用于分离外泌体的纳米材料及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于纳米材料合成以及外泌体分离技术领域，具体涉及一种用于分离外泌体的纳米材料、一种用于分离外泌体的纳米材料的制备方法以及一种纳米材料应用。

背景技术

外泌体是一种大小在30nm-150nm的囊泡，其几乎可以被所有的细胞分泌，包括动物和植物，真核生物和原核生物。它具有双层膜结构，在透射电镜下观察形貌为茶托型或中间凹陷的椭圆形。外泌体最早被认为是细胞代谢分泌的垃圾，并没有具体生理功能。但是随着科学家们的不断研究，发现其具有重要的生理功能，是细胞间交流的重要工具。

但是由于其尺寸太小，并且具有很高的异质性，其分离纯化具有很大的挑战。目前常用的分离方法有：(1)超速离心和密度梯度离心，这两种方法都需要大型的离心设备，而且一般需要10h以上，外泌体的收率在5％-25％，收率较低，超速离心分离的外泌体纯度中等，密度梯度离心得到的外泌体纯度很高，但是耗时更长，得率也会降低很多。(2)尺寸排阻法，这种方法的优点在于在不需要大型设备，且所需时间也短很多，一般而言，其分离得到的外泌体的产率和纯度比超速离心的要高。但是这种方法也不能分离和外泌体尺寸相近的颗粒，其特异性不高。(3)聚合物沉淀法，这种方法利用聚合物亲水的性质进行外泌体的沉降分离，有点是产率比较高一些，但是纯度差，因为会有聚合物的杂质存在，且特异性也不高。(4)微流控方法，这种方法需要的设备设计复杂，其通量小不利于大样本分离。

现有技术之一的中国专利申请CN108865971A提出一种外泌体的分离方法及其分离装置，此方法采用与外泌体尺寸大小对应的阳极氧化铝薄膜进行过滤。这种方法中有两个不足，第一、该方法无法分离与外泌体大小一样的杂蛋白，比如、低密度脂蛋白或者一些乳糜颗粒物等，特异性不高。第二、该装置中的过滤膜会发生堵塞的风险，需要定期清洗等，不够便捷。

现有技术之一的中国专利申请CN109576210A提出一种快速分离外泌体的方法，这种方法利用聚乙二醇为间隔合成超顺磁纳米颗粒与配体形成复合物，然后进行外泌体的捕获。但是这种颗粒复合物的合成较为复杂，捕获效率并不是很理想。

现有技术之一的中国专利申请CN110231207A提出一种分离外泌体的方法，这种方法与目前市场上PEG聚合物分离外泌体试剂盒类似，同样会得到很多非外泌体的杂蛋白，同时存在聚合物污染样品的问题，特异性低。

综上，由于外泌体的尺寸大小，同时具有很高的异质性。目前的分离方法存在纯度低，特异性低，或产率不高等缺点，针对此，本发明提出一种新型且便捷的用于分离外泌体的纳米材料及其制备方法、应用。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种用于分离外泌体的纳米材料及其制备方法、应用。

本发明的一方面，提供一种用于分离外泌体的纳米材料的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

获取纤维素纳米材料；

将链霉亲和素通过共价键偶联的方式固载到所述纤维素纳米材料上；

在固载有链霉亲和素的纤维素纳米材料中加入用于捕获外泌体的抗体，经反应后将抗体固载到所述纤维素纳米材料上，以得到用于分离外泌体的纳米材料。

可选的，所述获取纤维素纳米材料，包括：

利用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物氧化木质素，以得到所述纤维素纳米材料。

可选的，所述2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物的浓度范围为1.0％～2.0％，所述纤维素纳米材料中包含的羧基含量范围为1.2mmol/g～2.3mmol/g。

可选的，所述将链霉亲和素通过共价键偶联的方式固载到所述纤维素纳米材料上，包括：

在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基丁二酰亚胺的偶联反应下，所述纤维素纳米材料的羧基与链霉亲和素的氨基形成共价键，以使所述链霉亲和素固载到纤维素纳米材料上。

可选的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度范围为0.13mol/L～1.3mol/L；和/或，

所述N-羟基丁二酰亚胺的浓度范围为0.10mol/L～1.15mol/L；和/或，

所述链霉亲和素的浓度范围为100μg/mL～800μg/mL；和/或，

所述偶联反应的温度范围为4℃～25℃，所述偶联反应的时间范围为4h～48h。

可选的，所述抗体采用CD63、CD9、CD81、EpCAM、EGFR中的任一种；和/或，

所述抗体浓度范围为10μg/mL～40μg/mL；和/或，

链霉亲和素与抗体的反应时间范围为4h～6h，温度范围为2℃～10℃。

本发明的另一方面，提出一种用于分离外泌体的纳米材料，根据前文记载的所述的方法制得。

本发明的另一方面，提出一种用于分离外泌体的纳米材料的应用，采用前文记载的纳米材料应用于外泌体分离中。

可选的，所述外泌体分离的方法，包括下述步骤：

将固载有所述抗体的纳米材料加入到待分离的外泌体溶液中，经捕获后离心分离，所述待分离的外泌体被捕获至所述纳米材料上。

可选的，所述纳米材料的浓度范围为0.11g/mL～0.52g/mL；和/或，

所述捕获的时间范围为0.5h～4h。

本发明提出一种用于分离外泌体的纳米材料及其制备方法、应用，本发明利用纤维素纳米材料具有高比表面积和多修饰位点的优点，将外泌体特异性捕获抗体固载到纤维素纳米材料上，能够明显提高外泌体与捕获抗体接触的机会，在保证特异性的同时具有高的捕获效率，兼顾了特异性和产率，制备过程简单，对外泌体的分离效率较高，具有较高的产率，无需大型分离设备，操作简便，成本较低。

附图说明

图1为本发明一实施例的纳米材料制备方法的流程框图；

图2为本发明另一实施例的链霉亲和素与纤维素纳米纤维材料的偶联反应流程图；

图3为本发明另一实施例的偶联产物的红外表征图；

图4为本发明另一实施例的模型外泌体的透射电镜图；

图5为本发明另一实施例的模型外泌体的纳米颗粒追踪分析图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。

除非另外具体说明，本发明中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明中使用的“包括”或者“包含”等既不限定所提及的形状、数字、步骤、动作、操作、构件、原件和/或它们的组，也不排除出现或加入一个或多个其他不同的形状、数字、步骤、动作、操作、构件、原件和/或它们的组。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示技术特征的数量与顺序。

在发明的一些描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连接”、“相连”或者“固定”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是通过中间媒体间接连接，可以是两个元件内部的连通或者两个元件的互相作用关系。以及，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。

如图1所示，本发明的一方面，提出一种用于分离外泌体的纳米材料的制备方法S100，包括下述步骤S110～S130：

S110、获取纤维素纳米材料，具体包括：利用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物(TEMPO)氧化木质素，以得到纤维素纳米材料。

本实施例的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物的浓度范围为1.0％～2.0％，纤维素纳米材料中包含的羧基含量范围为1.2mmol/g～2.3mmol/g。

在一些优选实施例中，2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物的浓度范围可以进一步优选为1.0％-1.2％，纤维素纳米材料中包含的羧基含量范围可以进一步优选为1.3mmol/g～1.5mmol/g。

本实施例采用的纤维素纳米纤维材料具有很高的比表面积，同时具有很多可供修饰的官能团，例如，羧基和羟基，基于上述可修饰的官能团与链霉亲和素进行反应，以便于将外泌体特异性抗体固载到纤维素纳米材料上。

S120、将链霉亲和素通过共价键偶联的方式固载到纤维素纳米材料上，具体包括：

在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的偶联反应下，纤维素纳米材料的羧基与链霉亲和素的氨基形成共价键，以使链霉亲和素固载到纤维素纳米材料上，具体反应流程图如图2所示，以及偶联前后物质的红外结果如图3所示,其中，图2和图3中的TOCNF为TEMPO氧化的纤维素纳米材料，Streptavidin(SA)为链霉亲和素，TOCNF-SA为本实施例得到的固载有抗体的新型纳米材料,。

本实施例的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度范围为0.13mol/L～1.3mol/L，N-羟基丁二酰亚胺的浓度范围为0.10mol/L～1.15mol/L，链霉亲和素的浓度范围为100ug/mL～800ug/mL，偶联反应的温度范围为4℃～25℃，偶联反应的时间范围为4h～48h。

在一些优选实施例中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度可以进一步优选为0.26mol/L～0.52mol/L，N-羟基丁二酰亚胺的浓度可以进一步优选为0.20mol/L～0.69mol/L，链霉亲和素的浓度可以进一步优选为200ug/mL～450ug/mL，偶联反应的温度可以进一步优选为4℃～10℃，偶联反应的时间可以进一步优选为12h～24h。

本实施例纤维素纳米材料上的羧基官能团在EDC/NHS反应条件下被激活，然后与链霉亲和素上的氨基进行共价结合形成酰胺键共价键，以使得链霉亲和素被固载到纤维素纳米材料上。

需要说明的是，本发明人经过长期研究发现，偶联反应的条件对于分离外泌体的产率至关重要，若不控制好反应条件，链霉亲和素就有会出现结合不上或者产率特别低的情况，因此，本实施例经过一系列的条件筛选和优化，确定了最优的反应条件。

S130、在固载有链霉亲和素的纤维素纳米材料中加入用于捕获外泌体的抗体，经反应后将抗体固载到所述纳米材料上，以得到用于分离外泌体的纳米材料，即得到特异性捕获抗体修饰后的纤维纳米材料。

本实施例的抗体采用CD63、CD9、CD81、EpCAM、EGFR中的任一种，抗体浓度范围为10ug/mL～40ug/mL，链霉亲和素与抗体的反应时间范围为4h～6h，温度为2℃～10℃。

在一些优选实施例中，抗体浓度范围可以进一步优选为20ug/mL～30ug/mL。

本实施例通过将生物素化的抗体固载到纤维素纳米材料上，以用于捕获外泌体，即实现外泌体的分离。

本发明形成的纳米材料具有高比表面积和多修饰位点的优点，将外泌体特异性捕获抗体固载到纳米材料上，能够明显提高外泌体与捕获抗体接触的机会，在保证特异性的同时具有高的捕获效率，兼顾了特异性和产率，可以克服现有外泌体分离技术中需要大型设备、分离效率低等缺陷，而且分离成本低，简便有效。

本发明的另一方面，提出一种用于分离外泌体的纳米材料，采用前文记载的方法制得，具体制备过程请参考前文记载，在此不再赘述。

本发明得到的纳米材料可对外泌体进行高效分离，具有特异性好，捕获效率高的特点，无需使用大型设备。

本发明的另一方面，提供一种用于分离外泌体的纳米材料的应用，将前文记载的纳米材料应用于外泌体分离中。

具体地，采用本发明纳米材料对外泌体分离的方法包括下述步骤：

将固载有抗体的纳米材料加入到待分离外泌体溶液中，以对待分离外泌体(该外泌体的电镜图如图4所示)进行捕获，之后，经孵育后离心分离，待分离外泌体被捕获至纳米材料上，捕获外泌体的纤维纳米材料会聚集在试管底部，同时本实施例可利用捕获前后，外泌体颗粒浓度的变化来评估捕获条件优化，对于外泌体的纳米颗粒追踪结果如图5所示。

本实施例用于捕获待分离外泌体的纳米材料的浓度范围为0.11g/mL～0.52g/mL，捕获时间范围为0.5-4h。

在一些优选实施例中，用于捕获待分离外泌体的纳米材料的浓度可以进一步优选为0.12g/mL～0.24g/mL，捕获时间可以进一步优选为1h～2.5h。

需要说明的是，本实施例的外泌体可采用下述步骤形成：

第一、先用全培养基(DMEM培养基)培养细胞，当繁殖密度为60％-70％左右，用1X磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3遍，换成无外泌体的血清继续培养48h，然后收集培养基；

第二、先用低转速将死细胞和细胞碎片去除掉，然后用0.2um的滤膜过滤备用，作为预处理的细胞培养上清液，里面含有大囊泡和小囊泡；

第三、使用100KDa的超滤管进行浓缩，浓缩至上样体积为1mL；然后利用SEC分离柱进行分离得到模型外泌体(该模型外泌体的透射电镜结果如图4所示)，用于平台方法的验证。

需要说明的是，本实施例所使用的细胞系为癌细胞，可以为乳腺癌细胞系(如MDA-MB-231，MCF-7)，肺癌细胞系(如H1299，A549)的一种。

本发明使用上述得到修饰后的纳米材料用于细胞培养上清液中的外泌体捕获，可实外泌体的现高效分离，具有特异性好，捕获效率高的特点。

下面将结合几个具体实施例进一步说明纳米材料的制备方法以及具体应用：

实施例1

本示例中纤维素纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

第一、经偶联反应将链霉亲和素固载到纤维素纳米材料上：称取固含量为1.07％的TEMPO氧化的纤维素纳米纤维2.82g放入一个15mL的离心管中，然后加入0.26M的EDC溶液2mL，同时加入0.23M的NHS溶液2.26mL，先室温反应30min，然后加入400ug/mL的链霉亲和素，将上述反应溶液置于4℃下反应48h。反应结束后，用PBS离心3次，将未反应完全的试剂除去。清除完毕后，取一部分冷冻干燥，用于红外表征(反应过程见图2)。

第二、抗体固载到纤维素纳米材料上：得上述得到的纤维素纳米材料0.24g，加入500μL的20μg/mL的生物素化的CD63抗体，在4℃反应2h后，离心除去未反应完全的抗体，以得到用于分离外泌体的纳米材料。

实施例2

本实施例提出一种纳米材料的应用，具体过程如下：

将实施例1得到的固载有抗体的纳米材料加入到2mL外泌体溶液中(该外泌体溶液用PBS稀释)，在4℃反应1h。反应结束后，通过离心分离，捕获外泌体的纳米材料将会沉到底部。此时通过上清液中外泌体的颗粒浓度(用NTA测试)与反应前后的颗粒浓度进行计算捕获率为83.3％。

实施例3

本实施例提出一种纳米材料的应用，具体过程如下：

将实施例1得到的固载有抗体的纳米材料加入到2mL外泌体溶液中(用PBS稀释)，在4℃反应2.5h。反应结束后，通过离心分离，捕获外泌体的纳米材料将会沉到底部。此时通过上清液中外泌体的颗粒浓度(用NTA测试)与反应前后的颗粒浓度进行计算捕获率为86.5％。

实施例4

本实施例提出一种纳米材料的应用，具体过程如下：

将实施例1得到的固载有抗体的纳米材料加入到1mL外泌体溶液中(用PBS稀释)，在4℃反应1h。反应结束后，通过离心分离，捕获外泌体的纳米材料将会沉到底部。此时通过上清液中外泌体的颗粒浓度(用NTA测试)与反应前后的颗粒浓度进行计算捕获率为82.7％。

实施例5

本实施例提出一种纳米材料的应用，具体过程如下：

将实施例1得到的固载有抗体的纳米材料加入到1mL外泌体溶液中(用PBS稀释)，在4℃反应2h。反应结束后，通过离心分离，捕获外泌体的纳米材料将会沉到底部。此时通过上清液中外泌体的颗粒浓度(用NTA测试)与反应前后的颗粒浓度进行计算捕获率为84.7％。

本发明提出一种用于分离外泌体的纳米材料及其制备方法、应用，具有以下有益效果：

第一、利用纳米材料具有高比表面积和多修饰位点的优点，将外泌体特异性捕获抗体固载到纳米材料上，能够明显提高外泌体与捕获抗体接触的机会，在保证特异性的同时具有高的捕获效率，兼顾了特异性和产率。

第二、本发明的分离方法无需大型的分离设备，同时相比昂贵的外泌体分离试剂盒，成本低，操作简洁便利。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。