水稻OsRGE3基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及水稻OsRGE3基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

水稻既是一种重要的模式植物，也是维护国家粮食安全不可或缺的农作物之一。根系作为水稻生长发育必不可少的营养器官，是水稻与土壤进行物质交换和信息交流的纽带，承载了众多生理生化功能，如固定植株、吸收水肥和运输储存养料等，间接地决定着诸多地上部产量、品质、抗逆等农艺性状的表现(吴伟明，程式华，2005；梁永书等，2016；Lianget al.,2011；Liang et al.,2013)。近年来，国家加大了对植物根系性状的研究。利用现代分子生物学理论与技术体系筛选、鉴定优良水稻根系基因资源，对优化改良水稻根系性状从而提高水稻产量具有十分重要的意义。

泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system,UPS)是植物蛋白质修饰最重要的调控机制之一，其介导了真核生物中80％-85％的蛋白质降解，几乎参与植物生长发育的各个环节，是植物体内蛋白高效专一降解最重要、最精细的调控机制之一(Smalle andVierstra,2004；Vierstra,2009；Santner and Estelle,2010)。在UPS途径中，泛素化过程主要涉及3种泛素化酶：泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme,E2)和泛素连接酶(Ubiquitin-ligating enzyme,E3)。E1是泛素化过程中的第一个关键酶，也是泛素化的起点，负责激活泛素(Ubiquitin,Ub)分子并将激活的Ub分子传递到E2上(Schulman and Harper,2009)；E2负责将Ub分子通过E3转移到靶蛋白上(Ye and Rape,2009)；E3作为负责识别靶蛋白，决定了泛素蛋白与底物结合的特异性。研究表明,E3泛素连接酶涉及对光形态建成、激素信号转导、非生物胁迫、免疫防御等多个植物生长发育过程的调控。然而，相对于拟南芥和水稻中众多的E3泛素连接酶成员而言，绝大多数E3泛素连接酶的功能，特别是E3泛素连接酶在水稻根系生长发育调控中的功能，并未得到揭示和阐明。

发明内容

本发明的目的在于提供水稻OsRGE3基因的核苷酸序列，并明确该基因负调控水稻萌发期根生长的功能。

本发明的第二个目的在于提供水稻OsRGE3蛋白。

本发明的第三个目的在于提供上述OsRGE3基因的克隆引物。

本发明的第四个目的在于提供含有上述OsRGE3基因的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

本发明的第五个目的在于提供上述OsRGE3基因或OsRGE3蛋白的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

OsRGE3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，或其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

OsRGE3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了参与调控水稻根长的基因及其编码蛋白，该基因命名为OsRGE3(Root Growth related E3)，它所编码的蛋白命名为OsRGE3。OsRGE3基因组序列全长为4855bp，外显子CDS序列全长为2193bp，编码730个氨基酸，该基因来源于水稻，为调控水稻萌发期根生长提供了新的遗传资源。

克隆上述OsRGE3基因的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示。

含有如上述的OsRGE3基因的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

使用本发明所提供的OsRGE3基因构建重组表达载体导入植物细胞，获得与水稻萌发期根伸长相关的转基因植株时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP、YFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(抗潮霉素、抗除草剂Basta等基因)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。含有本发明OsRGE3基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、如基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。上述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物为水稻。

上述OsRGE3基因或OsRGE3蛋白的应用，为以下任一所示：

1)在促进水稻萌发期根生长方面的应用；

2)在改善水稻耐旱性方面的应用。

优选的，通过对OsRGE3基因进行敲除或下调OsRGE3基因或OsRGE3蛋白的表达量，获得萌发期根长增长的植株。

优选的，通过CRISPR-Cas9对OsRGE3基因进行敲除。

进一步优选的，还包括如下步骤：提取OsRGE3基因敲除突变体基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定基因突变类型；其中，所述PCR扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8-9所示。

本发明取得的有益效果：

本发明提供了调控水稻根生长的基因OsRGE3及其编码的蛋白，并进一步提供了该基因或蛋白在促进水稻萌发期根生长、提高水稻种子在干旱条件下的萌发率及改善水稻耐旱性方面的应用。本发明通过构建CRISPR/Cas9-OsRGE3敲除载体，利用农杆菌介导法转化水稻，获得OsRGE3敲除突变体；并经过试验证明，OsRGE3基因功能缺失突变体Cas9-N1和Cas9-N2的根长较野生型Nipponbare显著变长(P＜0.01)，表明降低OsRGE3基因的表达可显著促进水稻萌发期幼根的伸长，进而提高种子在萌发期干旱条件耐旱性。此外，水稻根长增长有助于植株增强养分吸收，进而影响水稻产量和品质。本发明中的OsRGE3基因为水稻分子育种提供了新的优异基因资源，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为OsRGE3基因的克隆；

图2为OsRGE3编码蛋白的结构域预测；

图3为OsRGE3编码蛋白的U-box结构域序列分析；

图4为OsRGE3的U-box domain同源蛋白序列比对分析；

图5为OsRGE3基因的表达模式分析；

图6为OsRGE3基因结构示意图及CRISPR/Cas9靶标序列位点；

图7为水稻Nipponbare生态背景下Cas9-OsRGE3敲除突变体材料突变位点；

图8为水稻Nipponbare生态背景下Cas9-OsRGE3敲除突变体萌发3d根长表型；

图9为水稻Nipponbare生态背景下Cas9-OsRGE3敲除突变体萌发3d根长统计分析；

图10为水稻Nipponbare生态背景下Cas9-OsRGE3敲除突变体在不同浓度D-甘露醇处理2天后的表型分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1 OsRGE3的基因的克隆

1、野生型水稻日本晴的RNA提取

取适量野生型水稻日本晴幼苗叶片于无菌的2mL RNAase-free离心管中，液氮速冻后于组织研磨仪中迅速研磨成粉状，加入1mL TRIzol(Invitrogen)，涡旋混匀，冰上静置裂解10-15min；4℃,12,000rpm离心10min；吸取上清液于新的RNAase-free离心管中，加入200μL氯仿混匀，静置3-5min；4℃,12,000rpm离心10min；轻轻吸取600μL上清液于新的RNAase-free离心管中(注意不要吸取到杂质)，加入等体积的预冷异丙醇混匀，-20℃静置30min沉降RNA；4℃,12,000rpm离心10min；弃上清，75％乙醇洗涤两次；超净工作台晾干，晾干后加入50μL的RNAase-free Water溶解RNA，分光光度计测定RNA浓度并记录。

2、RNA反转录为cDNA

首先进行gDNA去除，待试剂在冰上融化后，涡旋混匀后置于冰上，按照表1中体系依次加入反应buffer、模板RNA、RNase-free Water，体系为10μL，轻轻混匀后离心，42℃孵育5-10min。

表1 gDNA去除反应体系

将上一步得到的反应物中加入10μL

3、基因克隆

按照表2依次加入PCR反应所需试剂PrimeSTAR Max Premix、引物(OsRGE3-F:ATGGCCACGGCGGGCTCC、OsRGE3-R:ATCTGCATTTGACTGAAGCCAT，R端已去掉终止子)、模板DNA，体系为50μL，并按照表3中PCR扩增反应程序依次进行预变性、变性、退火、延伸、终延伸来进行基因克隆，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳观察到的目的条带进行切胶，并进行琼脂糖凝胶回收(利用琼脂糖凝胶回收试剂盒并参考说明书操作)，得到纯化的目的片段后测序验证并于-20℃保存备用。

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

1)琼脂糖凝胶电泳

称取0.3g琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入30ml的1×TAE缓冲液(TAE缓冲液配方如表4)，加热溶解至透明液体，冷却至微热时加入核酸染料混匀，倒入胶床静置20-30min使其凝固；将制好的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，用移液枪将PCR产物加入点样孔进行电泳。

表4 50×TAE(pH 8.5)的配置

配置好的50×TAE母液可于室温保存，使用时用蒸馏水稀释50倍使其为1×TAE缓冲液。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，片段大小为2193bp，泳道1、2为两个重复。

2)琼脂糖凝胶回收

将目的条带切下放置于1.5mL干净离心管中，加入等体积PN溶液，50℃加热溶解胶块；向吸附柱中加入500μL平衡液平衡柱子；然后将溶解的胶液加入平衡过的吸附柱中，静置5-10min；12,000rpm离心1min，倒掉废液；加入600μL PW漂洗杂质，漂洗两次；12,000rpm离心2min，除尽漂洗液；风干吸附柱，加入50μL ddH

将得到纯化的目的片段进行测序验证，OsRGE3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

图2为OsRGE3编码蛋白的结构域预测，OsRGE3在N端有一个Usp结构域，在C端有一个Pkinase_Tyr结构域和一个U-box结构域。图3是对图2中结构域的蛋白序列的补充。图4是在拟南芥及水稻中其他含有U-box结构域的蛋白进行的同源性分析。

实施例2 OsRGE3基因的表达模式分析

利用实时荧光定量PCR的方法对OsRGE3基因的表达模式进行分析，具体的，取不同时期的水稻组织样品在液氮中速冻后于-80℃的超低温冰箱中保存样品。水稻总RNA的提取及RNA反转录步骤参见实施例1，将得到的cDNA产物稀释10倍用于荧光定量qRT-PCR。使用

qPCR-OsRGE3-F:GACTTTGGTAATGTGCCATCC

qPCR-OsRGE3-R:GCCTCTGCTTCGTAGGTGAA

结果如图5所示，OsRGE3基因在幼苗时期主要根系表达，成熟时期在叶片和根系表达较高。

实施例3 CRISPR/Cas9-OsRGE3载体构建

(1)引物设计

根据测序获得的OsRGE3的CDS序列，在其靠近5’端寻找PAM(即NGG)序列，NGG前面20个碱基加对应酶切位点即为引物F的序列，其反向互补序列加对应酶切位点即为引物R的序列。靶位点为NGG前20bp(图6)。引物序列为：Cas9-F:GGCAGAGAAGGTGTACGTGGCGGT Cas9-R:AAACACCGCCACGTACACCTTCTC

(2)中间载体sgRNA的连接

首先将引物稀释到100μM，等比例加入200μL离心管中，按照表5中比例配置10μL体系，并按照表6所示反应程序进行PAM序列的连接，目的是将合成的两条链结合在一起。反应结束后，将连接产物稀释20倍备用。

表5 PAM序列连接体系

表6 PAM序列连接程序

其次进行sgRNA载体的酶切，使载体线性化，按照表7中酶切反应体系配置，并于37℃水浴锅中酶切1-2h。

表7 sgRNA载体酶切体系

将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行琼脂糖凝胶回收，得到回收产物，与上一步稀释过的连接产物进行以下体系的连接，如表8所示。

表8 sgRNA与PAM连接体系

25℃连接5min后再4℃过夜连接，转化于DH5α感受态细胞中(大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化过程如下)，利用载体上引物U3-F和自身R引物(U3-F:AGCACAGGACAGGCGTCTTCT、Cas9-R:AAACACCGCCACGTACACCTTCTC)检测菌落PCR，并送样测序，确定正确克隆的sgRNA中间载体。

①大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

用接种针蘸取保存的DH5α菌种在LB平板(无抗生素)上画线，37℃培养12-16h；挑取单菌落于5mL无抗生素的LB液体培养基摇菌，37℃振荡培养12-16h；按1:50的比例加入200mL LB液体培养基(无抗生素)，37℃培养至OD值为0.6；将菌液置于冰上静置冰浴10min，于4℃离心机4,000rpm离心10min收集菌体于50mL的无菌离心管中，弃上清；加入20mL预冷的0.1mol/L CaCl

②大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化

取感受态细胞冰上融化，加入连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速冰浴2-3min；加入500μL无菌无抗LB液体培养基，37℃180rpm在摇床中振荡培养45-60min，使菌体复苏；根据试验要求，吸取适量已转化的感受态细胞加入到含相应抗生素的LB固体平板上，用玻璃涂抹棒将细胞均匀涂开；37℃倒置培养12-16h。

(3)终载Cas9-OsRGE3的连接

将测序正确的中间载体Entry clone与Cas9终载Destination vector进行LR重组，重组体系如表9，25℃反应1h。

表9 sgRNA与Cas9终载LR重组体系

加入1μL proteinase K后37℃反应10min以终止反应，4℃过夜连接，转化于DH5α感受态细胞，利用载体上引物U3-F和自身R引物检测菌落PCR，并送样测序，保存测序正确的质粒载体。

实施例4 OsRGE3敲除突变体

1、农杆菌感受态的制备及转化

(1)农杆菌感受态的制备

用接种针蘸取保存的EHA105菌种在LB固体平板上划线，28℃培养2d；挑取新长出的单菌落于5mL LB液体培养基中，28℃在摇床中200rpm培养12-16h；将摇起来的农杆菌转接到50mL LB液体培养基中，28℃在摇床中200rpm培养3-5h至OD

(2)农杆菌转化

冰上融化农杆菌感受态细胞，加入实施例3构建好的质粒1μL，依次冰浴5min，液氮速冻5min，37℃水浴5min，冰浴2min，于超净工作台中加入800μL LB液体培养基，28℃在摇床中200rpm培养3-4h；5,000rpm离心1min收集菌体，涂布于LB固体平板上，28℃培养30-36h。

2、水稻遗传转化

挑取农杆菌转化的阳性菌落，28℃振荡培养，保存菌种。

依次进行共培养、筛选、分化、生根、炼苗等步骤，得到转基因水稻苗。

将T

测序结果如图7所示，获得了两种类型的敲除材料：Cas9-N1株系为插入一个单碱基T的纯合突变体(CTTCTCCGGCGAGAAGGTGTACGTGGCTGGTGGGGGAG)，Cas9-N2为缺少七个碱基GGCGGTG的纯合突变体(CTTCTCCGGCGAGAAGGTGTACGTGG-------GGAGGAG)。

实施例5转基因水稻幼苗培育及根系表型分析

1、水稻幼苗培育

1)水稻种子催芽萌发

首先将水稻种子用20％次氯酸钠溶液[购买的原液与水按1:5混合(V/V)]消毒30min，然后用无菌水冲洗6-8次至没有刺鼻气味；将消毒后的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中，30℃黑暗培养2-3d，每日观察并更换培养皿中的水。

2)水稻幼苗培养

将萌发的种子铺于由泡沫板漂浮的纱布上，清水培养3-4d，1/4全营养液培养2d，1/3全营养液培养2d，1/2全营养液培养2d，然后用全营养液培养。水培营养液配方参照国际水稻所营养液等方法。

营养液所需元素：

①大量元素：氮、磷、钾、钙、镁。

②微量元素：硅、铁、锰、硼、锌、铜。

③有机酸：柠檬酸。

各营养元素母液配制：

微量元素Mn、Mo、B、Zn、Cu以及柠檬酸(一水合物)需要分别溶解，然后和100ml浓H

表10营养母液制备

3)营养液的配制

营养液配制如下表11。

表11以制备4L营养液为例

2、水稻根系表型统计

为测定OsRGE3基因功能缺失对水稻萌发期根长的影响，以野生型水稻Nipponbare品种作为对照，分析OsRGE3基因功能缺失突变体Cas9-N1和Cas9-N2在种子萌发期根长生长情况。将野生型水稻和Cas9-OsRGE3突变体材料在同一环境中正常培养，每日观察根系表型，并统计根长等根部性状，然后进行生物学统计分析。

结果如图8-9所示，萌发3天后，OsRGE3基因功能缺失突变体Cas9-N1和Cas9-N2的根长较野生型Nipponbare显著变长(P＜0.01)，长约40％-45％左右，表明降低OsRGE3基因的表达可显著促进水稻萌发期幼根的伸长。

实施例6萌发后甘露醇模拟干旱处理试验

配置浓度为0.1M和0.3M的D-甘露醇，处理萌发一致的OsRGE3基因功能缺失突变体Cas9-N1和Cas9-N2及野生型Nipponbare，观察表型并在处理2天后拍照记录。

结果如图10所示，0M的D-甘露醇处理下，2天后Cas9-OsRGE3的敲除材料根长较野生型Nipponbare变长；0.1M的D-甘露醇处理下，2天后Cas9-OsRGE3的敲除材料根长也较野生型Nipponbare长，但整体与0MD-甘露醇处理下相比都变短；0.3M的D-甘露醇处理下，2天后Cas9-OsRGE3的敲除材料根长也较野生型Nipponbare长，整体与0MD-甘露醇处理下相比明显变短。以上结果表明Cas9材料在D-甘露醇模拟干旱处理条件下，表现出较为抗旱的表型。

<110> 河南农业大学

<120> 水稻OsRGE3基因及其编码蛋白与应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4855

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<221> OsRGE3基因

<400> 1

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tgacaaacct cgatctacca caccgtgatc ttttgccgaa ccatgccctc cgttctgcaa 4380

ttcaagaatg gcttcagtca aatgcagatt aatatgtttg gattctcatc atggaaagta 4440

acaatgaaaa ttatgtcata tatcttctga agatacatct cagaccaggg ttaataagca 4500

gaaaccacag gaaaccaaac gtcttgtgtc tttttttgtt ctgaaggaat gactaattaa 4560

aggtatacac acggttgttc ttttcttttc ttttttttag caaaacctgt atgtaaaaaa 4620

tataataaat tcggagctat ctctgctcca tcagtagcat ggtagacatt gtacaggtag 4680

tcacttgtca ctttgtcagt gtagtagaga gttgtgatat ctgagcaata gccaaaaaaa 4740

tgctcagcta gagtgtatgg aagtggaaat acatgtatga atagaactat cagatcagaa 4800

tttcaccatt tataatgtta tcatgcttac gtgttgtaac cattctgatt atata 4855

<210> 2

<211> 2193

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<221> OsRGE3基因

<400> 2

atggccacgg cgggctcccc ctctccgtac cccggtgatt cgccggagcc gtccttctcc 60

ggcgagaagg tgtacgtggc ggtgggggag gagtccagca ggggcacgct gctgtgggcg 120

ctgcacaagt tcccccaagg caccgccttc gtgctgctcc atgtctactc ccctcccaac 180

ttcctcccca tcctcggagc caagattccc gccggccagc tgcgagagca ggagctgatt 240

gcacacaaga agatgaacct gcaaagaatc agtgacaact tggatcaata ccaactcata 300

tgcgcgcagc agaaggtaca agctgagaaa ttggtggttg aatcagatga tgttgcatac 360

ggattggtgg acgtcatctc tgagcataat gtttccatgc ttgtaatggg ggccgcagat 420

gataagcact atacaaagaa ggctgctccc tttggccatg atgtgatgca ggactgtagg 480

caaagtgcta cttctgcaca atgttcagtg gagagatcga gtagcttgtc agagatttgg 540

tgtgtttcaa acacatggct acacaaacta aacctcgaac cacatatcga gacaactagt 600

tcagacagat actctgataa ggaaaaggaa gatactaaag agcgtggtga gtctgacaat 660

gagctccagc atatacccat gcagttagag agagtaagac aagaagctta tgaggagaaa 720

tgtaggcgtg agaaagcaga gcaggagtta tttgaggctc tccagaaagt gcaggtatca 780

gagaatttgt actttggaga actgaagcaa aagaatgaaa tagaggtaaa attggcaaca 840

acaatggagg aagttgacag gcttgcaaga acagctgatg aacttgctgc aaaatttcaa 900

gagcaatgtg agaagatatt ggtcctagag aagcgaagcg cccattctga ccgtattatc 960

aaggatctta tgttgcagcg tgacaaagca gtaagagagg cagaagcaat acgtgtaaaa 1020

aatggagagt ctactgcaat tgcggataga acaattccca ttacagagct atcgatatca 1080

gagattaagg aggcaaccag caactttgat cactcatcga aggttgggga aagtgtttat 1140

ggaagtgtat ataagggact tcttcggcaa acaaatgtgg ctgtaaagaa gttgaatcct 1200

gaaagcacag agtcactgtc acagttcagt catgaggtgg aaatccttag cagggtgcga 1260

catccgaatc ttgtaactct tataggggca tgcaaggatg cccgagctct tgtctatgaa 1320

tacatgccca atggaagctt agatgaccgc ttggcttgca aggacaattc aaagcctctt 1380

agttggcagt tgcgtacccg catcgcttcc aatatttgtt ctgcactgat ttttctccat 1440

tccaataaac cccacagcat tgttcacagt gacttgaaag catctaacat tcttcttgat 1500

ggaaataatg tggctaagct tagtggtttt ggtgtgtgcc gaatgttaac tgatgaattc 1560

aaggccacaa ccactctata ccgccatacc cacccaaaag gaacttttgt gtacattgat 1620

cctgaatacg ctatttctgg tgatctgaca cccctatctg atgtatattc ttttggtatc 1680

atactcctgc gactcttgac tggaagatca ggatttggtc ttttgaaaga tgtgcaacgg 1740

gcagtagcaa agggttgctt gcaagcaata ttggattcat cagctggaga ctggcctctt 1800

atgcatgctg agcagttgtc tcgggtaggc ctaagatgct gtgaaatcag aagaaaaaac 1860

cgtcctgacc tgcaaacaga ggtttggaca gtacttgaac caatgttgag gtctgcttcc 1920

tctatgctat gttcattatc atttaaatca gtatctgaag actttggtaa tgtgccatcc 1980

tacttcatct gtccaataca acaggatgtc atgagggacc ctttaattgc tgcagatggt 2040

ttcacctacg aagcagaggc tataagagag tggtttgata gtggtcacta tacatcaccc 2100

atgacaaacc tcgatctacc acaccgtgat cttttgccga accatgccct ccgttctgca 2160

attcaagaat ggcttcagtc aaatgcagat taa 2193

<210> 3

<211> 730

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<221> OsRGE3蛋白

<400> 3

Met Ala Thr Ala Gly Ser Pro Ser Pro Tyr Pro Gly Asp Ser Pro Glu

1 5 10 15

Pro Ser Phe Ser Gly Glu Lys Val Tyr Val Ala Val Gly Glu Glu Ser

20 25 30

Ser Arg Gly Thr Leu Leu Trp Ala Leu His Lys Phe Pro Gln Gly Thr

35 40 45

Ala Phe Val Leu Leu His Val Tyr Ser Pro Pro Asn Phe Leu Pro Ile

50 55 60

Leu Gly Ala Lys Ile Pro Ala Gly Gln Leu Arg Glu Gln Glu Leu Ile

65 70 75 80

Ala His Lys Lys Met Asn Leu Gln Arg Ile Ser Asp Asn Leu Asp Gln

85 90 95

Tyr Gln Leu Ile Cys Ala Gln Gln Lys Val Gln Ala Glu Lys Leu Val

100 105 110

Val Glu Ser Asp Asp Val Ala Tyr Gly Leu Val Asp Val Ile Ser Glu

115 120 125

His Asn Val Ser Met Leu Val Met Gly Ala Ala Asp Asp Lys His Tyr

130 135 140

Thr Lys Lys Ala Ala Pro Phe Gly His Asp Val Met Gln Asp Cys Arg

145 150 155 160

Gln Ser Ala Thr Ser Ala Gln Cys Ser Val Glu Arg Ser Ser Ser Leu

165 170 175

Ser Glu Ile Trp Cys Val Ser Asn Thr Trp Leu His Lys Leu Asn Leu

180 185 190

Glu Pro His Ile Glu Thr Thr Ser Ser Asp Arg Tyr Ser Asp Lys Glu

195 200 205

Lys Glu Asp Thr Lys Glu Arg Gly Glu Ser Asp Asn Glu Leu Gln His

210 215 220

Ile Pro Met Gln Leu Glu Arg Val Arg Gln Glu Ala Tyr Glu Glu Lys

225 230 235 240

Cys Arg Arg Glu Lys Ala Glu Gln Glu Leu Phe Glu Ala Leu Gln Lys

245 250 255

Val Gln Val Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gly Glu Leu Lys Gln Lys Asn

260 265 270

Glu Ile Glu Val Lys Leu Ala Thr Thr Met Glu Glu Val Asp Arg Leu

275 280 285

Ala Arg Thr Ala Asp Glu Leu Ala Ala Lys Phe Gln Glu Gln Cys Glu

290 295 300

Lys Ile Leu Val Leu Glu Lys Arg Ser Ala His Ser Asp Arg Ile Ile

305 310 315 320

Lys Asp Leu Met Leu Gln Arg Asp Lys Ala Val Arg Glu Ala Glu Ala

325 330 335

Ile Arg Val Lys Asn Gly Glu Ser Thr Ala Ile Ala Asp Arg Thr Ile

340 345 350

Pro Ile Thr Glu Leu Ser Ile Ser Glu Ile Lys Glu Ala Thr Ser Asn

355 360 365

Phe Asp His Ser Ser Lys Val Gly Glu Ser Val Tyr Gly Ser Val Tyr

370 375 380

Lys Gly Leu Leu Arg Gln Thr Asn Val Ala Val Lys Lys Leu Asn Pro

385 390 395 400

Glu Ser Thr Glu Ser Leu Ser Gln Phe Ser His Glu Val Glu Ile Leu

405 410 415

Ser Arg Val Arg His Pro Asn Leu Val Thr Leu Ile Gly Ala Cys Lys

420 425 430

Asp Ala Arg Ala Leu Val Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Asp

435 440 445

Asp Arg Leu Ala Cys Lys Asp Asn Ser Lys Pro Leu Ser Trp Gln Leu

450 455 460

Arg Thr Arg Ile Ala Ser Asn Ile Cys Ser Ala Leu Ile Phe Leu His

465 470 475 480

Ser Asn Lys Pro His Ser Ile Val His Ser Asp Leu Lys Ala Ser Asn

485 490 495

Ile Leu Leu Asp Gly Asn Asn Val Ala Lys Leu Ser Gly Phe Gly Val

500 505 510

Cys Arg Met Leu Thr Asp Glu Phe Lys Ala Thr Thr Thr Leu Tyr Arg

515 520 525

His Thr His Pro Lys Gly Thr Phe Val Tyr Ile Asp Pro Glu Tyr Ala

530 535 540

Ile Ser Gly Asp Leu Thr Pro Leu Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Ile

545 550 555 560

Ile Leu Leu Arg Leu Leu Thr Gly Arg Ser Gly Phe Gly Leu Leu Lys

565 570 575

Asp Val Gln Arg Ala Val Ala Lys Gly Cys Leu Gln Ala Ile Leu Asp

580 585 590

Ser Ser Ala Gly Asp Trp Pro Leu Met His Ala Glu Gln Leu Ser Arg

595 600 605

Val Gly Leu Arg Cys Cys Glu Ile Arg Arg Lys Asn Arg Pro Asp Leu

610 615 620

Gln Thr Glu Val Trp Thr Val Leu Glu Pro Met Leu Arg Ser Ala Ser

625 630 635 640

Ser Met Leu Cys Ser Leu Ser Phe Lys Ser Val Ser Glu Asp Phe Gly

645 650 655

Asn Val Pro Ser Tyr Phe Ile Cys Pro Ile Gln Gln Asp Val Met Arg

660 665 670

Asp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Phe Thr Tyr Glu Ala Glu Ala Ile

675 680 685

Arg Glu Trp Phe Asp Ser Gly His Tyr Thr Ser Pro Met Thr Asn Leu

690 695 700

Asp Leu Pro His Arg Asp Leu Leu Pro Asn His Ala Leu Arg Ser Ala

705 710 715 720

Ile Gln Glu Trp Leu Gln Ser Asn Ala Asp

725 730

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsRGE3-F

<400> 3

atggccacgg cgggctcc 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsRGE3-R

<400> 4

atctgcattt gactgaagcc at 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Cas9-F

<400> 5

ggcagagaag gtgtacgtgg cggt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Cas9-R

<400> 6

aaacaccgcc acgtacacct tctc 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> U3-F

<400> 7

agcacaggac aggcgtcttc t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 鉴定引物F

<400> 8

agggaggcaa caagaagaga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 鉴定引物R

<400> 9

aattgagttg gcctcgattg 20