神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系及其构建方法与应用。

背景技术

缺血性脑卒中的发病率、致残率及死亡率均高。因其严格的治疗时间窗、昂贵的医疗费用和沉重的社会负担受到人们极大的关注。虽然缺血区血管可自然或医源性再通而恢复血液灌注，然而部分细胞的功能障碍或结构破坏却进一步加重，即发生脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)，而如何有效地减轻CIRI是提高急性缺血性脑卒中疗效的关键因素之一。

然而，CIRI病理机制复杂，越来越多的研究显示炎症-免疫反应贯穿CIRI的发生、发展全过程，其中单核巨噬细胞表型转换在缺血性脑卒中急性期的炎症反应发挥极其重要的作用。但其机制目前尚不明确。中枢神经系统的单核巨噬细胞即小胶质细胞，是脑实质内唯一的固有免疫细胞。脑缺血数分钟后，神经元坏死，小胶质细胞被激活，血液内的单核细胞被招募、迁移至脑缺血半暗带区，活化为小胶质细胞/巨噬细胞。

T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子4(T cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 4，TIM4)是近年新发现的TIM蛋白家族成员，有研究表明TIM-4在肝脏和肾脏的缺血再灌注损伤中起着重要作用，但其对脑缺血再灌注损伤的影响尚不清楚。因此，构建一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，从而进一步研究TIM-4通过调控炎症-免疫反应参与CIRI的作用机制是亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对上述现有技术的缺陷，提供一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系及其构建方法与应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，所述体系包括神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞；所述神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞来源于基因敲除小鼠和野生型小鼠；所述体系为体外培养体系。

本发明还提供一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法，包括以下步骤：

S1、磁珠分选T细胞：

S1.1、无菌条件下分离出生1-3天的小鼠淋巴器官并制备单细胞悬液，去除红细胞，细胞混悬后计数；

S1.2、在S1.1步骤所得的细胞悬液中加入一抗孵育，离心并弃上清，沉淀混悬；

S1.3、在S1.2步骤所得的细胞悬液中加入MACS磁珠孵育，离心并弃上清，沉淀混悬后进行分离并洗脱；

S1.4、将S1.3步骤所得的细胞悬液离心并弃上清，沉淀混悬后计数，即获得带磁珠的分选T细胞；

S2、原代培养小胶质细胞/巨噬细胞：

S2.1、无菌条件下分离出生1-3天的小鼠脑组织并剪碎，加入消化试剂；

S2.2、在S2.1步骤的脑组织中加入完全培养基终止消化，离心弃上清，沉淀物重悬于完全培养基，静置，去除成纤维细胞，得到第一细胞悬液；

S2.3、将S2.2步骤所得的第一细胞悬液接种于第一细胞培养瓶，第一次培养后换液，进行第二次培养，分离小胶质细胞/巨噬细胞悬液并进一步纯化小胶质细胞/巨噬细胞，随后进行第三次培养，得到混合细胞；

S2.4、对S2.3步骤所得的混合细胞用大鼠抗小鼠CD68和OX42抗体进行流式鉴定，得到小胶质细胞/巨噬细胞；

S3、原代培养神经元细胞：

S3.1、无菌条件下分离出生1-3天的小鼠脑组织并剪碎，加入消化试剂；

S3.2、在S3.1步骤的脑组织中加入完全培养基终止消化，离心弃上清，沉淀物重悬于完全培养基，静置，去除成纤维细胞，得到第二细胞悬液；

S3.3、将S3.2步骤所得的第二细胞悬液接种于第二细胞培养瓶，进行第四次培养，随后将培养液全量换成无血清培养基，进行第五次培养，加入阿糖胞苷，进行第六次培养，随后全量换液，进行第七次培养，随后定期半量换液进行第八次培养；

S3.4、对S3.3步骤所得的细胞进行化学染色，得到神经元细胞；

S4、神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养：

S4.1、将5-15ng/mL LPS与S2.4步骤所得的小胶质细胞/巨噬细胞混合，随后与S1.4步骤所得的分选T细胞置于基底胶包被的Transwell小室中进行第一次共培养；

S4.2、在培养板中加入S3.4步骤得到的神经元细胞，进行第二次共培养。

优选地，S1.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM1基因敲除小鼠；S2.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM-4基因敲除小鼠；S3.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠。

优选地，S1.1步骤中，用4-6只小鼠的淋巴结或1-3只小鼠的脾脏制备单细胞悬液。

优选地，S1.2步骤中，一抗为CD4/CD8抗体；孵育温度为2-6℃，时间为25-35min。

优选地，S1.3步骤中，按每10

优选地，S1.2、S1.3、S1.4步骤中，离心条件为2-6℃，1500-2000rpm，10-15min；S2.2和S3.2步骤中，离心的转速为800-1200rpm，时间为4-6min。

优选地，S1.3步骤中，将细胞通过30-40μm滤网，用0.1-0.4mL MACS缓冲液冲洗。

优选地，S2.2和S3.2步骤中，完全培养基为DMEM/F12培养基，静置时间为25-35min。

优选地，S2.3步骤中，所述第一细胞培养瓶经过多聚L-赖氨酸处理，其培养基为含1％青链霉素、20％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基；所述第二细胞培养瓶经过多聚L-赖氨酸处理，其培养基为含1％青链霉素、10％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基；所述无血清培养基为含1％青链霉素的DMEM/F12高糖培养基；所述阿糖胞苷的终浓度为8-12μmol/L。

优选地，S2.3和S3.3步骤中，第一次、第二次、第三次、第四次、第五次、第六次、第七次和第八次的培养条件均为35-39℃、3-7％CO

优选地，S2.3、S3.3步骤中，第一次培养2-4天，换液量为1/2-1/4，第二次培养7-9天，第三次培养2-4天，第四、第五和第六次培养为0.5-1.5天，第七次培养4-5天，第八次培养每2.5-3.5天半量换液。

优选地，S4.1、S4.2步骤中，第一次、第二次共培养均为2-4天。

本发明还提供一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法的应用，所述构建方法用于体外实验研究TIM-4调控小胶质细胞/巨噬细胞参与脑缺血再灌注损伤的作用机制。

本发明的有益效果：

本发明通过细胞生物学、分子生物学手段构建一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，用于进行体外实验研究。

本发明通过基因敲除小鼠原代细胞分离和培养技术与细胞共培养技术，提出一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法，有助于研究TIM-4对脑缺血再灌注损伤的作用。

本发明提出的细胞共培养体系的构建方法可用于体外实验研究TIM-4调控小胶质细胞/巨噬细胞参与脑缺血再灌注损伤的作用机制，包括TIM-4在小胶质/巨噬细胞表型转换、小胶质/巨噬细胞-T细胞免疫反应的作用和调控小胶质/巨噬细胞-T细胞免疫反应对神经元损伤的影响，从而丰富CIRI炎症-免疫反应机制，有望为CIRI脑损伤保护提供新的思路和靶点。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，体系包括神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞；神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞来源于基因敲除小鼠和野生型小鼠；体系为体外培养体系。

本发明通过细胞生物学、分子生物学手段构建一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，用于进行体外实验研究。

本发明还提供一种上述神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法，包括以下步骤：

S1、磁珠分选T细胞：

S1.1、无菌条件下将出生1-3天的雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM1基因敲除小鼠冰埋4-6min后麻醉，用70-80％酒精进行消毒，分离小鼠的淋巴器官，用4-6只小鼠的淋巴结或1-3只小鼠的脾脏制备单细胞悬液，并去除红细胞，在5-15mL HBSS缓冲液中混悬，计数。

其中，HBSS缓冲液以其总体积为100mL计，包括以下组分：5mL胎牛血清、2mmol pH为7.0的HEPES缓冲液、10

HBSS缓冲液的制备方法如下：配制2mmol pH为7.0的HEPES缓冲液，加入5mL胎牛血清、10

S1.2、在S1.1步骤所得的细胞悬液中加入一抗(CD4/CD8抗体)，一抗和细胞悬液的混合体积比为1:100，在2-6℃孵育25-35min；随后在2-6℃，1500-2000rpm离心10-15min，并弃上清，在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到10

其中，MACS缓冲液以其总体积为100mL计，包括以下组分：pH为7.2的PBS缓冲液、5gBSA、0.2mmol EDTA。

MACS缓冲液的制备方法：在100mLpH为7.2的PBS缓冲液中加入5g BSA、0.2mmolEDTA混匀。

PBS缓冲液的配方及其制备方法为现有技术，在此不再赘述，下同。

S1.3、在S1.2步骤所得的细胞悬液中按每10

随后，细胞放到AUTO MACS的上样通道，选择possel程序，标记的细胞将从阳性通道洗脱。

作为选择，滤网可为30μm尼龙网或40μm预分离滤膜。

S1.4、将S1.3步骤所得的细胞悬液在2-6℃，1500-2000rpm离心10-15min，并弃上清，在沉淀中加入2-5mL RPMI-10完全培养基混悬，计数，即获得带磁珠的分选T细胞。

其中，RPMI-10完全培养基以其总体积为100mL计，包括以下组分：10mL胎牛血清、0.1mmol丙酮酸钠、5mg庆大霉素、10mol HEPES缓冲液。

RPMI-10完全培养基的制备方法：配制10mol HEPES缓冲液，加入10mL胎牛血清、0.1mmol丙酮酸钠、5mg庆大霉素混匀，并使其总体积为1L。

S2、原代培养小胶质细胞/巨噬细胞：

S2.1、无菌条件下将出生1-3天的雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM-4基因敲除小鼠冰埋4-6min后麻醉，用70-80％酒精进行消毒，将头剪下置于预冷的HBSS溶液中清洗；剪开颅骨取出大脑，沿中线切成两个大脑半球，去除脑干、小脑、嗅球，剥除脑膜及海马；随后在HBSS中剪碎脑组织，吹打至组织块完全消散，加入0.5-2.5mL含量为0.03-0.07％胰蛋白酶，消化10-20min。

S2.2、在S2.1步骤的脑组织中加入5-6mL DMEM/F12完全培养基终止消化，800-1200rpm离心4-6min后弃上清，沉淀物重悬于1.5-2.5mL DMEM/F12完全培养基，静置25-35min，用差速贴壁法去除成纤维细胞，得到第一细胞悬液。

其中，DMEM/F12完全培养基的配方及其制备方法为现有技术，在此不再赘述，下同。

S2.3、将S2.2步骤所得的第一细胞悬液接种于第一细胞培养瓶，在35-39℃、3-7％CO

其中，第一细胞培养瓶的培养基为含1％青链霉素、20％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，其经过多聚L-赖氨酸处理。

S2.4、对S2.3步骤所得的混合细胞用大鼠抗小鼠CD68和OX42抗体进行流式鉴定，得到阳性率大于95％的小胶质细胞/巨噬细胞。

S3、原代培养神经元细胞：

S3.1、无菌条件下将出生1-3天的雄性野生型C57BL/6J小鼠冰埋4-6min后麻醉，用70-80％酒精进行消毒，将头剪下置于预冷的HBSS溶液中清洗；剪开颅骨取出大脑，沿中线切成两个大脑半球，去除脑干、小脑、嗅球，剥除脑膜及海马；随后在HBSS中剪碎脑组织，吹打至组织块完全消散，加入0.5-2.5mL含量为0.03-0.07％胰蛋白酶，消化10-20min。

S3.2、在S3.1步骤的脑组织中加入DMEM/F12完全培养基终止消化，800-1200rpm离心4-6min后弃上清，沉淀物重悬于DMEM/F12完全培养基，静置25-35min，用差速贴壁法去除成纤维细胞，得到第二细胞悬液。

S3.3、将S3.2步骤所得的第二细胞悬液接种于第二细胞培养瓶，在35-39℃、3-7％CO

其中，第二细胞培养瓶的培养基为含1％青链霉素、10％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，其经过多聚L-赖氨酸处理。

无血清培养基为含1％青链霉素的DMEM/F12高糖培养基。

S3.4、对S3.3步骤所得的细胞用NSE多克隆抗体进行免疫细胞化学染色，得到阳性率大于95％的神经元细胞。

S4、神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养：

S4.1、将5-15ng/mL LPS与S2.4步骤所得的小胶质细胞/巨噬细胞混合，随后与S1.4步骤所得的分选T细胞置于基底胶包被的Transwell小室中进行第一次共培养2-4天。LPS和小胶质细胞/巨噬细胞的混合体积比为现有技术，本发明不作具体限定。

S4.2、在培养板中加入S3.4步骤得到的神经元细胞，第二次共培养2-4天。

本发明通过基因敲除小鼠原代细胞分离和培养技术与细胞共培养技术，提出一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法，有助于研究TIM-4对脑缺血再灌注损伤的作用。

本发明还提供一种上述神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法的应用，该构建方法用于体外实验研究TIM-4调控小胶质细胞/巨噬细胞参与脑缺血再灌注损伤的作用机制，包括TIM-4在小胶质/巨噬细胞表型转换、小胶质/巨噬细胞-T细胞免疫反应的作用和调控小胶质/巨噬细胞-T细胞免疫反应对神经元损伤的影响，从而丰富CIRI炎症-免疫反应机制，有望为CIRI脑损伤保护提供新的思路和靶点。

以下通过具体实施例进行说明：

实施例1

一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，体系包括神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞；神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞来源于基因敲除小鼠和野生型小鼠；体系为体外培养体系。

上述神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系通过以下构建方法进行构建：

S1、磁珠分选T细胞：

S1.1、无菌条件下将出生2天的雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM1基因敲除小鼠冰埋5min后麻醉，用75％酒精进行消毒，分离小鼠的淋巴器官，用5只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液，并去除红细胞，在10mL HBSS缓冲液中混悬，计数。

S1.2、在100μL的S1.1步骤所得的细胞悬液中加入1μL一抗(CD4/CD8抗体)，在4℃孵育30min；随后在4℃，1800rpm离心13min，并弃上清，在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到10

S1.3、在S1.2步骤所得的细胞悬液中按每10

随后，细胞放到AUTO MACS的上样通道，选择possel程序，标记的细胞将从阳性通道洗脱。

S1.4、将S1.3步骤所得的细胞悬液在4℃，1800rpm离心13min，并弃上清，在沉淀中加入3mL RPMI-10完全培养基混悬，计数，即获得带磁珠的分选T细胞。

S2、原代培养小胶质细胞/巨噬细胞：

S2.1、无菌条件下将出生2天的雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM-4基因敲除小鼠冰埋5min后麻醉，用75％酒精进行消毒，将头剪下置于预冷的HBSS溶液中清洗；剪开颅骨取出大脑，沿中线切成两个大脑半球，去除脑干、小脑、嗅球，剥除脑膜及海马；随后在HBSS中剪碎脑组织，吹打至组织块完全消散，加入1.5mL含量为0.05％胰蛋白酶，消化15min；

S2.2、在S2.1步骤的脑组织中加入5.5mL DMEM/F12完全培养基终止消化，1000rpm离心5min后弃上清，沉淀物重悬于2mL DMEM/F12完全培养基，静置30min，用差速贴壁法去除成纤维细胞，得到第一细胞悬液；

S2.3、将S2.2步骤所得的第一细胞悬液接种于第一细胞培养瓶，在37℃、5％CO

其中，第一细胞培养瓶的培养基为含1％青链霉素、20％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，其经过多聚L-赖氨酸处理；

S2.4、对S2.3步骤所得的混合细胞用大鼠抗小鼠CD68和OX42抗体进行流式鉴定，得到阳性率大于95％的小胶质细胞/巨噬细胞；

S3、原代培养神经元细胞：

S3.1、无菌条件下将出生2天的雄性野生型C57BL/6J小鼠冰埋5min后麻醉，用75％酒精进行消毒，将头剪下置于预冷的HBSS溶液中清洗；剪开颅骨取出大脑，沿中线切成两个大脑半球，去除脑干、小脑、嗅球，剥除脑膜及海马；随后在HBSS中剪碎脑组织，吹打至组织块完全消散，加入1.5mL含量为0.05％胰蛋白酶，消化15min；

S3.2、在S3.1步骤的脑组织中加入DMEM/F12完全培养基终止消化，1000rpm离心5min后弃上清，沉淀物重悬于DMEM/F12完全培养基，静置30min，用差速贴壁法去除成纤维细胞，得到第二细胞悬液；

S3.3、将S3.2步骤所得的第二细胞悬液接种于第二细胞培养瓶，在37℃、5％CO

其中，第二细胞培养瓶的培养基为含1％青链霉素、10％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，其经过多聚L-赖氨酸处理；无血清培养基为含1％青链霉素的DMEM/F12高糖培养基；

S3.4、对S3.3步骤所得的细胞用NSE多克隆抗体进行免疫细胞化学染色，得到阳性率大于95％的神经元细胞；

S4、神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养：

S4.1、将10ng/mL LPS与S2.4步骤所得的小胶质细胞/巨噬细胞混合，随后与S1.4步骤所得的分选T细胞置于基底胶包被的Transwell小室中进行第一次共培养3天；

S4.2、在培养板中加入S3.4步骤得到的神经元细胞，第二次共培养3天。

一种上述神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法的应用，该构建方法用于体外实验研究TIM-4调控小胶质细胞/巨噬细胞参与脑缺血再灌注损伤的作用机制。

实施例2

一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，体系包括神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞；神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞来源于基因敲除小鼠和野生型小鼠；体系为体外培养体系。

上述神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系通过以下构建方法进行构建：

S1、磁珠分选T细胞：

S1.1、无菌条件下将出生1天的雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM1基因敲除小鼠冰埋4min后麻醉，用70％酒精进行消毒，分离小鼠的淋巴器官，用2只小鼠的脾脏制备单细胞悬液，并去除红细胞，在5mL HBSS缓冲液中混悬，计数。

S1.2、在100μL的S1.1步骤所得的细胞悬液中加入1μL一抗(CD4/CD8抗体)，在2℃孵育25min；随后在2℃，1500rpm离心15min，并弃上清，在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到10

S1.3、在S1.2步骤所得的细胞悬液中按每10

随后，细胞放到AUTO MACS的上样通道，选择possel程序，标记的细胞将从阳性通道洗脱。

S1.4、将S1.3步骤所得的细胞悬液在2℃，1500rpm离心15min，并弃上清，在沉淀中加入2mL RPMI-10完全培养基混悬，计数，即获得带磁珠的分选T细胞。

S2、原代培养小胶质细胞/巨噬细胞：

S2.1、无菌条件下将出生1天的雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM-4基因敲除小鼠冰埋4min后麻醉，用70％酒精进行消毒，将头剪下置于预冷的HBSS溶液中清洗；剪开颅骨取出大脑，沿中线切成两个大脑半球，去除脑干、小脑、嗅球，剥除脑膜及海马；随后在HBSS中剪碎脑组织，吹打至组织块完全消散，加入0.5mL含量为0.07％胰蛋白酶，消化10min；

S2.2、在S2.1步骤的脑组织中加入5mL DMEM/F12完全培养基终止消化，800rpm离心6min后弃上清，沉淀物重悬于1.5mL DMEM/F12完全培养基，静置25min，用差速贴壁法去除成纤维细胞，得到第一细胞悬液；

S2.3、将S2.2步骤所得的第一细胞悬液接种于第一细胞培养瓶，在35℃、3％CO

其中，第一细胞培养瓶的培养基为含1％青链霉素、20％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，其经过多聚L-赖氨酸处理；

S2.4、对S2.3步骤所得的混合细胞用大鼠抗小鼠CD68和OX42抗体进行流式鉴定，得到阳性率大于95％的小胶质细胞/巨噬细胞；

S3、原代培养神经元细胞：

S3.1、无菌条件下将出生1天的雄性野生型C57BL/6J小鼠冰埋4min后麻醉，用70％酒精进行消毒，将头剪下置于预冷的HBSS溶液中清洗；剪开颅骨取出大脑，沿中线切成两个大脑半球，去除脑干、小脑、嗅球，剥除脑膜及海马；随后在HBSS中剪碎脑组织，吹打至组织块完全消散，加入0.5mL含量为0.07％胰蛋白酶，消化10min；

S3.2、在S3.1步骤的脑组织中加入DMEM/F12完全培养基终止消化，800rpm离心6min后弃上清，沉淀物重悬于DMEM/F12完全培养基，静置25min，用差速贴壁法去除成纤维细胞，得到第二细胞悬液；

S3.3、将S3.2步骤所得的第二细胞悬液接种于第二细胞培养瓶，在35℃、3％CO

其中，第二细胞培养瓶的培养基为含1％青链霉素、10％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，其经过多聚L-赖氨酸处理；无血清培养基为含1％青链霉素的DMEM/F12高糖培养基；

S3.4、对S3.3步骤所得的细胞用NSE多克隆抗体进行免疫细胞化学染色，得到阳性率大于95％的神经元细胞；

S4、神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养：

S4.1、将5ng/mL LPS与S2.4步骤所得的小胶质细胞/巨噬细胞混合，随后与S1.4步骤所得的分选T细胞置于基底胶包被的Transwell小室中进行第一次共培养2天；

S4.2、在培养板中加入S3.4步骤得到的神经元细胞，第二次共培养2天。

一种上述神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法的应用，该构建方法用于体外实验研究TIM-4调控小胶质细胞/巨噬细胞参与脑缺血再灌注损伤的作用机制。

实施例3

一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，体系包括神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞；神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞来源于基因敲除小鼠和野生型小鼠；体系为体外培养体系。

上述神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系通过以下构建方法进行构建：

S1、磁珠分选T细胞：

S1.1、无菌条件下将出生1天的雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM1基因敲除小鼠冰埋6min后麻醉，用80％酒精进行消毒，分离小鼠的淋巴器官，用6只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液，并去除红细胞，在15mL HBSS缓冲液中混悬，计数。

S1.2、在100μL的S1.1步骤所得的细胞悬液中加入1μL一抗(CD4/CD8抗体)，在6℃孵育35min；随后在6℃，2000rpm离心10min，并弃上清，在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到10

S1.3、在S1.2步骤所得的细胞悬液中按每10

随后，细胞放到AUTO MACS的上样通道，选择possel程序，标记的细胞将从阳性通道洗脱。

S1.4、将S1.3步骤所得的细胞悬液在6℃，2000rpm离心10min，并弃上清，在沉淀中加入5mL RPMI-10完全培养基混悬，计数，即获得带磁珠的分选T细胞。

S2、原代培养小胶质细胞/巨噬细胞：

S2.1、无菌条件下将出生3天的雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM-4基因敲除小鼠冰埋6min后麻醉，用80％酒精进行消毒，将头剪下置于预冷的HBSS溶液中清洗；剪开颅骨取出大脑，沿中线切成两个大脑半球，去除脑干、小脑、嗅球，剥除脑膜及海马；随后在HBSS中剪碎脑组织，吹打至组织块完全消散，加入2.5mL含量为0.03％胰蛋白酶，消化20min；

S2.2、在S2.1步骤的脑组织中加入6mL DMEM/F12完全培养基终止消化，1200rpm离心4min后弃上清，沉淀物重悬于2.5mL DMEM/F12完全培养基，静置35min，用差速贴壁法去除成纤维细胞，得到第一细胞悬液；

S2.3、将S2.2步骤所得的第一细胞悬液接种于第一细胞培养瓶，在39℃、7％CO

其中，第一细胞培养瓶的培养基为含1％青链霉素、20％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，其经过多聚L-赖氨酸处理；

S2.4、对S2.3步骤所得的混合细胞用大鼠抗小鼠CD68和OX42抗体进行流式鉴定，得到阳性率大于95％的小胶质细胞/巨噬细胞；

S3、原代培养神经元细胞：

S3.1、无菌条件下将出生3天的雄性野生型C57BL/6J小鼠冰埋4min后麻醉，用80％酒精进行消毒，将头剪下置于预冷的HBSS溶液中清洗；剪开颅骨取出大脑，沿中线切成两个大脑半球，去除脑干、小脑、嗅球，剥除脑膜及海马；随后在HBSS中剪碎脑组织，吹打至组织块完全消散，加入2.5mL含量为0.03％胰蛋白酶，消化20min；

S3.2、在S3.1步骤的脑组织中加入DMEM/F12完全培养基终止消化，1200rpm离心4min后弃上清，沉淀物重悬于DMEM/F12完全培养基，静置35min，用差速贴壁法去除成纤维细胞，得到第二细胞悬液；

S3.3、将S3.2步骤所得的第二细胞悬液接种于第二细胞培养瓶，在39℃、7％CO

其中，第二细胞培养瓶的培养基为含1％青链霉素、10％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，其经过多聚L-赖氨酸处理；所述无血清培养基为含1％青链霉素的DMEM/F12高糖培养基；

S3.4、对S3.3步骤所得的细胞用NSE多克隆抗体进行免疫细胞化学染色，得到阳性率大于95％的神经元细胞；

S4、神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养：

S4.1、将15ng/mL LPS与S2.4步骤所得的小胶质细胞/巨噬细胞混合，随后与S1.4步骤所得的分选T细胞置于基底胶包被的Transwell小室中进行第一次共培养4天；

S4.2、在培养板中加入S3.4步骤得到的神经元细胞，第二次共培养4天。

一种上述神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法的应用，该构建方法用于体外实验研究TIM-4调控小胶质细胞/巨噬细胞参与脑缺血再灌注损伤的作用机制。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。