一种将离体肾脏组织解离成单细胞悬液的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种将肾脏组织分离成单细胞悬液的方法。

背景技术

近年来，随着生物医学研究的发展和进步，单细胞测序技术应运而生。其中最为热门的当属单细胞转录组测序(scRNA-seq)的研究，它能够在单细胞水平上揭示组织或器官中不同细胞的特性和相互联系，解答之前全转录组高通量测序技术掩盖了的细胞之间的异质性问题。与传统高通量测序相比，单细胞测序技术精度更高，单次获得的基因数据量更大，结合现阶段生物信息学分析算法，统计学理论，将单细胞组学数据进行分析、整合和可视化，能最大限度的还原生物完整性从而了解生物学进程(如疾病)的详细情况，使得这些数据可以更有效地为广大科研共同体服务。

现如今单细胞测序技术已被广泛应用于精准医学研究。如针对重大慢性疾病，绘制疾病的单细胞多组学信息图谱，发现新型的异质细胞亚群、特定功能的细胞群及基因，揭示重要疾病的发生发展机理；发现疾病新的治疗靶点，药物治疗效果的评估工作；开发多维度组学的超灵敏、高通量、高特异性的精准分子诊断方法，用于重大疾病快速检测、诊断等。单细胞的制备是进行单细胞测序的前提条件，也是实验的关键部分。因此，申请人经反复实验探索及充分验证后研发出一项制备人肾脏组织单细胞悬液的关键技术。该项技术属于生物实验制备技术，主要用于各种肾脏疾病的单细胞相关研究。

发明内容

本发明的目的是探索一种可用于后续单细胞转录组测序的人肾脏单细胞悬液制备方法。为实现上述目的，本发明通过大量的预实验，筛选出效果较好的以胰蛋白酶和胶原酶共同消化肾脏组织，并对操作方法、各种酶成分浓度、酶的消化时间等进行了探索，获得了一种高效的人肾脏单细胞悬液制备方法，具体提供如下技术方案。

一种将离体肾脏组织解离成单细胞悬液的方法，包括以下步骤：

步骤一，将新鲜离体肾脏组织样本切碎成肾脏组织小块；

步骤二，向肾脏组织小块中加入酶I，混匀孵育初步消化，去除酶I，所述酶I为胰蛋白酶消化液；

步骤三，向经酶I消化后的肾脏组织小块中加入酶II，混匀孵育消化，所述酶II为含有中性蛋白酶、II型胶原酶、IV型胶原酶、DNase I和CaCl

步骤四，将消化后的细胞-酶II混合液过滤得细胞悬液，将预冷FBS加入细胞悬液中，离心去上清，加入红细胞裂解液重悬细胞沉淀，混匀后裂解；

步骤五，将裂解后的细胞悬液离心后去上清，加入DPBS溶液离心清洗获得纯化后的肾脏细胞，重悬备用。

进一步地，所述步骤一中新鲜离体肾脏样本来源于人的肾脏组织；

步骤一中详细过程包括：新鲜离体肾脏组织样本用DPBS清洗2次，滴加少量HBSS培养基使肾脏组织样本保持湿润，用预冷的刀片切碎成0.8-1.2mm

进一步地，所述步骤二中详细过程包括：向肾脏组织小块中加入酶I，混匀后置于37℃水平摇床上孵育初步消化10-20min，摇床设置为50rpm/min；然后210g离心5min，去除酶I。

进一步地，所述酶I为含有质量分数0.25％胰蛋白酶的HBSS培养基。

进一步地，所述酶II为含有中性蛋白酶0.2mg/mL、II型胶原酶1～3mg/mL、IV型胶原酶1～3mg/mL、DNase I 0.1mg/mL和CaCl

进一步地，所述酶II为含有中性蛋白酶0.2mg/mL、II型胶原酶2mg/mL、IV型胶原酶2mg/mL、DNase I 0.1mg/mL和CaCl

进一步地，所述步骤三中详细过程包括：向经酶I消化后的肾脏组织小块中加入预热到37℃的酶Ⅱ，混匀后置于37℃摇床上二次孵育消化15-25min，摇床转速设置为50rpm/min，消化过程中需每隔5～8分钟吸吹混匀一次。

进一步地，所述步骤四中的详细过程包括：将消化后的细胞-酶II混合液用40μm的细胞筛过滤至新的50mL离心管中得到细胞悬液，然后将预冷的FBS加入细胞悬液中，使其终浓度为体积分数10％，细胞悬液于500g，4℃条件下离心5min后去上清，加入5mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，混匀后冰上裂解5min。

进一步地，所述步骤五中将裂解后的细胞悬液于500g，4℃离心5min后去上清，加入15-20mL DPBS溶液重悬以300g，4℃离心清洗纯化，纯化后的肾脏细胞可重悬于含质量分数0.01％BSA的DPBS溶液中置于冰上备用。

本发明还提供一种应用于将离体肾脏组织解离成单细胞悬液的试剂盒，试剂盒包括酶Ⅰ、酶Ⅱ、FBS、红细胞裂解液、含质量分数0.01％BSA的DPBS溶液。

本发明的优点包括：操作简便，无需特殊仪器设备，可于短时间内获得足够分散、高产量、高活性、背景干净、形态好的肾脏单细胞；且经AOPI染色后检测活性，采用本发明制备的肾脏单细胞活率可高达89.3％，适用于单细胞转录组精准测序，结合后续的生物信息学分析可以了解与肾脏相关疾病发生发展进程中单个细胞水平的变化，从而有利于推动肾脏领域的精准医疗进程。

附图说明

图1为采用AOPI染色后全自动细胞计数仪检测肾脏单细胞悬液结果图，其中左侧为明场图，展示获得的所有细胞，右侧为荧光图，绿色光点表示活细胞；

图2为是否使用酶I进行初次酶解对制备肾脏单细胞悬液影响的统计图；

图3为采用酶II消化时间不同对制备肾脏单细胞悬液影响的统计图。

具体实施方式

为了更加清楚地理解本发明的技术方案，下面将结合附图说明和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述。需要说明的是，本文所述实施例是以本发明的技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于所述实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明内容更加透彻全面。

本发明提供了一种肾脏组织单细胞悬液制备方法，步骤如下：

步骤一，取新鲜肾脏离体组织样本置于培养皿中，用DPBS清洗2次，滴加少量HBSS培养基保持肾脏组织样本湿润并用预冷的刀片切碎成1mm

具体地，新鲜肾脏样本来源于人或小鼠或猴子的肾脏组织。

步骤二，向肾脏组织小块中加入酶I，混匀后置于37℃水平摇床上初步消化20min，摇床转速设置为50rpm/min；然后将样品210g离心5min，用移液枪吸去酶I；

具体地，酶I为含有质量分数0.25％胰蛋白酶的HBSS培养基。

步骤三，向经酶I消化后的肾脏组织小块中加入预先在37℃水浴锅中预热了10min的酶II，混匀后置于37℃摇床上孵育消化15-25min，摇床转速设置为50rpm/min，每隔5～8分钟用巴氏吸管吸吹混匀一次以使样本与酶II增加表面积接触，从而充分消化；

具体地，酶II为含有中性蛋白酶0.2mg/mL、II型胶原酶1～3mg/mL、IV型胶原酶1～3mg/mL、DNase I 0.1mg/mL和CaCl

步骤四，将消化后的细胞-酶II混合液用40μm的细胞筛过滤至新的50mL离心管中得到细胞悬液，然后将预冷的FBS加入细胞悬液中，使其终浓度为(V/V)10％，样品500g，4℃条件下离心5min后去上清，加入5mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，混匀后冰上裂解5min；

步骤五，将裂解后的细胞悬液500g，4℃离心5min后去上清，加入15-20mL DPBS溶液以300g，4℃离心清洗纯化，纯化后的肾脏细胞可重悬于含质量分数0.01％BSA的DPBS溶液中置于冰上备用。

是否进行上述步骤二使用酶I对样本进行初次消化、混合酶液酶II中不同酶的含量以及消化时间等对肾脏单细胞的产量、分散情况、活力均具有不同程度的影响。以下结合具体实施例详细说明。

单细胞活率及产量的检测：取10μL单细胞悬液与AOPI染色液以1:1体积混匀后，采用全自动细胞计数仪(Nexcelom cellmeter anto2000)检测细胞活率及产量。

实施例1酶II中不同成分浓度对制备单细胞悬液的影响

将新鲜肾脏离体组织参考上述步骤一～五制备单细胞悬液，三管为一组进行重复，分为七组，酶II为含有中性蛋白酶0.2mg/mL、II型胶原酶1～3mg/mL、IV型胶原酶1～3mg/mL、DNase I 0.1mg/mL和CaCl

表1

基于上述表1结果可知，采用含有中性蛋白酶0.2mg/mL、II型胶原酶2mg/mL、IV型胶原酶2mg/mL、DNase I 0.1mg/mL和CaCl

实施例2是否使用酶I对样本进行初次酶解对制备单细胞悬液的影响

将新鲜肾脏离体组织按上述步骤一切碎成1mm

如图2结果所示，经酶I处理的酶I处理组获得的肾脏单细胞产量显著高于未经酶I处理的非处理组，同时酶I处理组的细胞活率也显著高于未处理组。

实施例3使用酶Ⅱ的消化时间对制备单细胞悬液的影响

将新鲜肾脏离体组织参考上述步骤一～五制备单细胞悬液，三管为一组进行重复，分为三组，每组在步骤三过程中均采用实施例1中所述最适浓度的酶II，各组消化时间分别为15min、20min和25min，每隔5min用巴氏吸管吸吹混匀一次，制备出的单细胞悬液，采用与实施例1中相同方法对细胞活率和产量进行检测，结果见图3。

如图3结果所示，采用酶II消化时间分别为15min、20min和25min时，当消化时间为20min时产量最高，但各组间单细胞产量无明显差异；不同消化时间获得的细胞活率不同，其中消化时间为25min时细胞活率最低，消化时间为15和20min组别获得的细胞活率均显著高于25min组，故本发明在利用酶II进行消化时，采用20min的消化时长制备肾脏单细胞悬液，用于后续的10×Genomics单细胞测序上机实验。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。