一种微生物发酵制备小分子肽的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵制备小分子肽的方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

豆粕是重要的蛋白质原料之一，其中的大豆蛋白是植物性食物中氨基酸组成比例最合理的一种蛋白质，但是大豆蛋白质分子结构复杂，分子量较大（80%的大豆蛋白分子量均在10万Da以上），并且其溶解性低，消化率与生物效价远不及鱼粉等动物源性蛋白质等问题，所以近年来通过微生物发酵法降解大豆蛋白生产小分子肽，以提高大豆蛋白的营养价值及其加工特性的研究已近成为热点。

固态发酵生产小分子肽具有能耗低和污染低的优势，在全世界范围内受到重视，豆粕中含有较高的粗蛋白，可发酵的糖类物质含量较少，这对发酵效果有影响，因此在底物中添加一定量的碳源营养组分，如小麦麸皮，麸皮中的粗纤维对纤维素酶和果胶酶有一定的诱导作用，刺激酶的生成，且麸皮蓬松，通透性高有利于菌丝生长，有利于提高发酵的速度，减少发酵所需时间。

但是实际生产中发现，底物中添加小麦麸皮后，虽然可以提高发酵的速度，但是发酵后期结束后，发酵的水解度较低，得到的小分子肽含量不高，如果延长发酵时间则会进一步造成氨基酸的水解，造成氮损失。

综上所述，现有技术中，可以向底物中添加小麦麸皮，来提高发酵的速度，但是发酵的水解度较低，发酵结束后得到小分子肽的含量不高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，通过特殊制备方法，制备发酵底物，再对底物进行发酵，进一步制备小分子肽，使得添加小麦麸皮提高发酵的速度后，同时提高产物的小分子肽的含量。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种微生物发酵制备小分子肽的方法，所述方法包括制备发酵底物、发酵。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述制备发酵底物的步骤包括初混、酸酐处理、膨化处理；

所述初混的方法为，将豆粕、小麦麸皮、玉米粉混合，搅拌至均匀，得到初混物。

所述豆粕、小麦麸皮、玉米粉的质量比为160-180:23-27:8-10；

所述豆粕的水分含量为10.57wt%，粗蛋白含量为42.88wt%，粗脂肪含量为1.54wt%,粗纤维含量为5.98wt%；

所述小麦麸皮的水分含量为8.45wt%，粗蛋白含量为15.22wt%，糖含量为42.16wt%,粗纤维含量为15.67wt%；

所述玉米粉的水分含量为13.01wt%，粗蛋白含量为3.57wt%，淀粉含量为76.58wt%。

所述酸酐处理的方法为，将初混物与琥珀酸酐-柠檬酸溶液混合，浸泡使初混物发生溶胀，浸泡时间为80-90min，浸泡后进行搅拌，搅拌时间为35-45min，搅拌后经过滤、水洗，干燥至含水量为8.5-12wt%，得到酸酐处理的初混物。

所述初混物与琥珀酸酐-柠檬酸溶液的质量比为2.5-3.5:13；

所述琥珀酸酐-柠檬酸溶液的pH为6.3-6.5，琥珀酸酐-柠檬酸溶液中琥珀酸酐的浓度为1.4-1.6wt%。

所述膨化处理的方法为，利用单螺杆挤压膨化机处理酸酐处理的初混物，控制喂料温度为31-33℃，出料温度为92-96℃，螺杆转速为195-220r/min，模孔直径为8-15mm，进行膨化，得到膨化料，将膨化料在温度38-45℃的条件下干燥至含水量为10-13wt%，然后粉碎至全部通过15-30目筛，得到发酵底物。

所述发酵的方法为，将发酵底物、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、去离子水混合后，接种混合菌，控制温度为30-32℃，进行一段发酵，一段发酵的时间为15-17h，控制温度为27-29℃，进行二段发酵，二段发酵的时间为18-22h，发酵结束后，得到发酵物，将发酵物与去离子水混合，室温下置于摇床上，控制摇床速度为150-170r/min，进行震荡，振荡时间为28-32min，震荡后控制转速为8500-12000r/min，进行离心，离心时间为8-15min，离心后得到离心液，将离心液冷冻干燥，得到小分子肽粉。

所述混合菌的接种量为发酵底物的0.63-0.66wt%，所述混合菌由枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌组成，其质量比为3.5-4.5:1.8-1.2:0.8-1.2。

所述枯草芽孢杆菌的酶活为11.2亿CFU/g；

所述乳酸乳杆菌的酶活为2.7亿CFU/g；

所述纳豆芽孢杆菌的酶活为2.2亿CFU/g。

所述发酵底物、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、去离子水的质量比为1700-1900:0.8-1.2:3.5-4.5:0.8-1.2:3.5:0.004-0.006:0.013-0.017:0.8-1.2:950-1050；

所述发酵物与去离子水的质量比为1:8-12。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

本发明发酵制备小分子肽的方法水解度高，水解度为34.8-35.7%；

本发明发酵制备小分子肽的方法，得到的总肽含量高，小分子肽含量高，总肽含量为85.2-85.7%，3000Da以上肽含量为1.1-1.3%，2000-3000Da肽含量为4.8-5.5%，1000-2000Da肽含量为15.6-17.2%，500-1000Da肽含量为71.5-74.1%,500Da以下肽含量为4.0-5.2%；

本发明发酵制备小分子肽的方法，产物中灰分、粗脂肪含量小，灰分（以干基计）含量为3.1-3.5%，粗脂肪（以干基计）含量为0.2-0.3%。

具体实施方式

实施例1

（1）制备发酵底物

a、初混

将豆粕、小麦麸皮、玉米粉混合，搅拌至均匀，得到初混物；

所述豆粕、小麦麸皮、玉米粉的质量比为170:25:9；

所述豆粕的水分含量为10.57wt%，粗蛋白含量为42.88wt%，粗脂肪含量为1.54wt%,粗纤维含量为5.98wt%；

所述小麦麸皮的水分含量为8.45wt%，粗蛋白含量为15.22wt%，糖含量为42.16wt%,粗纤维含量为15.67wt%；

所述玉米粉的水分含量为13.01wt%，粗蛋白含量为3.57wt%，淀粉含量为76.58wt%；

b、酸酐处理

将初混物与琥珀酸酐-柠檬酸溶液混合，浸泡使初混物发生溶胀，浸泡时间为85min，浸泡后进行搅拌，搅拌时间为40min，搅拌后经过滤、水洗，干燥至含水量为10wt%，得到酸酐处理的初混物；

所述初混物与琥珀酸酐-柠檬酸溶液的质量比为3:13；

所述琥珀酸酐-柠檬酸溶液的pH为6.4，琥珀酸酐-柠檬酸溶液中琥珀酸酐的浓度为1.5wt%；

c、膨化处理

利用单螺杆挤压膨化机处理酸酐处理的初混物，控制喂料温度为32℃，出料温度为95℃，螺杆转速为198r/min，模孔直径为10mm，进行膨化，得到膨化料，将膨化料在温度40℃的条件下干燥至含水量为12wt%，然后粉碎至全部通过20目筛，得到发酵底物。

（2）发酵

将发酵底物、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、去离子水混合后，接种混合菌，控制温度为31℃，进行一段发酵，一段发酵的时间为16h，控制温度为28℃，进行二段发酵，二段发酵的时间为20h，发酵结束后，得到发酵物，将发酵物与去离子水混合，室温下置于摇床上，控制摇床速度为160r/min，进行震荡，振荡时间为30min，震荡后控制转速为10000r/min，进行离心，离心时间为10min，离心后得到离心液，将离心液冷冻干燥，得到小分子肽粉；

所述混合菌的接种量为发酵底物的0.65wt%，所述混合菌由枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌组成，其质量比为4:2:1；

所述枯草芽孢杆菌的酶活为11.2亿CFU/g；

所述乳酸乳杆菌的酶活为2.7亿CFU/g；

所述纳豆芽孢杆菌的酶活为2.2亿CFU/g；

所述发酵底物、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、去离子水的质量比为1800:1:4:1:4:0.005:0.015:1:1000；

所述发酵物与去离子水的质量比为1:10。

实施例2

（1）制备发酵底物

a、初混

将豆粕、小麦麸皮、玉米粉混合，搅拌至均匀，得到初混物；

所述豆粕、小麦麸皮、玉米粉的质量比为160:23:8；

所述豆粕的水分含量为10.57wt%，粗蛋白含量为42.88wt%，粗脂肪含量为1.54wt%,粗纤维含量为5.98wt%；

所述小麦麸皮的水分含量为8.45wt%，粗蛋白含量为15.22wt%，糖含量为42.16wt%,粗纤维含量为15.67wt%；

所述玉米粉的水分含量为13.01wt%，粗蛋白含量为3.57wt%，淀粉含量为76.58wt%；

b、酸酐处理

将初混物与琥珀酸酐-柠檬酸溶液混合，浸泡使初混物发生溶胀，浸泡时间为80min，浸泡后进行搅拌，搅拌时间为35min，搅拌后经过滤、水洗，干燥至含水量为8.5wt%，得到酸酐处理的初混物；

所述初混物与琥珀酸酐-柠檬酸溶液的质量比为2.5:13；

所述琥珀酸酐-柠檬酸溶液的pH为6.3，琥珀酸酐-柠檬酸溶液中琥珀酸酐的浓度为1.4wt%；

c、膨化处理

利用单螺杆挤压膨化机处理酸酐处理的初混物，控制喂料温度为31℃，出料温度为92℃，螺杆转速为195r/min，模孔直径为8mm，进行膨化，得到膨化料，将膨化料在温度38℃的条件下干燥至含水量为10.0wt%，然后粉碎至全部通过15目筛，得到发酵底物。

（2）发酵

将发酵底物、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、去离子水混合后，接种混合菌，控制温度为30℃，进行一段发酵，一段发酵的时间为15h，控制温度为27℃，进行二段发酵，二段发酵的时间为22h，发酵结束后，得到发酵物，将发酵物与去离子水混合，室温下置于摇床上，控制摇床速度为150r/min，进行震荡，振荡时间为28min，震荡后控制转速为8500r/min，进行离心，离心时间为15min，离心后得到离心液，将离心液冷冻干燥，得到小分子肽粉；

所述混合菌的接种量为发酵底物的0.63wt%，所述混合菌由枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌组成，其质量比为3.5:1.8:0.8；

所述枯草芽孢杆菌的酶活为11.2亿CFU/g；

所述乳酸乳杆菌的酶活为2.7亿CFU/g；

所述纳豆芽孢杆菌的酶活为2.2亿CFU/g；

所述发酵底物、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、去离子水的质量比为1700:0.8:3.5:0.8:3.5:0.004:0.013:0.8:950；

所述发酵物与去离子水的质量比为1:8。

实施例3

（1）制备发酵底物

a、初混

将豆粕、小麦麸皮、玉米粉混合，搅拌至均匀，得到初混物；

所述豆粕、小麦麸皮、玉米粉的质量比为180:27:10；

所述豆粕的水分含量为10.57wt%，粗蛋白含量为42.88wt%，粗脂肪含量为1.54wt%,粗纤维含量为5.98wt%；

所述小麦麸皮的水分含量为8.45wt%，粗蛋白含量为15.22wt%，糖含量为42.16wt%,粗纤维含量为15.67wt%；

所述玉米粉的水分含量为13.01wt%，粗蛋白含量为3.57wt%，淀粉含量为76.58wt%；

b、酸酐处理

将初混物与琥珀酸酐-柠檬酸溶液混合，浸泡使初混物发生溶胀，浸泡时间为90min，浸泡后进行搅拌，搅拌时间为45min，搅拌后经过滤、水洗，干燥至含水量为12wt%，得到酸酐处理的初混物；

所述初混物与琥珀酸酐-柠檬酸溶液的质量比为3.5:13；

所述琥珀酸酐-柠檬酸溶液的pH为6.5，琥珀酸酐-柠檬酸溶液中琥珀酸酐的浓度为1.6wt%；

c、膨化处理

利用单螺杆挤压膨化机处理酸酐处理的初混物，控制喂料温度为33℃，出料温度为96℃，螺杆转速为220r/min，模孔直径为15mm，进行膨化，得到膨化料，将膨化料在温度45℃的条件下干燥至含水量为13.0wt%，然后粉碎至全部通过30目筛，得到发酵底物。

（2）发酵

将发酵底物、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、去离子水混合后，接种混合菌，控制温度为32℃，进行一段发酵，一段发酵的时间为17h，控制温度为29℃，进行二段发酵，二段发酵的时间为18h，发酵结束后，得到发酵物，将发酵物与去离子水混合，室温下置于摇床上，控制摇床速度为170r/min，进行震荡，振荡时间为32min，震荡后控制转速为12000r/min，进行离心，离心时间为8min，离心后得到离心液，将离心液冷冻干燥，得到小分子肽粉；

所述混合菌的接种量为发酵底物的0.66wt%，所述混合菌由枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌组成，其质量比为4.5:2.2:1.2；

所述枯草芽孢杆菌的酶活为11.2亿CFU/g；

所述乳酸乳杆菌的酶活为2.7亿CFU/g；

所述纳豆芽孢杆菌的酶活为2.2亿CFU/g；

所述发酵底物、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、去离子水的质量比为1900:1.2:4.5:1.2:4.5:0.006:0.017:1:1050；

所述发酵物与去离子水的质量比为1:12。

对比例1

在实施例1的基础上，制备发酵底物步骤中，省去酸酐处理步骤，将初混物直接进行膨化处理，其余步骤相同，制备小分子肽。

对比例2

在实施例1的基础上，制备发酵底物步骤中，在初混后，将初混物先进行膨化处理，然后再进行酸酐处理，其余步骤相同，制备小分子肽。

实施例4水解度检测

检测实施例1-3、对比例1-2发酵方法的水解度，检测方法如下：

水解度=离心液氨基氮/总氮*100%；

氨基氮采用点位滴定法，总氮含量采用GB/T 5009.5-2003的方法进行检测；

结果见表1。

实施例5产物分子量分布检测

将实施例1-3、对比例1-2得到的小分子肽粉按照GB／T22492-2008中的方法，检测其总肽含量；

将实施例1-3、对比例1-2中发酵步骤中得到的离心液依次通过3000Da、2000Da、1000Da、500Da超滤滤膜进行超滤，并检测产物的分子量分布，结果见表2。

实施例6灰分、粗脂肪检测

将实施例1-3、对比例1-2得到的小分子肽粉按照GB／T22492-2008中的方法，检测其灰分、粗脂肪含量，结果见表3。