AV3肽功能化的聚多巴胺纳米递送系统靶向CD71蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及AV3肽功能化的聚多巴胺纳米递送系统靶向CD71蛋白及其制备方法。

背景技术

由于胰腺癌早期诊断率低，预后效果不理想，因此胰腺癌被称为“癌症之王”。临床上对于大部分胰腺癌患者尤其是晚期患者会采取化疗药物进行治疗，但大剂量使用化疗药物对正常组织带来剂量限制性毒性；且由于胰腺肿瘤高间质密度，进而降低了化疗药物进入肿瘤组织的有效浓度低而达不到理想的治疗效果。

近年来研究发现采用纳米技术针对肿瘤组织药物递送成为了研究的热点，纳米载体具有延长循环时间、增强组织药物积累和促进协同递送的优点。此外，纳米颗粒光热治疗也被应用于肿瘤的治疗研究，光热治疗是指近红外光照射转换纳米材料将光能转换热能来杀死肿瘤细胞的治疗方法。

在此，我们设计了一种能够减少胰腺癌组织中间质成分，同时能够起到增强针对胰腺癌靶向给药化疗联合光热靶向治疗的纳米系统。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是，怎样提供一种能够减少胰腺癌组织中间质成分，同时起到增强针对胰腺癌靶向给药化疗联合光热靶向治疗的AV3肽功能化的聚多巴胺纳米递送系统靶向CD71蛋白及其制备方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种AV3肽功能化的聚多巴胺纳米递送系统靶向CD71蛋白，其特征在于，按重量份数包括聚多巴胺55至60份，紫杉醇35至40份，AV3多肽1至5份，NH2-PEG3400-Mal 1至5份，适配体(XQ-2d)1至5份。

作为优化，所述聚多巴胺的材料为盐酸多巴胺。

具体的，聚多巴胺的生产厂家为上海吉至生化科技有限公司，货号D34421，活性成分98％。

具体的，紫杉醇的生产厂家为北京索莱宝科技有限公司，货号SP8020，活性成分98％。

具体的，AV3多肽的生产厂家为中肽生化有限公司,货号995531，活性成分90％。

具体的，NH2-PEG3400-Mal的生产厂家为上海芃硕生物科技有限公司，货号PS2-NM-3K。

具体的，适配体(XQ-2d)的生产厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司。

本技术方案中还公开了一种AV3肽功能化的聚多巴胺纳米递送系统靶向CD71蛋白的制备方法，其特点在于：包括以下步骤：

a、将盐酸多巴胺通过室温搅拌反应合成了聚多巴胺(PDA)；

b、将紫杉醇(PTX)以π-π堆积方式负载到聚多巴胺(PDA)的表面，合成得到PDA/PTX；

c、将巯基(-SH)修饰的适配体XQ-2d通过中间连接物NH2-PEG3400-MAL连接到PDA/PTX纳米系统表面并形成PDA-XQ-2d/PTX靶向化疗-光热治疗的纳米系统；

d、通过Michael加成或Schiff碱反应将半胱氨酸(Cys)修饰的AV3肽共价连接到PDA上，形成AV3-PDA-XQ-2d/PTX纳米系统。

作为优化，在步骤a中，称取75mg的盐酸多巴胺溶于100mL Tris缓冲液中，在室温条件下以400r搅拌5h,随后以10500r离心10min，并清洗三次，最后溶于PBS中。

作为优化，在步骤b中，称取2mg PTX溶于2mL的DMSO中配成1mg/mL的紫杉醇溶液，将其与2mL的PDA溶液(2mg/mL)混合，在室温条件以500r搅拌24h，随后以11000r离心5min,并清洗三次，最后溶于PBS中得到PDA/PTX。

作为优化，在步骤c中，取20μL NH2-PEG3400-Mal(10mg/mL)溶液与5μL TCEP(0.5M)混合反应30min；随后将2OD XQ-2d适配体加入到PDA/PTX中，室温摇晃8h，再将PDA/PTX纳米颗粒0.2mg加入上述反应体系中，室温摇晃6h；以11000r离心5min，并清洗三次，最后溶于PBS中得到PDA-XQ-2d/PTX。

作为优化，在步骤d中，取1mg/mL的AV3多肽PBS溶液分别与1mg/mL的PDA-XQ-2d/PTX室温混合反应12h；随后，以11000r，5min离心，洗涤三次得到AV3-PDA-XQ-2d/PTX纳米系统。

综上所述，上述纳米系统所负载拟态药物AV3肽可结合ITGA5受体，抑制TGF-β活化的人胰腺星状细胞(hPSC)产生间质蛋白，进而减少胰腺肿瘤组织间质的产生，降低了间质屏障的阻碍，使纳米系统顺利进入胰腺肿瘤组织中。纳米颗粒通过适配体靶向识别作用，与胰腺癌细胞表面CD71靶向结合，胞吞进入在胰腺癌细胞中，在细胞内的低pH微环境条件下，紫杉醇被释放到胰腺癌细胞中，起到高效化疗作用。同时，在近红外光的照射下，PDA可将光能转化为热能，以提高局部组织温度，杀死肿瘤细胞，起到协同化疗的作用，进一步提升对于胰腺肿瘤的疗效。此外，该纳米系统通过一步法给药的方式，节省了给药成本。

附图说明

图1是纳米材料共定位PL45胰腺癌细胞时的图片。

图2是纳米材料共定位Panc-1胰腺癌细胞时的图片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，需注意的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方式构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

实施例，一种AV3肽功能化的聚多巴胺纳米递送系统靶向CD71蛋白，按重量份数包括聚多巴胺55至60份，紫杉醇35至40份，AV3多肽1至5份，NH2-PEG3400-Mal 1至5份，适配体(AP613-1)1至5份。

具体的，聚多巴胺的材料为盐酸多巴胺。

具体的，聚多巴胺的生产厂家为上海吉至生化科技有限公司，货号D34421，活性成分98％。

具体的，紫杉醇的生产厂家为北京索莱宝科技有限公司，货号SP8020，活性成分98％。

具体的，AV3多肽的生产厂家为中肽生化有限公司,货号995531，活性成分90％。

具体的，NH2-PEG3400-Mal的生产厂家为上海芃硕生物科技有限公司，货号PS2-NM-3K。

具体的，适配体(XQ-2d)的生产厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司。

具体配比如表格1所示：

表格1，

AV3肽功能化的聚多巴胺纳米递送系统靶向CD71蛋白的制备步骤：

(1)聚多巴胺(PDA)的合成：称取75mg的盐酸多巴胺溶于100mL Tris缓冲液中，在室温条件下以400r搅拌5h,随后以10500r离心10min，并清洗三次，最后溶于PBS中。

(2)紫杉醇(PTX)负载到聚多巴胺表面(即PDA/PTX的合成)：称取2mg PTX溶于2mL的DMSO中配成1mg/mL的紫杉醇溶液，将其与2mL的PDA溶液(2mg/mL)混合，在室温条件以500r搅拌24h，随后以11000r离心5min,并清洗三次，最后溶于PBS中得到PDA/PTX。

(3)适配体的连接(即PDA-XQ-2d/PTX的合成)：取20μL NH2-PEG3400-Mal(10mg/mL)溶液与5μL TCEP(0.5M)混合反应30min。随后将2OD XQ-2d适配体加入到上述反应体系中，室温摇晃8h，再将PDA/PTX纳米颗粒0.2mg加入上述反应体系中，室温摇晃6h。以11000r离心5min，并清洗三次，最后溶于PBS中得到PDA-XQ-2d/PTX。

(4)AV3多肽的连接(即AV3-PDA-XQ-2d/PTX的合成)：取1mg/mL的AV3多肽PBS溶液分别与1mg/mL的PDA-XQ-2d/PTX室温混合反应12h。随后，以11000r，5min离心，洗涤三次得到AV3-PDA-XQ-2d/PTX。

靶向胰腺癌细胞效果：

如图1和图2所示，结果描述：

(1)胰腺癌细胞中CD71蛋白表达高于正常人胰腺导管癌细胞hTERT-HPNE；

(2)适配体XQ-2d-Cy5.5进入胰腺癌细胞中量高于正常人胰腺导管癌细胞hTERT-HPNE；

(3)纳米材料SiO2-FITC@PDA-XQ-2d包吞进入胰腺癌细胞的含量明显高于SiO2-FITC@PDA，且通过荧光强度分析SiO2-FITC@PDA-XQ-2d组荧光强度高于SiO2-FITC@PDA。

结论：修饰适配体XQ-2d纳米系统可有效靶向高表达CD71蛋白的胰腺癌细胞。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。