一种降低qPCR非特异性扩增的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种降低qPCR非特异性扩增的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加；而实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量。影响一步法qPCR试剂扩增性能很重要的一点就在于引物二聚体的大量积累消耗的大量引物，从而导致性能损失。引物二聚体由相互匹配的引物对被聚合酶识别，进而造成大量非特异性扩增，形成许多彼此杂交的引物分子。

全预混反应液指包含引物探针的一步法全预混反应液，其中包含DNA聚合酶、反应所需引物探针及其他qPCR扩增反应所需原料的反应液，可在添加待测样本后立即进行检测反应。在全预混反应液中，由于除模板靶标外全部组分均存在于体系中，引物对之间一旦互搭即可被延伸扩增，特别是经历过长时间保存或经高温加压后，有充分的时间互搭为二聚体。由于引物二聚体普遍较短，这些延伸产物一旦形成，在后续PCR扩增阶段就会非常高效的进行扩增，作为非靶标模板与靶标竞争，导致试剂功能损失。

已有报道多种方式来减少引物二聚体的形成，如对Taq酶进行封闭达到热启动效果、优化PCR反应条件、使用修饰性引物等。Stephen G.Will等(Biology Methods andProtocols,2017,1-10)报道了一种引物共价修饰的方法，如脱氧腺苷的外环胺或引物3’端胞嘧啶残基的烷基，可以提高PCR扩增的特异性，并提高PCR结束时特异性扩增产物的产量，当两种引物在各自的3’端进行修饰时，非靶标产物的扩增减少最为明显。这种方式实际上是在引物3’末端碱基添加修饰基团，增大碱基互补配对时的空间位阻，从而减少引物3’匹配时形成引物二聚体的概率。然而这种方式需要对引物进行修饰，极大增加了引物合成的成本，此外，引物3’末端碱基的修饰不仅降低了引物自身互搭结合的概率，一定程度上也降低了引物与靶标退火匹配的概率，降低了引物扩增效率。

美国专利US5792607A和US20140329245A1公开了一种减少引物二聚体的方法，首先将引物3’端进行修饰封闭，反应进行时再利用内切酶IV切除引物的不可延伸3’末端，从而在特异性引物-模板杂交后激活引物。Dobosy等(BMC Biotechnol.11:80,2011)展示了一种依赖RNase H的PCR(rhPCR)方法，同样使用RNaseH切除引物3'末端的单个RNA碱基，从而在特异性引物-模板杂交后激活引物。但是这些减少引物二聚体的方法都需要对引物进行修饰，并且在体系中添加用于引物激活的额外酶，这不仅大幅提高成本，而且增加了反应复杂性。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种降低全预混qPCR非特异性扩增的方法，该方法通过向qPCR全预混反应液中加入吐温-20，能够有效减少全预混体系中引物二聚体的形成，进而降低非特异性扩增，提高扩增活性。

本申请的第一方面提供一种降低qPCR非特异性扩增的方法，所述方法包括：(1)提供包含缓冲物质、dNTPs、金属盐、DNA聚合酶、吐温、引物、探针和/或荧光染料的全预混反应液；

(2)加入核酸模板；

(3)在合适的条件下进行qPCR扩增反应。

在一些实施方案中，所述吐温是吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-41、吐温-60、吐温-61、吐温-80、吐温-81和吐温-85中的任意一种或多种，优选地，所述吐温是吐温-20。

在一些实施方案中，所述吐温-20在全预混反应液中的体积分数是0.01％-10％，优选0.02％-8％，更优选0.03％-7％，更优选0.04％-6％，最优选0.05％-5％，包括所述范围内的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％和10％。

在一些实施方案中，所述金属盐是Mg

在一些实施方案中，所述金属盐包括Mg

在一些实施方案中，所述金属盐还包括KAC，所述KAC在全预混反应液中的浓度是60-80mmol/L，包括所述范围内的60mmol/L，61mmol/L，62mmol/L，63mmol/L，64mmol/L，65mmol/L，66mmol/L，67mmol/L，68mmol/L，69mmol/L，70mmol/L，72mmol/L，75mmol/L，78mmol/L，80mmol/L。

在一些实施方案中，所述引物包含至少一对上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物在全预混反应液中的浓度是0.2-0.5μmol/L，包括所述范围内的0.2μmol/L，0.3μmol/L，0.4μmol/L和0.5μmol/L。

在一些实施方案中，所述探针是TaqMan探针，所述TaqMan探针在全预混反应液中的浓度是0.1-0.5μmol/L，包括所述范围内的0.1μmol/L，0.2μmol/L，0.3μmol/L，0.4μmol/L和0.5μmol/L。所述TaqMan探针包括5’端标记的报告荧光基团(Reporter)和3’端标记的淬灭荧光基团(Quencher)；所述报告荧光基团是例如FAM、VIC、HEX或TET，所述淬灭荧光基团是例如BHQ1、TAMRA、MGB。

在一些实施方案中，所述反应预混液还包括荧光定量PCR参比染料。

在一些实施方案中，所述荧光染料是SYBRGreen或EvaGreenTM，优选SYBRGreen。

在一些实施方案中，所述DNA聚合酶是耐热DNA聚合酶，优选TaqDNA聚合酶，所述TaqDNA聚合酶在全预混反应液中的浓度是0.1-1U/μL，包括所述范围内的0.1U/μL，0.2U/μL，0.3U/μL，0.4U/μL，0.5U/μL，0.6U/μL，0.7U/μL，0.8U/μL，0.9U/μL和1U/μL。

在一些实施方案中，所述核酸模板是DNA模板。

在一些实施方案中，所述核酸模板是RNA模板，当所述核酸模板是RNA时，所述反应组合物还包括逆转录酶，所述逆转录酶是具有RNA指导的DNA聚合酶活性的逆转录酶，如MMLV、HIV或AMV，优选MMLV逆转录酶，更优选地，所述MMLV逆转录酶在全预混反应液中的浓度是0.1-1U/μL，包括所述范围内的0.1U/μL，0.2U/μL，0.3U/μL，0.4U/μL，0.5U/μL，0.6U/μL，0.7U/μL，0.8U/μL，0.9U/μL和1U/μL。

在一些实施方案中，所述缓冲物质包括Tris、Tris-HCl、Tris碱或HEPES中的一种或多种，优选Tris，更优选地，所述Tris在全预混反应液中的浓度是50-100mmol/L，包括所述范围内的50mmol/L，55mmol/L，60mmol/L，62mmol/L，65mmol/L，66mmol/L，67mmol/L，68mmol/L，70mmol/L，72mmol/L，75mmol/L，78mmol/L，80mmol/L，82mmol/L，85mmol/L，88mmol/L，90mmol/L，92mmol/L，95mmol/L，98mmol/L和100mmol/L。

在一些实施方案中，所述dNTPs在全预混反应液中的浓度是0.1-1mmol/L，包括所述范围内的0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.3mmol/L，0.4mmol/L，0.5mmol/L，0.6mmol/L，0.7mmol/L，0.8mmol/L，0.9mmol/L和1mmol/L。

在一些实施方案中，所述qPCR扩增反应包括预变性和循环反应；所述预变性的温度是90-98℃，例如92-96℃，例如95℃温育20s-60s，例如25s-40s，例如30s；所述循环反应包括95℃变性8-12s，在55-65℃退火并延伸10-30s，共40-50个循环。

在一些实施方案中，当所述核酸模板是RNA时，所述qPCR扩增反应是RT(Reversetranscription)-qPCR扩增反应/逆转录qPCR，所述RT-qPCR扩增反应包括逆转录、预变性和循环反应；所述逆转录的温度是50-60℃，例如52-58℃，例如55℃温育10-20min，例如12-18min，例如15min；所述预变性的温度是90-98℃，例如92-96℃，例如95℃温育20s-60s，例如25s-40s，例如30s；所述循环反应包括95℃变性8-12s，在55-65℃退火并延伸10-30s，共40-50个循环。

本申请的第二方面提供吐温-20在降低qPCR体系的非特异性扩增中的用途。

在一些实施方案中，所述qPCR体系是全预混qPCR体系。

在一些实施方案中，所述qPCR体系是全预混RT(Reverse transcription)-qPCR体系。

在一些实施方案中，所述吐温-20在qPCR体系中的体积分数是0.01％-10％，优选0.02％-8％，更优选0.03％-7％，更优选0.04％-6％，最优选0.05％-5％，包括所述范围内的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％和10％。

在一些实施方案中，所述降低qPCR体系的非特异性扩增是指qPCR扩增产物凝胶电泳图中没有非特异扩增产物条带，或非特异扩增产物条带弱；所述非特异扩增产物条带的大小与目标扩增产物的设计大小不相同。

在一些实施方案中，所述降低qPCR体系的非特异性扩增是指qPCR扩增产物的熔解曲线只有一条主峰，不会出现双峰或多峰，或指所述双峰或多峰中的非特异性扩增产物峰减弱。

本申请的第三方面提供吐温20在降低qPCR体系的引物二聚体中的用途。

在一些实施方案中，所述qPCR体系是全预混qPCR体系。

在一些实施方案中，所述qPCR体系是全预混RT(Reverse transcription)-qPCR体系。

在一些实施方案中，所述吐温-20在qPCR体系中的体积分数是0.01％-10％，优选0.02％-8％，更优选0.03％-7％，更优选0.04％-6％，最优选0.05％-5％，包括所述范围内的0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％和10％。

在一些实施方案中，所述降低qPCR体系的引物二聚体是指qPCR扩增产物凝胶电泳图中没有引物二聚体条带，或引物二聚体条带弱；所述引物二聚体条带的大小与目标扩增产物的设计大小不相同。

在一些实施方案中，所述降低qPCR体系的引物二聚体是指qPCR扩增产物的熔解曲线只有一条主峰，不会出现双峰或多峰；或指所述双峰或多峰中的引物二聚体峰减弱。

本申请的第四方面提供一种qPCR全预混反应组合物，所述反应组合物包括缓冲物质、dNTPs、金属盐、DNA聚合酶、0.01％-10％体积分数的吐温-20、上下游引物和Taqman探针；任选地，所述qPCR全预混反应组合物还包括逆转录酶。

在一些实施方案中，所述缓冲物质包括50-100mmol/L Tris，所述dNTPs的浓度是0.1-1mmol/L，所述金属盐包括2-10mmol/L MgCl

在一些实施方案中，所述缓冲物质包括50-70mmol/L Tris，所述dNTPs的浓度是0.1-0.5mmol/L，所述金属盐包括2-6mmol/L的MgCl

在一些实施方案中，所述反应组合物包括67mmol/L的Tris、0.4mmol/L的dNTPs、5mmol/L的MgCl

本申请的第五方面提供一种qPCR全预混反应组合物，所述反应组合物包括缓冲物质、dNTPs、金属盐、DNA聚合酶、0.01％-10％体积分数的吐温-20、上下游引物和SYBR Green荧光染料；任选地，所述qPCR全预混反应组合物还包括逆转录酶。

在一些实施方案中，所述缓冲物质包括50-100mmol/L Tris，所述dNTPs的浓度是0.1-1mmol/L，所述金属盐包括2-10mmol/L MgCl

在一些实施方案中，所述缓冲物质包括50-70mmol/L Tris，所述dNTPs的浓度是0.1-0.5mmol/L，所述金属盐包括2-6mmol/L MgCl

在一些实施方案中，所述反应组合物包括67mmol/L的Tris、0.4mmol/L的dNTPs、5mmol/L的MgCl

本申请的第六方面提供一种qPCR扩增试剂盒，所述试剂盒包括第四方面和/或第五方面所述的qPCR全预混反应组合物。

本申请中的吐温20浓度均指体积分数，例如，全预混反应液终浓度为0.1％的吐温-20指15μL的全预混反应体系中含有0.015μL的吐温-20。

术语解释

吐温-20：聚山梨酯20，主干结构式如下：

实时荧光定量PCR：又称RT(Real-Time)-qPCR，可简写为qPCR。是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量。

全预混反应液：是指包含引物探针/染料的一步法全预混反应液，其中包含DNA聚合酶、反应所需引物探针及其他PCR扩增反应所需原料的反应液，可在添加待测样本后立即进行检测反应。

非特异性扩增：PCR反应过程以靶特异性扩增为主的同时存在非特异性扩增，后者的存在不仅仅能通过消耗反应体系中的原料而干扰把特异性扩增的灵敏度而且引起的非特异性扩增会导致假阳性结果的错误判断，例如来自引物-引物互为模板、引物与模板非特异性结合引起的非目的产物的扩增。

引物二聚体：一对引物或者引物自身的3’端部分碱基互补结合，在聚合酶的作用下从3’末端延伸所形成的小分子量的双链DNA片段。

附图说明

图1A：-20℃和37℃保存7天对H-09基因的全预混RT-qPCR(分别添加0.1％和0％吐温-20)扩增曲线的影响；

图1B：-20℃和37℃保存7天对M-51基因的全预混RT-qPCR(分别添加0.1％和0％吐温-20)扩增曲线的影响；

图2A：样本投入量是1ng时，添加不同浓度吐温-20对M-52基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图2B：样本投入量是100pg时，添加不同浓度吐温-20对M-52基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图2C：样本投入量是10pg时，添加不同浓度吐温-20对M-52基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图3A：样本投入量是1ng时，添加不同浓度吐温-20对M-54基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图3B：样本投入量是100pg时，添加不同浓度吐温-20对M-54基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图3C：样本投入量是10pg时，添加不同浓度吐温-20对M-54基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图4A：样本投入量是1ng时，添加不同浓度吐温-20对M-5基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图4B：样本投入量是100pg时，添加不同浓度吐温-20对M-5基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图4C：样本投入量是10pg时，添加不同浓度吐温-20对M-5基因的全预混RT-qPCR扩增曲线的影响；

图5：M-52、M-54和M-5基因的全预混RT-qPCR扩增产物凝胶电泳图；

图6A：H-01基因的全预混RT-qPCR扩增产物熔解曲线图；

图6B：H-07基因的全预混RT-qPCR扩增产物熔解曲线图；

图6C：H-19基因的全预混RT-qPCR扩增产物熔解曲线图；

图6D：H-31基因的全预混RT-qPCR扩增产物熔解曲线图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。

实施例中的Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号P122的Champagne Taq DNA Polymerase，Reverse Transcriptase(逆转录酶)来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号R021的M-MLV(H-)ReverseTranscriptase，吐温-20购自sigma公司(Lot#WXBD1913V，CASNO.9005-64-5)。

实施例1

1、样本制备

使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司

2、引物设计

根据人源(DCT，XM_017020401.3)基因序列、小鼠(Ncor2，XM_030254302.1)基因序列，设计qPCR引物探针，具体序列见表1。

表1：实施例1中人源、鼠源靶标qPCR引物探针序列(方向：5'-3')

其中，H系列序列名称为人源基因靶标，M系列序列名称为小鼠基因靶标。

3、全预混反应液配制及扩增

按照表2配制RT-qPCR全预混扩增反应液，其中5×扩增体系为：Tris(250mmol/L)、KAC(250mmol/L)、KCl(100mmol/L)、dNTPs(1.5mmol/L)、MgCl

表2：RT-qPCR全预混体系

按照表2配制两组H-09基因的RT-qPCR全预混反应液，其中第一组中不加吐温-20，第二组加吐温-20至反应液终浓度为0.1％(体积分数，下同)，两组各配制两份，第一份放置-20℃保存7天作为对照组，另一份放置37℃保存7天(模拟长期储存条件)作为实验组。

分别向-20℃和37℃处理后的H-09基因全预混反应液中分别加入人源和鼠源RNA样本，其中人源RNA样本投入量为100pg(5μL)，鼠源RNA样本投入量为100pg(5μL)，按照表3反应程序进行人源或鼠源靶标RT-qPCR扩增实验，扩增曲线如图1A所示。

按照表2配制两组M-51基因的RT-qPCR全预混反应液，后续处理方法同H-09基因的RT-qPCR全预混反应液，扩增曲线如图1B所示。

表3：RT-qPCR反应程序

4、结果分析

H-09基因的RT-qPCR扩增曲线如图1A所示，M-51基因的RT-qPCR扩增曲线如图1B所示。可以看出，37℃处理显著影响了全预混试剂的扩增性能，而向该全预混试剂中添加终浓度为0.1％的吐温-20后，扩增曲线的平台保留得到显著的提升，扩增效率显著提高。

实施例2

1、样本制备与实施例1一致。

2、引物设计

根据小鼠(Ncor2，XM_030254302.1/Zbtb20，NM_001393397.1/Chd7，XM_006538005.5)基因序列，设计qPCR引物探针，具体序列见表4。

表4：实施例2中鼠源靶标qPCR引物探针序列(方向：5'-3')

其中，M系列序列名称为小鼠基因靶标。

3、全预混反应液配制及扩增

按照表5配制RT-qPCR全预混扩增反应液，其中5×扩增体系为：Tris(250mmol/L)、KAC(250mmol/L)、KCl(100mmol/L)、dNTPs(1.5mmol/L)、MgCl

表5：RT-qPCR全预混体系

按照表5配制6组M-52基因的RT-qPCR全预混反应液，每组各配制两份，其中第一组不加吐温-20，作为对照组；第二组至第六组分别添加吐温-20至反应液终浓度为5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％，作为实验组；将对照组和实验组放置在37℃保存7d处理。

分别向处理后的对照组和实验组的M-52基因的全预混反应液中加入鼠源RNA样本，样本投入量分别为1ng(5μL)、100pg(5μL)和10pg(5μL)，按照表3反应程序进行鼠源靶标RT-qPCR扩增实验，扩增曲线如图2A(1ng)、图2B(100pg)和图2C(10pg)所示。

选择对照组和实验组中吐温-20终浓度为0.05％、0.1％的M-52基因全预混反应液扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳胶图如图5所示。

按照表5配制6组M-54基因的RT-qPCR全预混反应液，后续处理及实验方法同M-52基因的RT-qPCR全预混反应液，得到扩增曲线如图3A-C所示，电泳胶图如图5所示。

按照表5配制6组M-5基因的RT-qPCR全预混反应液，后续处理及实验方法同M-52基因的RT-qPCR全预混反应液，得到扩增曲线如图4A-C所示，电泳胶图如图5所示。

4、结果分析

图2-4分别对应M-52、M-54和M-5基因的全预混反应液，在添加不同终浓度吐温-20并置于37℃保存7天后的RT-qPCR扩增曲线。结果显示，与对照组相比，添加0.05％-5％的吐温-20均能够提高全预混反应液经37℃保存7天后的平台保留，其中又以终浓度为0.05％和0.1％的吐温-20效果最佳，说明吐温-20有利于提高全预混反应液的扩增性能。

如图5所示，与未添加吐温-20的全预混qPCR扩增反应相比，添加终浓度为0.05％-0.1％的吐温-20的反应扩增产物较为单一，说明在全预混qPCR反应液中添加吐温-20显著降低了引物二聚体的形成，促使更多引物用于靶标的特异性扩增，缓解了因长期保存带来的引物消耗问题。

实施例3

1、样本制备与实施例1一致。

2、引物设计

根据人源(FMR1，NM_001185076.2/MYC，NM_002467.6/B2M，NM_004048.4/GUSB，XM_047420289.1)基因序列，设计qPCR引物探针，具体序列见表6。

表6：实施例3中人源靶标qPCR引物探针序列(方向：5'-3')

其中，H系列序列名称为人源基因靶标。

3、全预混反应液配制及扩增

按照表7配制RT-qPCR全预混扩增反应液，其中5×扩增体系为：Tris(250mmol/L)、KAC(250mmol/L)、KCl(100mmol/L)、dNTPs(1.5mmol/L)、MgCl

表7：RT-qPCR全预混体系

按照表7配制两组H-01基因的RT-qPCR全预混反应液，两组各配制两份，其中第一组不加吐温-20，作为对照组；第二组加吐温-20至反应液终浓度为0.1％，作为实验组；将对照组和实验组放置在37℃保存7d处理。

分别向处理后的对照组和实验组的H-01基因全预混反应液加入人源RNA样本，样本投入量为100pg(5μL)，按照表8反应程序进行人源靶标染料法RT-qPCR检测，得到熔解曲线如图6A所示。

H-07、H-19和H-31基因的RT-qPCR全预混反应液的配制以及后续反应方法同H-01基因，得到熔解曲线分别如图6B、图6C和图6D所示。

表8：染料法RT-qPCR反应程序

4、结果分析

如图6A-D所示，在不同基因的全预混qPCR扩增体系中添加终浓度为0.1％的吐温-20，并进行37℃处理后，扩增产物中非靶标扩增的引物二聚体峰显著降低，可见在全预混反应液中添加终浓度为0.1％的吐温-20能够缓解反应体系中引物二聚体的形成，保护引物探针不被消耗，进而减少非特异性扩增。