一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法与应用

技术领域

本申请涉及生物检测技术领域，具体涉及一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

背景技术

狂犬病是一种由狂犬病毒引起的发病率极高的人畜共患疾病，目前预防狂犬病的最有效措施是接种狂犬疫苗。当人体接种狂犬疫苗后，人体血液中会出现狂犬病毒抗体，这些抗体可防止狂犬病毒在细胞间直接传播，减少狂犬病毒的增殖量，同时还能清除游离的狂犬病毒，阻止狂犬病毒的繁殖和扩散，从而达到预防狂犬病的目的。

目前我国对狂犬疫苗的纯度虽然没有明确的规定，但研究发现，狂犬疫苗的纯度与临床的不良反应存在密切关系，狂犬疫苗的纯度越高，不良反应发生的概率相对越小。然而目前并没有对狂犬疫苗产品纯度的标准检测方法。因此，为了避免低纯度的狂犬疫苗产品对临床应用带来不良反应，对狂犬疫苗产品的纯度进行快速、准确地检测是必不可少的环节。

发明内容

为了快速、准确地检测狂犬疫苗纯度，本申请提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

第一方面，本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法，采用如下的技术方案：

一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法，包括：配制样品溶液、采用SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度；所述SEC-HPLC法采用的色谱柱为TSK-gel凝胶色谱柱；流动相为磷酸盐缓冲溶液。

本申请提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法，该方法只需要将狂犬疫苗稀释至一定浓度，然后以磷酸盐缓冲溶液为流动相、并采用TSK-gel凝胶色谱柱对狂犬疫苗样品溶液进行检测，即可获得狂犬疫苗的纯度，该方法具有操作简单、重现性好、精密度高等优点。

优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2-8.0，浓度为0.08-0.12mol/L。

本申请将磷酸盐缓冲溶液的pH与浓度控制在上述范围内，能够有效防止样品溶液中目标检测物(灭活的狂犬病病毒蛋白)的解离，便于样品溶液中物质间的有效分离，使得获得的高效液相色谱图的峰形更好，狂犬疫苗纯度的检测结果更加准确、真实。

在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH可以为7.2-7.8或7.8-8.0。

在一个具体的实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH还可以为7.2、7.8或8.0。

在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度可以为0.05-0.08mol/L、0.08-0.1mol/L、0.05-0.12mol/L、0.05-0.15mol/L、0.08-0.1mol/L、0.08-0.12mol/L、0.08-0.15mol/L、0.1-0.12mol/L、0.1-0.15mol/L或0.12-0.15mol/L。

在一个具体的实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度还可以为0.05mol/L、0.08mol/L、0.1mol/L、0.12mol/L或0.15mol/L。

优选地，所述SEC-HPLC法中，检测波长为278-282nm。

本申请将SEC-HPLC法中的检测波长控制在以上范围内，目标检测物则具有较大吸收，检测的精密度更高，获得的高效液相色谱图的目标检测物峰面积的RSD值＜2％，保留时间的RSD值＜0.1％。

在一些实施方案中，所述检测波长可以为278-280nm或280-282nm。

在一个具体的实施方案中，所述检测波长还可以为278nm、280nm或282nm。

优选地，所述SEC-HPLC法中，流速为0.4-0.6mL/min，进样量为18-22μL，柱温为28-30℃。

本申请中，流速、进样量及柱温均会影响待测样品的保留时间，通过对流速、进样量及柱温的调整，并将其控制在上述范围内，能够有效避免多个检测物的峰叠加为一个峰，进而使高效液相色谱图中目标检测物的出峰时间适宜、峰形良好、各峰之间的分离度好，保证检测结果的真实性与可靠性，从而获得准确的狂犬疫苗纯度。

优选地，所述样品溶液的浓度为10-400μg/mL。

进一步优选地，所述样品溶液的浓度为150-250μg/mL。

本申请中，当样品溶液的浓度过高时，容易导致色谱柱堵塞，损伤检测设备；当样品溶液的浓度过低时，目标检测物的紫外光吸收太弱，易导致检测结果不准确。因此，本申请将样品溶液的浓度控制在上述范围内，既能保证检测顺利进行，又能使高效液相色谱图中目标检测物的色谱峰高和峰面积适宜，从而可获得更加准确的检测结果。

在一些实施方案中，所述样品溶液的浓度还可以为10-150μg/mL、10-200μg/mL、10-250μg/mL、150-200μg/mL、150-250μg/mL或200-250μg/mL。

在一个具体的实施方案中，所述样品溶液的浓度还可以为10μg/mL、12μg/mL、150μg/mL、200μg/mL或250μg/mL。

优选地，所述SEC-HPLC法中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.8、浓度为0.1mol/L，检测波长为280nm，流速为0.5mL/min，进样量为20μL，柱温为30℃。

本申请将SEC-HPLC法中的参数的设定为上述值，检测的精密度更高，获得的高效液相色谱图的峰面积的RSD值与保留时间的RSD值更小，且高效液相色谱图中的峰形更好、峰高适宜、分离度更佳。

优选地，所述TSK-gel凝胶色谱柱为TSK-gel G6000PW

本申请中，进一步采用TSK-gel G6000PW

进一步优选地，所述TSK-gel G6000PW

在一个具体的实施方案中，所述TSK-gel G6000PW

本申请中，狂犬病病毒为核糖核酸型弹状病毒，一端圆凸，一端平凹，形如子弹，直径65-80nm，长约130～240nm，故采用孔径为13μm的TSK-gel G6000PWXL色谱柱进行纯度检测。

优选地，所述SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法的检测限为4μg/mL，定量限为10μg/mL。

本申请中，为了保证待测样品的信号强度S明显区别于噪音强度N，将液相色谱分析仪器的信噪比(S/N)≥3dB设定为检测限，故本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法的检测限为4μg/mL；为了保证待测样品中的目标检测物能够被定量检测，即保证检测的准确度，将液相色谱分析仪器的信噪比≥10dB，且目标检测物峰面积RSD＜2％设定为定量限，故本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法的定量限为10μg/mL。因此，本申请将狂犬疫苗的浓度稀释至10μg/mL以上，即可定量检测狂犬疫苗的纯度，且检测的精密度高。

第二方面，本申请提供SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法在Vero细胞基质狂犬疫苗、人二倍体细胞基质狂犬疫苗中的应用。

本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法能够检测Vero细胞基质狂犬疫苗及人二倍体细胞基质狂犬疫苗的纯度，且该检测方法具有操作简单、灵敏度高、准确性强、易于标准化操作的优点。

本申请中，由于狂犬疫苗成品(Vero细胞基质狂犬疫苗和人二倍体细胞基质狂犬疫苗)中含有制剂辅料和保护剂等物质，而该类物质对狂犬疫苗纯度检测存在一定干扰，因此对于狂犬疫苗纯度的检测是在狂犬疫苗原液这一步进行的。故本申请中，检测Vero细胞基质狂犬疫苗的纯度即检测Vero细胞基质狂犬疫苗原液的纯度；检测人二倍体细胞基质狂犬疫苗的纯度即检测人二倍体细胞基质狂犬疫苗原液的纯度；

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1.本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法能够检测狂犬疫苗的纯度，且具有操作简单、重现性好、精密度高等优点；进一步将SEC-HPLC法中的检测波长控制在278-282nm之间，磷酸盐缓冲溶液的pH控制在7.2-8.0之间，浓度控制在0.08-0.12mol/L之间，获得的检测方法的精密度更高，所得高效液相色谱图的峰面积的RSD值＜2％，保留时间的RSD值＜0.1％，且高效液相色谱图的峰形良好、峰高适宜，从而能够获得真实、准确的狂犬疫苗纯度。

2.本申请选用TSK-gel G6000PW

3.本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法中，将检测限设定为4μg/mL，能够保证待测样品的信号强度S明显区别于噪音强度N；将定量限设定为10μg/mL，能够使待测样品中的目标检测物被定量检测，进而确保检测的准确度。

附图说明

图1是实施例1提供的检测方法检测获得的磷酸盐缓冲溶液(空白溶剂)的高效液相色谱图。

图2是实施例1提供的检测方法检测获得的冻干人用狂犬病疫苗原液(参比品)的高效液相色谱图。

图3是实施例1提供的检测方法检测获得的Vero细胞基质狂犬疫苗原液的高效液相色谱图。

图4是实施例1提供的检测方法检测获得的人二倍体细胞基质狂犬疫苗原液的高效液相色谱图。

图5是对比例1提供的检测方法检测获得的Vero细胞基质狂犬疫苗原液的高效液相色谱图。

图6是对比例2提供的检测方法检测获得的Vero细胞基质狂犬疫苗原液的高效液相色谱图。

具体实施方式

本申请提供一种狂犬疫苗纯度的检测方法，该狂犬疫苗为Vero细胞基质狂犬疫苗或人二倍体细胞基质狂犬疫苗。

上述狂犬疫苗纯度的检测方法，具体包括以下步骤：

(1)配制样品溶液：将狂犬疫苗原液配制成一定浓度的样品溶液；

(2)采用SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度：采用TSK-gel凝胶色谱柱对样品溶液进行检测；检测条件为：流动相为磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.08-0.12mol/L，pH为7.2-8.0；检测波长为278-282nm；流速为0.4-0.6mL/min；进样量为18-22μL；柱温为28-30℃。

进一步地，TSK-gel凝胶色谱柱为TSK-gel G6000PW

本申请中，狂犬疫苗原液可以为Vero细胞基质狂犬疫苗原液和人二倍体细胞基质狂犬疫苗原液，均来源于辽宁成大生物股份有限公司；TSK-gel G6000PW

以下结合和实施例、检测试验及附图说明对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1

实施例1提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法，具体包括以下步骤：

(1)配制样品溶液：用浓度为0.1mol/L、pH为7.8的磷酸盐缓冲溶液将Vero细胞基质狂犬疫苗原液或人二倍体细胞基质狂犬疫苗原液配制成浓度为200μg/mL的样品溶液；

(2)采用SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度：采用TSK-gel G6000PW

实施例2-5

实施例2-5分别提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例2-5中磷酸盐缓冲溶液的浓度，具体如表1所示。

表1实施例2-5中的磷酸盐缓冲溶液浓度

实施例6

实施例6提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例6中磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2。

实施例7

实施例7提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例7中磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0。

实施例8

实施例8提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例8中检测波长为275nm。

实施例9

实施例9提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例9中检测波长为278nm。

实施例10

实施例10提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例10中检测波长为282nm。

实施例11

实施例11提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例11中的检测波长为285nm。

实施例12

实施例12提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例12中样品溶液的浓度为3μg/mL。

实施例13

实施例13提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例13中样品溶液的浓度为4μg/mL。

实施例14

实施例14提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例14中样品溶液的浓度为8μg/mL。

实施例15

实施例15提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例15中样品溶液的浓度为10μg/mL。

实施例16

实施例16提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例16中样品溶液的浓度为12μg/mL。

实施例17

实施例17提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例17中样品溶液的浓度为150μg/mL。

实施例18

实施例18提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例18中样品溶液的浓度为250μg/mL。

对比例

对比例1

对比例1提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述对比例与实施例1的不同之处在于：对比例1采用的色谱柱为TSK-gelG5000PW(规格为7.5mm×30mm，17μm)

对比例2

对比例2提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述对比例与实施例1的不同之处在于：对比例2采用的色谱柱为Kromasil C18色谱柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)

对比例3

对比例3提供一种SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法。

上述对比例与实施例1的不同之处在于：对比例3采用的流动相为pH为6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液。

检测结果

利用本申请实施例1提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法对冻干人用狂犬病疫苗原液(参比品)、Vero细胞基质狂犬疫苗原液(3个批次)及人二倍体细胞基质狂犬疫苗原液进行检测，然后根据高效液相色谱图获取目标检测物峰面积、杂质峰面积及保留时间，并采用面积归一法计算上述狂犬疫苗的纯度，结果如表2所示。

表2实施例1提供的检测方法对参比品及2种狂犬疫苗的检测结果

由上表可以看出，以冻干人用狂犬病疫苗原液作为参比品，在同一检测条件下，冻干人用狂犬病疫苗原液(参比品)、Vero细胞基质狂犬疫苗原液与人二倍体细胞基质狂犬疫苗原液的保留时间基本相同，说明上述三种样品目标检测物为同一物质。进一步地，冻干人用狂犬病疫苗原液(参比品)的纯度为99.27％，3个批次Vero细胞基质狂犬疫苗原液的纯度分别为97.81％、97.85％、97.90％，人二倍体细胞基质狂犬疫苗原液的纯度为98.06％，上述纯度的狂犬疫苗均符合国内外行业标准。因此，说明本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法能够用于检测Vero细胞基质狂犬疫苗与人二倍体细胞基质狂犬疫苗的纯度，并且检测速度快、准确性高。

检测准确性及精密度

利用实施例1-11、实施例17-18、对比例1-3提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法对同一批次的Vero细胞基质狂犬疫苗原液进行检测，每种方法重复检测3次。然后根据高效液相色谱图获取目标检测物峰面积、杂质峰面积及保留时间，并取3次检测的平均值；计算3次检测的峰面积的RSD值与保留时间的RSD值，并采用面积归一法计算上述狂犬疫苗的纯度，结果如表3所示。

表3利用实施例1-11、实施例17-18、对比例1-3提供的方法检测获得的结果

根据表3的检测结果可知，对比例1采用TSK-gel G5000PW色谱柱检测获得的高效液相色谱图的杂质峰面积较大，且目标检测物峰与杂质峰无法有效分离，故无法准确计算出狂犬疫苗的纯度；对比例2采用的Kromasil C18色谱柱获得的高效液相色谱图中，目标检测物峰与杂质峰无法有效分离，故无法准确计算出狂犬疫苗的纯度。对比例3采用pH为6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液作为流动相，因其pH值对狂犬病毒蛋白不适用，导致目标物色谱峰面积较小，杂质峰面积较大，样品降低至90％左右，而且RSD＞8％，不适用于纯度检测。而本申请实施例1-11提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法均能够快速、准确地实现对Vero细胞基质狂犬疫苗的检测，并且利用该检测方法获得的高效液相色谱图的峰形良好、峰高适宜、目标检测物峰与杂质峰的分离效果明显，进而通过面积归一法即可准确计算出狂犬疫苗的纯度。

根据实施例1-5的检测结果可知，实施例2和实施例5获得的高效液相色谱图的目标检测物峰面积RSD值均＞1％，目标检测物峰面积均＜1900000mAu，杂质峰面积＞6000mAu；而实施例1、实施例3-4获得的高效液相色谱图的目标检测物峰面积均＞1900000mAu，RSD值＜1％，且杂质峰面积＜50000mAu。因此，本申请将SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法中，磷酸盐缓冲溶液的浓度控制在0.08-0.12mol/L之间，检测方法的精密度更高，获得的狂犬疫苗的纯度检测结果更准确。

根据实施例1、实施例6-7的检测结果可知，本申请将SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法中，磷酸盐缓冲溶液的pH控制在7.2-8.0之间，能够获得准确、真实的检测结果。

根据实施例1、实施例8-11的检测结果可知，实施例8与实施例11获得的高效液相色谱图的目标检测物峰面积RSD值分别为1.08％和1.25％；而实施例1、实施例9-10获得的高效液相色谱图的目标检测物峰面积RSD值均＜1％。因此，说明本申请将检测波长控制在278-282nm之间，可以进一步提高检测方法的精密度，进而获得准确、真实的检测结果。

根据实施例1、实施例17-18的检测结果可知，实施例17与实施例18获得的高效液相色谱图的目标检测物峰面积RSD值均＜1％，样品纯度均＞97％。因此本申请将样品溶液的浓度控制在150-250μg/mL，能够获得准确、真实的检测结果。

检测限与定量限的测定

利用实施例1、实施例12-16提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法对冻干人用狂犬病疫苗原液进行检测，每种检测方法重复检测5次，取平均值，并统计检测过程中仪器的信噪比(S/N)和信噪比RSD值、检测谱图中的目标检测物峰面积和峰面积RSD值，结果如表4所示。

表4实施例1、实施例12-16提供的检测方法获得的信噪比与目标检测物峰面积

根据表4的检测结果可知，随着样品溶液浓度的增大，信噪比逐渐增大，峰面积也逐渐增大，信噪比RSD值与峰面积RSD值均逐渐减小，说明样品溶液对检测仪器的信噪比及检测结果的准确性存在影响。

通过对比发现，当样品溶液浓度3μg/mL时，仪器的信噪比＜3dB；当样品溶液浓度≥4μg/mL时，仪器的信噪比均≥3dB。因此，本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法的检测限为4μg/mL。

进一步对比发现，当样品溶液浓度为8μg/mL时，仪器的信噪比＜10dB，目标检测物峰面积RSD值＞2％；当样品溶液浓度≥10μg/mL时，仪器的信噪比均≥10dB，目标检测物峰面积RSD值＜2％，说明当样品溶液浓度≥10μg/mL时，SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法获得的检测结果更准确。因此，本申请提供的SEC-HPLC法检测狂犬疫苗纯度的方法的定量限为10μg/mL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。