前，我们前期通过生物信息学对TCGA数据库进行数据分析，发现与卵巢正常组织相比，RARG基因在卵巢癌中的mRNA表达量高(P<0.05)，且其表达量与卵巢癌分期有关，晚期卵巢癌的RARG mRNA表达量明显高于早期(P<0.05)。进一步，我们选择了3个卵巢癌组织和3个配对的正常卵巢组织进行免疫组化IHC实验，发现相比于正常卵巢组织，卵巢癌组织中显著高表达RARG，差异具有统计学意义(P<0.001)。

关于RARG的研究由来已久，最近几年越来越多的研究显示RARG与肿瘤的发生发展密切相关。然而，目前的研究结果表明RARG在不同的肿瘤中扮演着不同的角色，可能是抑癌基因，也可能是癌基因。一方面，RARG可能作为癌基因促进肿瘤细胞的增殖和迁移。例如，在胆管癌中RARG过表达能够激活Akt/NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路，从而增强癌细胞的增殖和迁移能力。同样，RARG在肝癌组织中表达升高，RARG表达上调能够激活PI3K/Akt信号通路和NF-κB信号通路，增加癌细胞的恶性程度。另一方面，RARG也被报道为抑制癌细胞增殖和侵袭的肿瘤抑制因子。例如，RARG通过调节碳水化合物转移酶10的表达，可以抑制黑色素瘤的侵袭能力。RARG在结直肠癌组织中表达降低，揭示了RARG可以作为抑癌基因，通过抑制Hippo-Yap信号通路调节结直肠肿瘤的发生和转移。

基于此，本发明利用特定干扰序列，通过重组慢病毒的方法敲除卵巢癌细胞中RARG基因的表达，构建了稳转细胞株。本发明获得RARG基因稳定敲除的卵巢癌细胞能够用于制备动物模型、研发药物以及基因治疗，为RARG基因的功能研究提供平台，同时也为后续的基因治疗方法提供充足的理论依据。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种RARG基因敲减稳转细胞株及其构建方法与应用，能够克服现有技术的上述不足。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种RARG基因敲减稳转细胞株的构建方法，该方法包括：运用慢病毒表达载体和包装质粒在细胞中构建RARG稳定干扰细胞株，经过抗生素抗性筛选后建立可诱导干扰RARG的稳转细胞株。

进一步地，所述细胞株为A2780细胞或SKOV3细胞。

进一步地，所述慢病毒表达载体为pLKO.1-RARG。

根据本发明的另一方面，提供了一种由所述构建方法得到的RARG基因敲减稳转细胞株。

本发明还提供了所述RARG基因敲减稳转细胞株在建立卵巢癌动物模型及制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种可以有效抑制卵巢癌克隆能力和增殖能力的分子标志物，该标志物有以下特征：在卵巢癌组织中高表达，而在正常卵巢组织中不表达，高表达的卵巢癌患者，其术后生存期短。本发明构建的RARG基因敲减稳定转染细胞株对进一步探索卵巢癌新型靶点具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A是卵巢癌组织与卵巢正常组织中的RARG mRNA表达量对比图；

图1B是晚期卵巢癌(III-IV期)组织与早期卵巢癌(I-II期)组织中的RARG mRNA表达量对比图；

图1C是RARG的mRNA低表达组与高表达组的生存曲线；

图1D是ROC曲线；

图1E是单因素和多因素Cox分析结果之一；

图1F是单因素和多因素Cox分析结果之二；

图1G是RARG的DNA拷贝数变异分析结果；

图2是卵巢癌组织与卵巢正常组织中RARG的mRNA表达水平对比图；

图3是A2780细胞RARG-sh组与Non-silence组的蛋白表达量对比图；

图4是A2780细胞RARG-sh组与Non-silence组的细胞克隆数量对比图；

图5是A2780细胞RARG-sh组与Non-silence组的增殖生长对比图；

图6A是A2780细胞RARG-sh组与Non-silence组的移植瘤增长速度对比图；

图6B是A2780细胞RARG-sh组与Non-silence组的瘤重对比图；

图7是SKOV3细胞RARG-sh组与Non-silence组的蛋白表达量对比图；

图8是SKOV3细胞RARG-sh组与Non-silence组的细胞克隆数量对比图；

图9是SKOV3细胞RARG-sh组与Non-silence组的增殖生长对比图；

图10是免疫组化化学检测结果；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明经过生物信息学统计分析，发现RARG mRNA表达量与卵巢癌患者的分期晚、预后不良显著正相关，同时发现RARG可能具有预测卵巢癌病程进展风险的价值。基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的转录组数据和ICGC(International CancerGenome Consortium)数据库中的卵巢癌组织数据信息，发现卵巢癌组织中的RARG mRNA表达量明显高于卵巢正常组织，且具有统计学意义(如图1A所示)。晚期卵巢癌(III-IV期)组织中的RARG mRNA表达量明显高于早期卵巢癌(I-II期)(如图1B所示)。

RARG的mRNA水平与预后相关。绘制KM生存曲线发现，与低表达组相比，高表达组具有更差的预后(如图1C所示)。ROC曲线提示RARG分别预测1年，5年，9年总生存率的AUC值，介于0.6-0.7之间，预测效果良好(如图1D所示)。单因素和多因素Cox分析提示，年龄大和RARG高表达是卵巢癌患者预后不良的独立危险因素(如图1E和图1F所示)。通过ci Bio Portal数据库在线分析OC组织中RARG的DNA拷贝数变异，发现其扩增频率为0.75％，突变频率为0.75％(如图1G所示)。

此外，本发明对RARG进行相关性分析发现，RARG参与A)SP1；(B)STAT6；(C)R3HDM2；(D)HDAC7；(E)ATF7；(F)MBD6等转录因子的调控过程，P<0.001。A)SP1；(B)STAT6；(C)R3HDM2；(D)HDAC7这四个转录因子中，相关系数r>0.5，这说明其与RARG有较高的正相关性。

进一步利用GSEA富集分析寻找与RARG正相关及负相关的信号通路，发现正相关信号通路中有许多经典的通路，比如P13K-AKT、cAMP信号传导通路。

肿瘤组织不是单纯的只包含肿瘤细胞，它是由各种不同类型的细胞组成的，其中就包含基质细胞、成纤维细胞、免疫细胞等，这些细胞就构成了肿瘤的微环境。RARG高表达组中的T cell CD4 memory activated和Neutrophills的比例明显高于低表达组，且存在统计学差异。

在前期研究中发现，高龄和RARG高表达是患者预后不良的独立危险因素，因此本发明进一步利用这两个因素建立nomogram模型。并且发现该模型的校正曲线具有良好的拟合效果。

RARG引物信息及所需试剂如表1所示：

表1 RARG引物信息及所需试剂

本发明选取中国医学科学院肿瘤医院妇瘤科标本库中具有完整临床随访信息的卵巢癌组织和正常卵巢组织石蜡标本各3个，进行qPCR实验，发现与正常组织相比，卵巢癌组织中RARG的mRNA表达水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)(如图2所示)。

实施例1

运用慢病毒表达载体(pLKO.1-RARG)和包装质粒在A2780细胞中构建RARG稳定干扰细胞株，经过抗生素抗性筛选后建立可诱导干扰RARG的稳定细胞株，标记为RARG-shRNA。将感染空载体获得的稳定细胞株标记为Non-silence。进一步利用WB实验发现与Non-silence组相比，RARG-sh组的蛋白表达量明显降低(如图3所示)。

应用平板克隆形成实验对瞬时敲降RARG后A2780细胞的克隆能力进行研究分析，发现与正常对照组的细胞比较，敲降组形成的细胞克隆数量明显下降，具有统计学差异(如图4所示)。此外，进一步通过CCK8法测定瞬时敲降RARG对A2780细胞活力的影响，发现敲降组的细胞增殖能力受到明显的抑制。这说明瞬时敲降RARG能够明显抑制单个卵巢癌细胞形成细胞集落，降低其克隆形成能力从而抑制肿瘤的增殖生长(如图5所示)。

将0.2ml含有600万个稳定转染的A2780细胞Non-silence和RARG-sh两组，接种于裸鼠的双侧腋窝皮下建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型。观测移植瘤生长情况，每隔3天测量移植瘤的短径、长径和体重，4周后处死裸鼠。称瘤重比较RARG干扰组(RARG-shRNA)和空载(Non-silence)组之间的移植瘤生长的差异，发现与NC-shRNA相比，RARG-shRNA组的移植瘤增长速度(如图6A所示)和处死时的瘤重降低(如图6B所示)。

实施例2

运用慢病毒表达载体(pLKO.1-RARG)和包装质粒在SKOV3细胞中构建RARG稳定干扰细胞株，经过抗生素抗性筛选后建立可诱导干扰RARG的稳定细胞株，标记为RARG-shRNA。将感染空载体获得的稳定细胞株标记为Non-silence。进一步利用WB实验发现与Non-silence组相比，RARG-sh组的蛋白表达量明显降低(如图7所示)。

应用平板克隆形成实验对瞬时敲降RARG后SKOV3细胞的克隆能力进行研究分析，发现与正常对照组的细胞比较，敲降组形成的细胞克隆数量明显下降，具有统计学差异(如图8所示)。此外，进一步通过CCK8法测定瞬时敲降RARG对SKOV3细胞活力的影响，发现敲降组的细胞增殖能力受到明显的抑制。这说明瞬时敲降RARG能够明显抑制单个卵巢癌细胞形成细胞集落，降低其克隆形成能力从而抑制肿瘤的增殖生长(如图9所示)。

实施例3

回顾性研究：将3例具有完整临床病理资料及预后信息的经手术病理诊断为卵巢癌肿瘤标本及正常卵巢上皮标本，制备成组织大片，用免疫组化的方法检测RARG蛋白表达水平。图10为代表性的免疫组化化学检测结果。

在本发明中，RARG抗体购自于武汉亚科因生物技术有限公司，制备样本方法、免疫组化方法和评分标准如下：(1)制备样本：组织芯片：卵巢癌组织用10％中性福尔马林固定48h后分别用石蜡包埋，切片。(2)免疫组织化学：组织芯片65℃烤片30min，二甲苯脱蜡l0min×3次，100％、85％、75％乙醇各3min，PBS 5min×2次，H

综上所述，借助于本发明的上述技术方案，运用慢病毒表达载体和包装质粒在细胞中构建RARG稳定干扰细胞株，经过抗生素抗性筛选后建立可诱导干扰RARG的稳转细胞株。本发明构建的RARG基因敲减稳定转染细胞株对进一步探索卵巢癌新型靶点具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。