一种生物炭基菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种生物炭基菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

多溴联苯醚，作为一类溴化阻燃剂被广泛应用于电器、家具等产品中。但多溴联苯醚也是一种典型持久性有机污染物，通常具有高毒性、环境持久性和生物累积性。常见的多溴联苯醚有十溴联苯醚和2,2’,4,4’-四溴联苯醚，但2,2’,4,4’-四溴联苯醚的毒性更大。而在实际电子垃圾拆解区的土壤污染情况较为复杂，一般主要包括多溴联苯醚和重金属污染物。因此，探究如何高效、绿色修复土壤多溴联苯醚-重金属复合污染已成为研究热点。

微生物修复法，因具有成本低、对土壤扰动小、环境友好等优点，成为优于传统物理和化学修复过程的选择方法。然而，针对多溴联苯醚-重金属复合污染土壤，含单独的微生物菌剂存在生存能力弱的技术问题，从而导致难以修复复合污染的土壤。而含有多种微生物的菌剂，其由于细菌种类多，所需培养的营养物质也多，其驯化和培养成本相对较高。

因此，亟需开发一种在含2,2’,4,4’-四溴联苯醚污染物环境生存一段时间的微生物，并以此开发研究一种低成本、绿色环保、能同时高效处理溴联苯醚-重金属复合污染土壤的微生物菌剂。

发明内容

为了克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种生物炭基菌剂及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种生物炭基菌剂，所述生物炭基菌剂包括能够降解多溴联苯醚的变形假单胞菌和辅剂，所述辅剂包括生物炭；能够降解多溴联苯醚的变形假单胞菌附着辅剂的表面或分散于辅剂中。

优选地，所述辅剂还包括溶剂、微生物保护剂。

具体地，所述溶剂和微生物保护剂是为了保护微生物活力的物质。

优选地，所述能够降解多溴联苯醚的变形假单胞菌的分类学命名为Pseudomonasplecoglossicida，于2022年08月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO:62739。

优选地，所述能够降解多溴联苯醚的变形假单胞菌为革兰氏阴性细菌。

优选地，所述能够降解多溴联苯醚的变形假单胞菌的菌落形状为圆形，边缘整齐，菌落光滑湿润，呈淡黄色。

优选地，具体地，本发明中的QS-1菌株(即Pseudomonas plecoglossicida QS-1)于2022年08月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO:62739，分类学命名为Pseudomonas plecoglossicida。

优选地，所述变形假单胞菌的获得方法包括以下步骤：

1)将复合污染土壤接种到无机培养基中，经富集培养，得到原始混合菌液；

2)将步骤1)中的原始混合菌液接种到第1代的无机盐培养基，经培养，得到第1代培养后的混合菌液；

将第1代培养后的混合菌液接种到第2代的无机盐培养基，经培养，得到第2代培养后的混合菌液；

以此类推，重复此步骤，将上一代得到的混合菌液接种至四溴联苯醚浓度更高的下一代无机培养基中，得到第n次培养后的混合菌液；

3)将步骤2)中的第n代培养后的混合菌液经分离、纯化，得到单一的变形假单胞菌株；

其中，步骤2)中的n为正整数，且n≥3。

具体地，所述变形假单胞菌即能够降解四溴联苯醚的变形假单胞菌。

优选地，在步骤2)中的连续两代混合菌液的培养过程中，并控制下一代的无机培养液中的四溴联苯醚浓度比上一代无机培养液要高0.1mg/kg～1mg/kg。

优选地，步骤2)中的无机培养基均包括降解四溴联苯醚；步骤2)中第1代的无机盐培养基中的四溴联苯醚浓度为0.1mg/kg～1mg/kg。

优选地，步骤1)中的复合污染土壤为广东省清远市龙塘镇杨屋村(经度23.5481°N,纬度113.0465°E)的电子垃圾污染土壤，且所述污染土壤中的四溴联苯醚含量为0.01ng/g～0.86ng/g。

优选地，步骤1)和步骤2)中的无机培养基均为液体的无机培养基，且溶剂为水。

进一步优选地，步骤1)和步骤2)中的无机培养基均包括以下组分：1g/L(NH

优选地，步骤1)中的无机培养基的pH值为6.5-7.5。

优选地，步骤1)和步骤2)中的培养均为振荡培养，且培养在温度为25℃～35℃、转速为150rpm～170rpm的条件下进行的。

优选地，步骤1)中的培养天数为25～35天。

优选地，步骤2)中的每一代的培养天数为6～8天。

优选地，步骤2)中的n的取值范围为：10≤n≤15。

进一步优选地，步骤2)中的n＝10，且第10代的无机盐培养基中的四溴联苯醚浓度为10mg/L。

第二方面，本发明提供第一方面所述生物炭菌剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

将第一方面所述变形假单胞菌接种于含生物炭的培养基中孵育1 4h～20h，即得生物炭基菌剂。

优选地，所述生物炭基菌剂中的有效活菌数为3.0×10

进一步优选地，所述生物炭基菌剂中的有效活菌数为3.5×10

优选地，所述生物炭为植物热解后得到的生物炭，所述植物选自水葫芦、蒲公英、椰子中的一种或多种。

进一步优选地，所述生物炭为植物热解后得到的生物炭，所述植物选自水葫芦的茎、叶中的一种或多种。

优选地，所述热解的温度为350℃～650℃。

优选地，所述热解的时间为2h～3h。

优选地，所述生物炭基菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将第一方面所述变形假单胞菌接种于营养培养基，经培养，得到活化菌液；

将植物热解得到生物炭后，再将生物炭和营养培养基混合，得到含生物炭的营养培养基；

2)将步骤1)中的活化菌液接种于含生物炭的营养培养基，经培养，得到生物炭基菌剂。

优选地，步骤1)中的营养培养基是由水和营养物质混合而成，所述营养培养基中的营养物质包括以下组分：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，该培养基的pH值为7.2。

优选地，步骤1)中的活化菌液的OD

优选地，步骤1)中的活化菌液的OD

优选地，步骤1)还包括离心、用磷酸盐缓冲对溶液重悬的步骤。

优选地，所述离心的转速为4000rpm～8000rpm，且所述离心的时间为3min～10min。

优选地，步骤1)所述培养的时间为8h～12h。

优选地，步骤1)所述生物炭为植物炭，且所述植物选自水葫芦、莲花、蒲公英、椰子中的一种或多种。

优选地，所述植物经过自然风干处理。

优选地，步骤1)所述热解的温度为350℃～650℃。

优选地，步骤1)所述热解的时间为2h～3h。

优选地，步骤1)还包括过筛的操作，且使用的筛子为100～200目。

优选地，步骤1)中的营养培养基中生物炭的添加量为50g/L～100g/L。

优选地，按体积分数计，步骤2)中的接种量为0.5％～1.5％。

进一步优选地，按体积分数计，步骤2)中的接种量为1.0％。

具体地，以接种量为1.0％为例，所述接种量为1.0％的意思是1mL活化菌液加入100mL营养培养基。

优选地，步骤2)所述培养的时间为14h～20h。

进一步优选地，步骤2)所述培养的时间为16h～18h。

优选地，步骤1)和步骤2)中的培养均为振荡培养，且所述振荡培养是在温度为25～35℃、转速为120～180r/min的条件下进行。

优选地，步骤2)还包括用滤网捞出、冲洗、干燥的步骤。

优选地，步骤2)所述干燥为冷冻真空干燥或自然风干。

第三方面，本发明提供第二方面所述制备方法制得的生物炭基菌剂在修复污染介质中的应用。

第四方面，本发明还提供一种修复污染介质的方法，包括以下步骤：向污染介质加入第二方面所述方法制得的生物炭基菌剂，混匀即可起到修复作用。

优选地，所述污染介质为污染水体或污染土壤，且污染介质中含有多溴联苯醚和重金属。

优选地，当所述污染介质为污染土壤时，需要保持污染土壤的持水量为10％～60％。

优选地，所述污染介质中的多溴联苯醚含量为0.1mg/kg～1.5mg/kg。

进一步优选地，所述污染介质中的多溴联苯醚含量为0.5mg/kg～0.8mg/kg。

优选地，所述多溴联苯醚为十溴联苯醚、四溴联苯醚中的一种或多种。

进一步优选地，所述多溴联苯醚为2,2’,4,4’-四溴联苯醚。

优选地，所述重金属包括：铅和铜。

优选地，所述铅的含量为150mg/kg～450mg/kg。

优选地，所述铜的含量为150mg/kg～450mg/kg。

优选地，所述生物炭基菌剂的质量和污染介质质量之比为10g/kg～30g/kg。

优选地，所述修复的时间为15～100天。

进一步优选地，所述修复的时间为45～90天。

本发明的有益效果是：本发明不仅提供一种Pseudomonas plecoglossicida属菌种Pseudomonas plecoglossicida QS-1，该菌株为为革兰氏阴性，而且制得含有生物炭的生物炭基菌剂具有有效修复多溴联苯醚和重金属复合污染的环境的优势。具体为：

(1)本发明以生物炭为载体，将多溴联苯醚降解菌固定在生物炭上，可高效降解复合污染土壤中的多溴联苯醚，同时促进土壤中多溴联苯醚向结合态转变，降低残余污染物的生态风险；

(2)本发明以水葫芦作为模板热解得到的生物炭不仅可以有效固定土壤中重金属，从而缓解了重金属对多溴联苯醚降解菌的毒性胁迫，还提高了微生物进入土壤后的生存能力；

(3)相较于单独的微生物菌液，在土壤中14天后已基本失去对多溴联苯醚降解活性，而本发明提供的生物炭基菌剂(即生物炭基菌剂)在60天内仍具备较好的降解效果，保持了多溴联苯醚降解菌在土壤中的生物活性。

附图说明

图1为本发明中的Pseudomonas plecoglossicida QS-1的系统发育树。

图2为实施例2中的生物炭基菌剂的SEM图。

图3为高效液相色谱法测试BDE-47的标准曲线图。

图4为实施例2、实施例3、实施例4制备的生物炭基菌剂对水体中BDE-47的降解图。

图5为实施例6中的生物炭、菌液和生物炭基菌剂对土壤中BDE-47的降解曲线图。

图6为实施例6中的生物炭、菌液和生物炭基菌剂对土壤中BDE-47的形态分布影响图。

图7为实施例6中的生物炭、菌液和生物炭基菌剂对土壤中Cu的钝化效果测试结果图。

图8为实施例6中的生物炭、菌液和生物炭基菌剂对土壤中Pb的钝化效果测试结果图。

图9为实施例6中的生物炭、菌液和生物炭基菌剂对土壤中Cu的形态分布影响图。

图10为实施例6中的生物炭、菌液和生物炭基菌剂对土壤中Pb的形态分布影响图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

如无特殊说明，本发明中使用固体或液体培养基均经过灭菌处理。

实施例1

本实施例提供一种能够降解四溴联苯醚菌株的富集培养、纯化、筛选及鉴定的方法，其包括以下步骤：

(1)材料的准备：

营养培养基为各种营养物质加入水中混合制得，且营养培养基包括以下组分：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，该培养基的pH值为7.2；

无机盐培养基为微量元素化合物加入水中混合均匀得到溶液，在无机盐培养基中，各物质的浓度为：1g/L(NH

微量元素溶液为微量元素化合物加入水中混合均匀得到溶液；在微量元素溶液中，各物质的浓度为：4g/L MgSO

含2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)的无机盐培养基为将2,2’,4,4’-四溴联苯醚加入上述无机盐培养基混合均匀得到的液体培养基。除了2,2’,4,4’-四溴联苯醚之外，在含2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)的无机盐培养基中各物质浓度与无机盐培养基相同。

磷酸盐缓冲液为将磷酸盐缓冲对加入水中混合均匀得到的溶液，在该磷酸盐缓冲液中，各物质的浓度为：1.5g/L KH

(2)变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida QS-1菌株富集筛选与培养：

将10g广东省清远市一电子废物拆解场地土壤样品(地址：广东省清远市龙塘镇杨屋村，经度：经度23.5481°N，纬度：113.0465°E)接种到100mL含2mg/L BDE-47的无机盐培养基(已灭菌)中，再置于温度为30℃、转速为160rpm的恒温摇床上，摇床振荡富集培养30天，获得原始混合菌液；

然后，将原始混合菌液接种于含1mg/L BDE-47的无机盐培养基中(接种量：10mL混合菌液/90mL无机培养液)，继续10代连续富集培养(30℃，转速为160rpm)；在连续富集培养的过程中控制每7天传代一次，每传代一次无机盐培养基中的BDE-47浓度提高1mg/L(第10代的含BDE-47的无机盐培养基中BDE-47浓度为10mg/L)，每传一代菌种的接种量为10mL混合菌液/90mL无机培养液；富集培养完成后得到10代富集培养后的混合菌液。

(3)变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida QS-1菌株的分离纯化、筛选与保存：

采用稀释梯度法、平板涂布法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快、形态不同的菌落，通过高效液相色谱法检测菌株对BDE-47的降解能力、分离得到的对BDE-47具有降解活性的纯种菌株，即获得变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida QS-1菌株(即能够降解四溴联苯醚的变形假单胞菌)。

将菌株接种到固体斜面培养基上，保存于4℃冰箱中，得到含目标菌株的培养基(待后续实验)，其中，固体斜面培养基是由以下营养物质和水混合得到的固体，在固体斜面培养基中的各成分浓度为：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，20g/L琼脂；该培养基的pH值为7.2。

(4)变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida QS-1菌株的形态学和分子生物学鉴定：

首先，对菌株的形态学特征进行了初步的观察，结果表明：该菌生物学特征为革兰氏阴性菌，在固体培养基上菌落为圆形，边缘整齐，菌落光滑湿润，呈淡黄色。

随后，使用市售核酸提取试剂盒从菌株中提取基因组DNA，利用16S rDNA对菌株进行测序，并将所得序列在NCBI官网中进行BLAST分析，用MEG A.11.0软件，采用邻近-连接(Neighbor-joining)构建进化树(如图1所示)。

通过比较其同源序列和Blast分析可知：该菌株与变形假单胞菌属同源性高达99.9％。结合形态分析结果，可以确定菌株为变形假单胞菌，将其命名为Pseudomonasplecoglossicida QS-1。

发明人将上述Pseudomonas plecoglossicida QS-1(分类学命名为Pseudomonasplecoglossicida)保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏时间为2022年8月25，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:62739。

实施例2

本实施例提供一种生物炭基菌剂的制备方法，其包括以下步骤：

1)将实施例1中的含目标菌株的培养基从冰箱取出，挑取Pseudomonasplecoglossicida QS-1菌落接种于营养培养基中，再置于温度为30℃、转速为160r/min的条件下振荡培养10h，然后以6000rpm转速离心5min，用无菌的磷酸盐缓冲液冲洗3次，再次用无菌的磷酸盐缓冲液重悬，制成OD

2)将风干的水葫芦的茎、叶粉碎后置于陶瓷坩埚中，压实后盖上盖子，再放入马弗炉中在400℃条件下热解2h，经冷却至室温后取出过100目筛，获得的生物炭材料；

3)将步骤1)中的OD

其中，步骤3)中的含有生物炭材料的营养培养基为液体培养基，且含有生物炭材料的营养培养基中的生物炭材料含量为80g/L。

取1#生物炭基菌剂进行计数，发现本实施例制备的1#生物炭基菌剂中负载菌的量约为4.2×10

本实施例中的1#生物炭基菌剂的扫描电镜(Scanning Electron Microscope，SEM)图，如图2所示。

由图2可知：以风干的水葫芦热解得到的载体生物炭表面明显具有丰富的多孔结构，大量的Pseudomonas plecoglossicida菌株附着在生物炭材料的表面和孔道结构中，表明生物炭可以为菌体提供较大的寄居空间，维持菌株正常生理代谢。

实施例3

本实施例提供一种生物炭基菌剂的制备方法，其与实施例2的区别仅在于：本实施例采用500℃的热解温度制得生物炭和生物炭菌剂中的负载菌量不同，其包括以下步骤：

1)将实施例1中的含目标菌株的培养基从冰箱取出，挑取Pseudomonasplecoglossicida QS-1菌落接种于营养培养基中，再置于温度为30℃、转速为160r/min的条件下振荡培养10h，然后以6000rpm转速离心5min，用无菌的磷酸盐缓冲液冲洗3次，再次用无菌的磷酸盐缓冲液重悬，制成OD

2)风干的水葫芦的茎、叶粉碎后置于陶瓷坩埚中，压实后盖上盖子，再放入马弗炉中在500℃条件下热解2h，经冷却至室温后取出过100目筛，获得的生物炭材料；

3)将步骤1)中的OD

其中，步骤3)中的含有生物炭材料的营养培养基为液体培养基，且含有生物炭材料的营养培养基中的生物炭材料含量为80g/L。

取2#生物炭基菌剂进行计数，发现本实施例制备的2#生物炭基菌剂中负载菌的量约为4.4×10

实施例4

本实施例提供一种生物炭基菌剂的制备方法，其与实施例2的区别仅在于：本实施例采用600℃的热解温度制得生物炭和生物炭菌剂中的负载菌量不同，其包括以下步骤：

1)将实施例1中的含目标菌株的培养基从冰箱取出，挑取Pseudomonasplecoglossicida QS-1菌落接种于营养培养基中，再置于温度为30℃、转速为160r/min的条件下振荡培养10h，然后以6000rpm转速离心5min，用无菌的磷酸盐缓冲液冲洗3次，再次用无菌的磷酸盐缓冲液重悬，制成OD

2)风干的水葫芦的茎、叶粉碎后置于陶瓷坩埚中，压实后盖上盖子，再放入马弗炉中在600℃条件下热解2h，经冷却至室温后取出过100目筛，获得的生物炭材料；

3)将步骤1)中的OD

其中，步骤3)中的含有生物炭材料的营养培养基为液体培养基，且含有生物炭材料的无机盐培养基中的生物炭材料含量为80g/L。

取3#生物炭基菌剂进行计数，发现本实施例制备的3#生物炭基菌剂中负载菌的量大约为4.9×10

实施例5

本实施例是实施例2～4制备的1#、2#、3#生物炭基菌剂对水体中BDE-47降解性能的测定，其测定方法包括以下步骤：

1)BDE-47的标准曲线：配制浓度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的BDE-47标准溶液，并用高效液相色的测试不同浓度的BDE-47标准溶，再以BDE-47浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标绘制标准曲线，如图3所示；

2)将1#、2#、3#生物炭菌剂分别按1g/L量接种含0.5mg/L BDE-47的无机盐培养基中，然后将样品置于恒温振荡培养箱(30℃，160r/min)中培养7天，使用高效液相色谱法和步骤1)中的标准曲线检测和分析培养基溶液中的BDE-47浓度；

3)处理7天后，同样采用高效液相色谱法测定1#、2#、3#生物炭基菌剂实验组最终BDE-47浓度，3组实验组的最终BDE-47浓度分别为0.195mg/L、0.216mg/L、0.247mg/L；经分析可知：1#、2#、3#生物炭基菌剂对水体中BDE-47降解率分别为61.1％、56.8％、50.7％；

其中，步骤2)中的无机盐培养基与实施例1中的无机培养基相同；步骤1)、步骤2)和步骤3)中的高效液相色谱法检测BDE-47的分析条件如下：色谱柱：C18(250mm×4.6mm，岛津)；流动相：体积比为90％甲醇：10％超纯水；流速：1mL/min；柱温箱：30℃；检测器：SPD-20A；波长：235nm；进样量：20μL。

由图3可知：以BDE-47浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标绘制标准曲线为y＝40437x-215.31，相关系数R

实施例2、实施例3、实施例4制备的1#、2#、3#生物炭基菌剂对水体中BDE-47降解性能，如图4所示。

由图4和测定的结果可知：采用400℃热解制备得生物炭材料(实施例2中的生物炭基菌剂)更适于作为菌株的载体来制备生物炭菌剂。

实施例6

本实施例比较生物炭、菌液和生物炭基菌剂对土壤中BDE-47的降解效果。具体试验方法包括以下步骤：

1)将20g生物炭基菌剂、20g生物炭和200mL微生物菌液分别作为土壤修复剂加入至1kg多溴联苯醚-重金属(Cu和Pb)复合污染土壤(BDE-47、Cu和Pb的含量分别为0.71mg/kg、206.4mg/kg和382.3mg/kg)中，得到3组实验组，分别为生物炭基菌剂组、生物炭组、微生物菌液组(即菌液组)；

以不添加土壤修复剂的多溴联苯醚-重金属复合污染土壤(BDE-47、Cu和Pb的含量分别为0.71mg/kg、206.4mg/kg和382.3mg/kg)作为空白对照组；

2)调节并保持步骤1)中的实验组、空白对照组的土壤含水量为田间土壤最大持水量的60％，处理总共90天，选取0天、7天、15天、30天、45天、60天、90天为定时采集土壤样品的时间，取5g土壤样品作为待测样品；

3)参考本发明实施例5所述高效液相色谱法测定步骤2)中的待测的液体样品的BDE-47含量，并通过计算分析得到实验组和对照组土壤中的BDE-47含量变化趋势图，如图5所示；

其中，步骤1)中的生物炭基菌剂和生物炭的添加量为20g/kg；

步骤1)中的微生物菌液的活菌的的添加量为200mL菌液/1kg土壤；

同时，进一步检测各实验组处理后的土壤中不同BDE-47赋存形态含量，具体包括以下步骤：

1)溶解态BDE-47提取：取2g土壤样品放入150mL三角瓶中，加入0.2g Tenax-TA树脂(规格和型号：60～80目，厂家：北京北仪铭科科技有限公司)和50mL纯水，然后将样品置于振荡培养箱中振荡24h，得到溶解态提取后的土壤和含溶解态BDE-47的Tenax-TA树脂；

分离并用纯水清洗含溶解态BDE-47的Tenax-TA树脂，10mL正己烷超声提取15min，提取三次，得到含溶解态BDE-47的提取液；

将提取液置于旋转蒸发仪上蒸干后用甲醇定容至10mL，得到含溶解态的BDE-47样品(待测)。

2)吸附态BDE-47提取：步骤1)中的溶解态提取后的土壤置于40℃烘箱烘干后，再加入20mL正己烷和二氯甲烷混合溶液(正己烷和二氯甲烷的体积比为1:1，v/v)超声提取15min，提取三次，得到含吸附态BDE-47的提取液和溶解态提取后的土壤；

含吸附态BDE-47的提取液在旋转蒸发仪上浓缩至10mL后，经固相萃取柱(即SPE柱，规格和型号：Florisil，6mL；厂家：天津博纳艾杰尔科技有限公司)净化，最后氮气吹干、甲醇定容至10mL，得到含吸附态BDE-47样品(待测)。

3)结合态BDE-47提取：溶解态提取后的土壤在40℃烘箱烘干后，再置于50mL离心管中，加入10mL浓度为1mol/L的NaOH，并置于温度为80℃的水浴中保温2h，得到混合物；

将混合物经-50℃冷冻干燥24h后，向其加入20mL正己烷和二氯甲烷混合溶液(正己烷和二氯甲烷的体积比为1:1，v/v)超声提取15min，提取三次，得到含有结合态BDE-47的提取液和提取BDE-47后的土壤；

将含有结合态BDE-47的提取液置于旋转蒸发仪上浓缩至10mL后，再经固相萃取柱(即SPE柱，规格和型号：Florisil，6mL；厂家：天津博纳艾杰尔科技有限公司)净化，氮气吹干、甲醇定容至10mL，得到含结合态BDE-47的样品(待测)；

4)将步骤1)中的含溶解态的BDE-47样品、步骤2)中的含吸附态BDE-47样品、步骤3)中的含结合态BDE-47的样品采用实施例5所述高效液相色谱法测定这三种样品中的BDE-47的样品，并通过计算和数据处理得到土壤中不同BDE-47赋存形态含量的检测结果，其检测结果如图6所示；

其中，步骤1)中的土壤为本实施例中实验组和空白对照组的土壤样品，设置其土壤为定时采样，并设置采集处理时间为0天、7天、15天、30天、45天、60天、90天的样品土壤样品。

由图5可知：随着处理时间的增加，空白对照组(即对照组)和生物炭组的土壤中BDE-47的含量变化规律相似度高(即土壤中的BDE-47的含量基本没有减少)，说明生物炭对于土壤中的BDE-47没有影响。与对照组相比，在处理时间为0～15天的时候，随着处理时间的增加，微生物菌液组的土壤中的BDE-47含量从约0.72mg/kg下降至约0.64mg/kg(土壤中的BDE-47的降解率约为11.1％)；处理14天后微生物菌液组的土壤中的BDE-47含量基本不再下降，说明微生物菌液已基本失去对多溴联苯醚降解活性；这说明微生物菌液对土壤中BDE-47是具有去除效果，但其去除的效果是有限的。

与对照组相比，在处理时间为0～15天的时候，随着处理时间的增加，生物炭基菌剂组的土壤中的BDE-47含量从约0.72mg/kg下降至约0.54mg/kg(土壤中的BDE-47的降解率约为25.0％)；处理14天后微生物菌液组的土壤中的BDE-47含量仍能够进一步降低，直至90天土壤中的BDE-47含量能够降低至0.41mg/kg(降解率约为43.1％)。而且，从土壤中的BDE-47含量的变化曲线来看，生物炭基菌剂组在60天内都能维持一个较快的BDE-47降解速率，其降解效果较好，说明菌剂能在60天内保持良好的降解BDE-47的活性。

此外，通过比较生物炭基菌剂组和生物炭组的数据，可以得出生物炭基菌剂能够延长了微生物的存活时间，从而较好地、较长时间地保持了微生物的降解BDE-47的活性。

由图6可知：通过监测不同处理时间不同组别土壤中BDE-47赋存形态情况，可以发现生物炭菌剂还能促进了土壤中BDE-47赋存形态的转变。在对照组和菌液组中，随着处理时间的增加，两组土壤中溶解态BDE-47的百分比都有一定程度的下降，对照组下降了6.5％，菌液组下降了10.5％。而在生物炭组和生物炭基菌剂组中，溶解态BDE-47的百分比大幅降低了，分别下降了26.7％和32.7％，再结合图5可知生物炭处理对土壤中BDE-47的总含量没有明显的影响，因此，生物炭组的溶解态BDE-47百分比的降低是生物炭促进了土壤中的BDE-47从溶解态向吸附态转变造成的结果。

生物炭菌剂组中BDE-47溶解态百分比的降低由微生物降解和土壤中BDE-47赋存形态转化共同驱动的。一般来说，土壤中结合态的BDE-47的生物利用度有限，故将溶解态和吸附态的BDE-47转化为结合态的BDE-47被视为一种有效降低土壤毒性的途径(即解毒途径)。在生物炭菌剂组90天的处理过程中，BDE-47溶解态的百分比从36.2％降低至3.5％，BDE-47吸附态的百分比从36.9％增加至48.1％，从BDE-47结合态的百分比从26.9％增加到48.4％，可见生物炭菌剂组的总体趋势是由溶解态的BDE-47主要向结合态的BDE-47转化。综上，这些结果说明了本发明实施例提供了生物炭菌剂的优点，即它不仅通过生物降解降低BDE-47的总含量，而且还可以促进其它形态的BDE-47向结合态转化，以此达到大幅度降低土壤中残留的BDE-47的生态风险。

此外，本实施例通过石墨消解-火焰原子吸收法测定在不同时间处理阶段实施例6的实验组和对照组土壤的Cu含量和Pb含量。

本实施例测定了Cu和Pb含量，其测试土壤中Cu和Pb含量的方法包括以下步骤：

1)称取0.2g土壤样品，依次加入6ml硝酸，3ml高氯酸，置于聚四氟乙烯消解管中，放在石墨消解仪上于180℃消解；

2)持续消解至消解管内剩余液体体积小于0.5ml，且液体呈透明或者浅黄绿透明色时，样品消解完成，将处理完样品分别过滤、稀释、定容；

3)样品中的Cu和Pb含量统一用火焰原子吸收光谱仪测定含量。

本实施例对土壤中Cu、Pb的各形态含量采用改进的BCR提取法进行分离测定，包括以下步骤：

1)弱酸提取态：称取1g土壤样品于50mL离心管中，加入40mL 0.11mol/L醋酸提取液，在室温下震荡16h后，离心分离，上清液过滤、定容后待测；

2)可还原态：步骤1)中残余物中加入40mL，0.5mol/L NH

3)可氧化态：步骤2)中残余物中加入10mL H

4)残渣态：称取步骤3)中残余物0.5g，置于聚四氟乙烯消解管中，采用石墨消解法消解样品，消解方法同上述土壤消解方法；

5)所有形态的Cu和Pb含量统一用火焰原子吸收光谱仪测定含量。

本实施例测定了实施例6在不同多溴联苯醚-重金属复合污染土壤处理阶段中DTPA(二乙基三胺五乙酸)提取态Cu含量和Pb含量，其测试结果分别如图7和图8所示。

由图7和图8可知：通过比较对照组和菌液组，发现菌液对土壤中的DTPA提取态Cu含量和Pb的含量没有显著的影响。通过比较对照组、生物炭组和生物炭基菌剂组DTPA提取态Cu含量和Pb含量的变化规律，在处理时间0到15天的时候，生物炭和生物炭基菌剂可以使土壤中DTPA提取态Cu和Pb的含量快速降低；在15～60天的处理过程中，随着处理时间的增加，生物炭和生物炭基菌剂两组的土壤中DTPA提取态Cu和Pb的含量均在逐渐降低。在处理时间为90天时，生物炭菌剂对多溴联苯醚-重金属复合污染土壤中Cu和Pb的钝化效果分别为50.1％和38.9％，生物炭对多溴联苯醚-重金属复合污染土壤中Cu和Pb的钝化效果分别为51.5％和40.6％，说明生物炭基菌剂对土壤中Cu和Pb的钝化主要归因于生物炭的作用。

本实施例测定了实施例6在处理90天时土壤中Cu和Pb的存在形态分布，测试结果分别如图9和图10所示。

由图9和图10可知：生物炭基菌剂处理组中Cu和Pb的形态由高生物有效性的弱酸可提取态向低生物有效性的可氧化态、可还原态以及残渣态转变。这些结果表明生物炭作为生物炭基菌剂的载体可以通过固定土壤中重金属，从而降低其对生物炭基菌剂毒性胁迫，保持生物炭基菌剂的生物降解活性。

综上可知，本发明的生物炭基菌剂能够有效的降解复合污染土壤中BDE-47，同时可以显著降低土壤中有效态Cu和Pb的含量，实现了多溴联苯醚-重金属复合污染土壤的高效修复。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。