一株提升苜蓿品质的巨大芽孢杆菌、筛选方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及其应用技术领域，具体涉及一株提升苜蓿品质的巨大芽孢杆菌、筛选方法及其应用。

背景技术

随着生活水平的提高及消费观念的日益转变,人们对牛羊肉、禽蛋与奶产品等的需求显著提高；据报道，我国畜牧业持续快速发展，每年的草产品需求量超过 3260 万吨以上；另外，在牧区由于草原沙化、盐碱化、退化等导致贮草量减少，加之气候的异常造成水旱灾害的频繁发生，每年需要贮备抗灾保畜饲草几百万吨；因此，牧草在国内的需求非常大。苜蓿（

苜蓿一直被牧业作为奶牛的高营养粗饲料，是奶业生产的关键因素之一；依据粗蛋白和纤维素含量苜蓿可被分为一级，二级和优级品质；优级苜蓿在畜牧业和乳业中具有重要作用，除了可以提高奶牛产奶量、乳蛋白率、乳脂率外还能减少乳房炎、酸中毒等疾病的发病率从而降低奶牛淘汰率。但是目前我国仅有 20%的苜蓿为优级，大部分的优级苜蓿严重依赖进口；因此，高品质尤其是高蛋白质含量苜蓿的短缺目前已成为我国乳业发展的“卡脖子”环节。

围绕苜蓿品质提升这一科学问题很早就从多个方面开展了相关研究，基于此，发明人提出一株巨大芽孢杆菌及其应用，该菌株能够提高苜蓿粗蛋白含量，旨在促进苜蓿品质的提升。

发明内容

本发明目的在于提供一株提升苜蓿品质的巨大芽孢杆菌、筛选方法及其应用，该菌株的保藏编号为CGMCC NO.22296的巨大芽孢杆菌，分类命名：

上述巨大芽孢杆菌（

该菌株的生物学特征是：在LB固体平板培养基上菌落表面光滑，菌落前期乳白色后期淡黄色，边缘规整，单个排列，可形成芽孢。依据《Interantional Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology》对巨大芽孢杆菌（

表1 菌株TZ-1的生理生化测定结果

通过下述方法，可以分离的到具有能够提升苜蓿蛋白品质的菌株，本发明的巨大芽孢杆菌（

1、植株表面消毒

取1克紫花苜蓿地上部及根剪成段，首先用30mL 70%酒精洗10秒钟，再用30mL无菌水清洗10秒钟清洗植株表面残留的酒精；

2、加入30mL次氯酸钠原液进行二次表面消毒摇1分钟后迅速倒掉；

3、加入30mL无菌水摇10秒钟倒掉，重复五次洗净次氯酸钠；

4、将材料在超净工作台中倒入无菌打碎机磨碎至匀浆状态；

5、将匀浆进行10

6、将梯度稀释的匀浆吸取100微升，分别单独用刮筛涂布于LB平板（LB培养基）上，将平板放置到28℃恒温培养，直至长出单菌落。

本发明还提出一种还提供了上述巨大芽孢杆菌（

将筛选出的菌落进行纯化保存

1、将上一步获得的单菌落接种到新鲜的LB固体培养基上进行划线培养获得单菌落；

2、用灭菌牙签挑取单菌在新的LB培养基上划线，继续培养至有单菌落出现；

3、用接种环将单菌蘸取一点接菌到液体LB培养基中，200rpm摇动培养不超过12h，获得菌液；

4、吸取菌液900μl加入到盛有900μl40%甘油中菌种保存管中，拧紧盖后反复颠倒混匀保存至超低温冰箱。

本发明还提出一种还提供了上述巨大芽孢杆菌（

1、取田间土过5目筛,取40kg装入50 L底部钻孔的桶中，并浇足量水；

2、将苜蓿种子播种于上述土中，在温室中进行培养（2020年10月15日播种）；

3、待苜蓿出苗期（真叶伸出地表，2020年12月3日）进行菌液处理，将菌液活化接种至250 mL LB液体培养基中培养

s1：菌株活化

巨大芽孢杆菌的活化和培养，将冷冻保存的巨大芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，在28℃下培养18-22h得到所述活化菌株；所述的LB液体培养基组成如下：胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L; 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L; 氯化钠(NaCl) 10g/L; 另外根据经验值用NaOH调节该培养基的PH,使其达到7.0，121℃灭菌15min

s2：菌液制备

将活化的菌种离心后，加入适量的灭菌水，制备成菌体悬浮液(根据血球计数板法调整巨大芽孢杆菌菌个数为10

4、待苜蓿长至分枝期（2021年4月8日）进行刈割，留茬高度在5cm左右，105 ℃杀青30min，65℃48h烘干。

本发明提供的巨大芽孢杆菌具有下述的积极效果；

本发明通过植物内生菌对苜蓿品质的影响筛选出提高苜蓿品质等功能性强的巨大芽孢杆菌（

附图说明

图1是本发明利用杜马斯定氮仪测定粗蛋白含量的一次数据导出图。

图2是本发明利用杜马斯定氮仪测定粗蛋白含量的二次数据导出图。

图3是本发明利用ANKOM纤维分析仪测定酸性洗涤纤维ADF含量的原始数据导出图。

图4是本发明利用ANKOM纤维分析仪测定中性洗涤纤维NDF含量的原始数据导出图。

图5是本发明的草原三号杂花苜蓿粗蛋白含量分析。

图6是本发明的草原三号杂花苜蓿酸性洗涤纤维含量分析。

图7是本发明的草原三号杂花苜蓿中性洗涤纤维含量分析。

图8是利用盆栽体系以草原三号为材料进行菌的提质初筛试验。

图9是本发明的巨大芽孢杆菌（

图10是本发明的巨大芽孢杆菌（

图11是本发明的巨大芽孢杆菌（

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例只是说明性的，并不限制本发明的保护范围。

下面实施例中的实验方法，如无特别说明，均为本领域常规试验方法方法。

试验一，巨大芽孢杆菌（

实施例一，巨大芽孢杆菌（

菌液的制备

1、取1克苜蓿材料剪成段，首先用30 mL70%酒精洗10秒钟，再用30 mL无菌水清洗10秒钟倒掉；

2、加入30mL次氯酸钠原液表面消毒摇晃1分钟后迅速倒掉；

3、加入30mL无菌水摇晃10秒钟倒掉，重复五次洗净次氯酸钠；

4、将材料在超净工作台中倒入无菌打碎机磨碎至匀浆状态；

5、用移液器吸取1 mL匀浆，进行10

6、将梯度稀释的匀浆吸取100微升，分别单独用刮筛涂布于LB平板上，将平板放置到28℃培养，直至长出单菌落。

将筛选出的菌落进行纯化保存

1、将上一步获得的单菌落接种到新鲜的LB固体培养基上进行划线培养获得单菌落，菌落形态见图11，图11 为巨大芽孢杆菌（

2、用灭菌牙签挑取单菌在新的LB培养基上划线，继续培养至有单菌落出现；

3、用接种环将单菌蘸取一点接菌到液体LB培养基中，200rpm摇动培养不超过12h，获得菌液；

4、吸取菌液900μl加入到盛有900μl40%甘油中菌种保存管中，拧紧盖后反复颠倒混匀保存至超低温冰箱；

添加巨大芽孢杆菌（

将草原三号杂花苜蓿种子播种于田间土中，待苜蓿出苗期时，将保存的菌液活化接种至250mLLB液体培养基中培养，将活化的菌种离心后，加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含巨大芽孢杆菌活菌数在1x10

待苜蓿长至分枝期对苜蓿进行感官评定和表型分析并进行刈割见图9，留茬高度在5cm左右。

实施例二，灭菌蒸馏处理草原三号杂花苜蓿

将草原三号杂花苜蓿种子播种于土中，待苜蓿出苗期时喷洒同体积的灭菌蒸馏水。

待苜蓿长至分枝期对苜蓿进行感官评定和表型分析并进行刈割见图9，留茬高度在5cm左右。

结论验证

一、实物观测

如图9所示，AC是用巨大芽孢杆菌（

二、苜蓿品质检测：包括粗蛋白含量、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的测定。

粗蛋白含量测定：

将试验样品带回实验室后105 ℃高温杀青15min，65 ℃下烘干48 h，用球磨仪（德国 RetschMM400）粉碎后分别过40目和 100 目网筛，置于密封袋中备用；利用杜马斯定氮仪进行粗蛋白（Crude protein，CP）含量的测定；先用百万分之一天平（瑞士METTLERTOLEDOXP26）分别称取过100目筛待测样品45-50 mg包于锡箔中，制成锡箔片，置于自动进样器中；样品测试使用杜马斯定氮仪（德国GerhartDT-Dumatherm），首次检测数据见图2，1组数据为添加巨大芽孢杆菌TZ-1培育苜蓿中粗蛋白含量检测数据，2组数据为对照组中喷施灭菌蒸馏水培育苜蓿中,粗蛋白含量检测数据；第二次检测数据见图1，1-3组数据为添加巨大芽孢杆菌TZ-1培育苜蓿中粗蛋白含量检测数据，4-6组数据为对照组中喷施灭菌蒸馏水培育苜蓿中,粗蛋白含量检测数据；数据表明，培育苜蓿中添加巨大芽孢杆菌TZ-1后，粗蛋白含量明显高于对照组中未添加的粗蛋白含量，见图5，横坐标中ck代表对照组，喷施灭菌蒸馏水处理；TZ-1代表处理组，对草原三号杂花苜蓿进行喷施TZ-1菌液，纵坐标为上述四组数据的平均值。

酸性洗涤纤维含量的测定：

将试验样品带回实验室后105 ℃高温杀青15min，65 ℃下烘干48 h，经球磨仪研磨后，分别过40目和100目筛；利用ANKOM纤维分析仪测定酸性洗涤纤维（Acid detergentfiber，ADF）和中性洗涤纤维（Neutraldetergent fiber，NDF ）

称取0.5g左右的40目样品装入已知重量的F57滤袋中，密封之后放入样品架并置于消煮炉中，加入相应的1900—2000mL的酸性或者中性试剂，加热搅拌60 min 后将废液排掉。再加入1900—2000mL的热水（90—100℃）按下搅拌开关，盖好盖，冲洗滤袋3—5min。重复2次；将滤袋取出置于干净烧杯中，加入丙酮，使滤袋浸没；2—3min后拿出，轻轻挤出丙酮并晾干。然后在烘箱中105℃烘2—3小时，称重，利用ANKOM纤维分析仪测定酸性洗涤纤维（Acid detergent fiber，ADF）检测数据见图3；图6所示，横坐标中ck代表对照组，喷施灭菌蒸馏水处理；TZ-1代表处理组，对草原三号杂花苜蓿进行喷施TZ-1菌液，纵坐标为四组数据的平均值;培育苜蓿中添加巨大芽孢杆菌TZ-1培育的苜蓿中，酸性洗涤纤维含量低于对照组中未添加巨大芽孢杆菌TZ-1培育的苜蓿。

中性洗涤纤维含量的测定：

将试验样品带回实验室后105 ℃高温杀青15min，65 ℃下烘干48 h，经球磨仪研磨后，分别过40目和100目筛；利用ANKOM纤维分析仪测定中性洗涤纤维（Neutraldetergent fiber，NDF ）

称取0.5g左右的40目样品装入已知重量的F57滤袋中，密封之后放入样品架并置于消煮炉中，加入相应的1900—2000mL的酸性或者中性试剂，加热搅拌60 min 后将废液排掉。再加入1900—2000mL的热水（90—100℃）按下搅拌开关，盖好盖，冲洗滤袋3—5min。重复2次；将滤袋取出置于干净烧杯中，加入丙酮，使滤袋浸没；2—3min后拿出，轻轻挤出丙酮并晾干。然后在烘箱中105℃烘2—3小时，称重，利用ANKOM纤维分析仪测定中性洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF ）检测数据见图4，参见图7，横坐标中ck代表对照组，喷施灭菌蒸馏水处理；TZ-1代表处理组，对草原三号杂花苜蓿进行喷施TZ-1菌液，纵坐标为四组数据的平均值；培育苜蓿中添加巨大芽孢杆菌TZ-1培育的苜蓿中，中性洗涤纤维含量低于对照组中未添加巨大芽孢杆菌TZ-1培育的苜蓿。

试验二、巨大芽孢杆菌（

图10为巨大芽孢杆菌（

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。