一种黄芩外泌体的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种黄芩外泌体的提取方法及其应用。

背景技术

外泌体是由细胞分泌的、尺寸为40-160nm的细胞外囊泡，具有脂质双分子层结构，可作为细胞交流的桥梁，参与细胞间通讯。植物细胞中的纳米囊泡具有与动物细胞外泌体相似的生物学特性，且具有毒性低、价格低廉易获得等优点，成为未来研究热点。但植物外泌体的研究目前仍处于起步阶段，提取效率不高，缺乏公认的植物外泌体提取方法。黄芩为常用中药，味苦、性寒，归肺、胆、胃、大肠经，有清热燥湿、泻火解毒等功效。主要应用于上呼吸道感染、肺热咳嗽、肺炎等疾病。目前关于黄芩外泌体的提取方法良莠不齐，效率低，利用植物外泌体颗粒的生物安全性及纳米颗粒的靶向性，通过黄芩外泌体本身发挥抗纤维化药效缓解肺纤维化进程，减少全身副作用的同时实现精准治疗，这些至今未见公开报道。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种黄芩外泌体的提取方法及其应用，可有效解决现有黄芩外泌体提取方法良莠不齐，效率低的问题。

为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一种黄芩外泌体的提取方法，包括以下步骤：

（1）收集汁液：将清洗好的新鲜黄芩切成3-4cm的小段，加入超纯水，经榨汁搅拌均质化1.5-3min，纱布过滤后弃去残渣，收集黄芩汁液；

（2）低速离心：3-5 ℃下，将黄芩汁液以2800-3200g离心28-32min后，取上清液，再以8000-12000g离心两次，每次1.8-2.2h，取上清液，再以13000-17000g离心1-2h，取上清液；

（3）过滤：将最终离心后的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得滤液；

（4）提取黄芩外泌体：3-5 ℃下，滤液经10000-13000g离心10-13h，弃去上清，得沉淀，用PBS重悬沉淀，得黄芩外泌体粗提物；

（5）纯化黄芩外泌体：将黄芩外泌体粗提物依次置于质量浓度为8%、30%、45%和60%的梯度蔗糖溶液中，3-5 ℃下，10000-13000g离心14-16h后，溶液明显分层，质量浓度为30%的蔗糖层为黄芩外泌体层；将黄芩外泌体层取出置于离心管中，3-5 ℃下，10000-13000g离心14-16h，弃去上清，收集沉淀，即得纯化的黄芩外泌体。

所述方法制备的黄芩外泌体在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

本发明提取方法简单，易操作，与传统的超速离心法相比，经过蔗糖梯度离心法得到纯净的黄芩外泌体，含有较少的蛋白聚集物、大细胞外囊泡等杂质，有显著的社会和经济效益。

附图说明

图1是本发明提取的黄芩外泌体透射电子显微镜形貌图。

图2是本发明提取的黄芩外泌体的纳米颗粒跟踪分析仪检测结果图。

图3是本发明提取的黄芩外泌体中RNA、蛋白和脂质成分表征图。

图4是本发明提取的黄芩外泌体在小鼠体内各组织中的分布情况图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一种黄芩外泌体的提取方法，包括以下步骤：

（1）收集汁液：将500g新鲜黄芩清洗后切成3-4cm小段，加入100mL超纯水经榨汁搅拌均质化1.5min，纱布过滤后弃去残渣，得到黄芩汁液300mL；

（2）低速离心：3 ℃下，将黄芩汁液以2800g离心32min后，取上清液，再以8000g离心两次，每次2.2h，取上清液，再以13000g离心1h，取上清液200mL；

（3）过滤：将最终离心后的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得滤液；

（4）提取黄芩外泌体：3 ℃下，滤液经10000g离心13h，弃去上清，得沉淀，用2mLPBS重悬沉淀，得黄芩外泌体粗提物；

（5）纯化黄芩外泌体：将黄芩外泌体粗提物依次置于质量浓度为8%、30%、45%和60%的梯度蔗糖溶液中，3 ℃下，10000g离心16h后，溶液明显分层，质量浓度为30%的蔗糖层为黄芩外泌体层；将黄芩外泌体层取出置于离心管中，3 ℃下，10000g离心16h，弃去上清，收集沉淀，即得纯化的黄芩外泌体，得率为4.1×10

实施例2

一种黄芩外泌体的提取方法，包括以下步骤：

（1）收集汁液：将500g新鲜黄芩清洗后切成3-4cm小段，加入100mL超纯水经榨汁搅拌均质化2min，纱布过滤后弃去残渣，得到黄芩汁液300mL；

（2）低速离心：4℃下，将黄芩汁液以3000g离心30min后，取上清液，再以10000g离心两次，每次2h，取上清液，再以15000g离心1.5h，取上清液200mL；

（3）过滤：将最终离心后的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得滤液；

（4）提取黄芩外泌体：4 ℃下，滤液经12000g离心12h，弃去上清，得沉淀，用2mLPBS重悬沉淀，得黄芩外泌体粗提物；

（5）纯化黄芩外泌体：将黄芩外泌体粗提物依次置于质量浓度为8%、30%、45%和60%的梯度蔗糖溶液中，4 ℃下，12000g离心15h后，溶液明显分层，质量浓度为30%的蔗糖层为黄芩外泌体层；将黄芩外泌体层取出置于离心管中，4 ℃下，12000g离心15h，弃去上清，收集沉淀，即得纯化的黄芩外泌体，得率为4.9×10

实施例3

一种黄芩外泌体的提取方法，包括以下步骤：

（1）收集汁液：将500g新鲜黄芩清洗后切成3-4cm小段，加入100mL超纯水经榨汁搅拌均质化3min，纱布过滤后弃去残渣，得到黄芩汁液300mL；

（2）低速离心：5 ℃下，将黄芩汁液以3200g离心28min后，取上清液，再以12000g离心两次，每次1.8h，取上清液，再以17000g离心1h，取上清液200mL；

（3）过滤：将最终离心后的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得滤液；

（4）提取黄芩外泌体：5 ℃下，滤液经13000g离心10h，弃去上清，得沉淀，用2mLPBS重悬沉淀，得黄芩外泌体粗提物；

（5）纯化黄芩外泌体：将黄芩外泌体粗提物依次置于质量浓度为8%、30%、45%和60%的梯度蔗糖溶液中，5 ℃下，13000g离心14h后，溶液明显分层，质量浓度为30%的蔗糖层为黄芩外泌体层；将黄芩外泌体层取出置于离心管中，5 ℃下，13000g离心14h，弃去上清，收集沉淀，即得纯化的黄芩外泌体，得率为4.1×10

实施例4

一种黄芩外泌体的提取方法，包括以下步骤：

（1）收集汁液：将500g新鲜黄芩清洗后切成3-4cm小段，加入100mL超纯水经榨汁搅拌均质化2.5min，纱布过滤后弃去残渣，得到黄芩汁液300mL；

（2）低速离心：4 ℃下，将黄芩汁液以2900g离心30min后，取上清液，得沉淀，再以11000g离心两次，每次1.9h，取上清液，再以16000g离心2h，取上清液200mL；

（3）过滤：将最终离心后的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得滤液；

（4）提取黄芩外泌体：4 ℃下，滤液经11000g离心13h，弃去上清，用2mL PBS重悬沉淀，得黄芩外泌体粗提物；

（5）纯化黄芩外泌体：将黄芩外泌体粗提物依次置于质量浓度为8%、30%、45%和60%的梯度蔗糖溶液中，3-5 ℃下，12000g离心14h后，溶液明显分层，质量浓度为30%的蔗糖层为黄芩外泌体层；将黄芩外泌体层取出置于离心管中，3-5 ℃下，11000g离心16h，弃去上清，收集沉淀，即得纯化的黄芩外泌体，得率为3.8×10

上述方法提取的黄芩外泌体保存时，可将黄芩外泌体沉淀重悬于PBS溶液置于-80℃冰箱保存。

本发明提取方法简单，易操作，与传统的超速离心法相比，经过蔗糖梯度离心法得到纯净的黄芩外泌体，含有较少的蛋白聚集物、大细胞外囊泡等杂质，提取效果非常好，以实施例2为例，具体实验资料如下：

一、黄芩外泌体的表征

(1)、透射电子显微镜（TEM）观察黄芩外泌体形貌

取10μL黄芩外泌体样品滴至铜网表面，待干燥后滴加2%磷钨酸溶液负染1min，用滤纸吸取多余的负染液，于室温下干燥过夜后置于透射电子显微镜中观察黄芩外泌体形貌。结果如图1所示，制备获得的黄芩外泌体为脂质双分子层结构的囊泡，粒径为100 nm左右，尺寸较为均一，形态完整。

(2)、纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）表征黄芩外泌体粒径和浓度

将黄芩外泌体样品用PBS稀释，随后用1mL注射器吸取样品注入到纳米粒度追踪仪中进行检测分析。结果如图2所示，显示黄芩外泌体粒径在100nm左右，尺寸与透射电子显微镜结果一致。

(3)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)表征黄芩外泌体RNA

使用TRIzol试剂提取黄芩药材和黄芩外泌体中的总RNA，将DNA Marker、黄芩药材RNA、黄芩外泌体RNA和黄芩外泌体RNA+RNase A酶分别置于聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，之后置于凝胶成像仪中观察结果。

(4)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征黄芩外泌体蛋白

使用RIPA裂解液对黄芩药材和黄芩外泌体蛋白进行裂解提取。将ProteinMarker、黄芩药材和黄芩外泌体蛋白分别置于12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中进行电泳，电泳结束后切割分离胶层并用考马斯蓝染色15min，脱色后于凝胶成像仪中观察结果。

(5)、薄层色谱分析表征黄芩外泌体脂质

在黄芩外泌体悬浮液中加入氯仿/甲醇(2:1)混合溶剂，收集有机相并干燥，氯仿重悬分别得到黄芩药材、黄芩外泌体粗提物和黄芩外泌体的脂质样品。将脂质样品在硅胶薄层色谱(TLC)板上分离，使用氯仿/甲醇/醋酸(190:9:1)的混合物作为展开剂，用体积浓度10% CuSO4在8%磷酸试剂中显影，并于105 ℃加热至出现清晰斑点。

如图3所示，图3（A）为RNA表征结果，泳道1-3分别为黄芩药材、黄芩外泌体、黄芩外泌体+RNase A酶；图3（B）为蛋白表征结果，泳道1-2分别为黄芩药材、黄芩外泌体；图3（C）为脂质表征结果，1-3分别为黄芩药材、黄芩外泌体粗提物、黄芩外泌体。结果证明，黄芩外泌体中含有丰富的RNA、蛋白和脂质成分；与黄芩药材成分对比，黄芩外泌体含有黄芩药材本身的部分有效成分和新有效成分。

二、黄芩外泌体在小鼠体内各组织中的分布情况

(1)、随机取4只小鼠，正式实验前禁食12h，自由饮水；

(2)、将50μL水合氯醛溶液（10%）注射进小鼠腹腔内将其麻醉；

(3)、通过经鼻给药的方式，将30μL DID（远红外细胞膜荧光探针）标记的黄芩外泌体鼻滴入小鼠体内；

(4)、分别在注射2h、6h、12 h、24h后解剖小鼠，使用小动物活体成像系统采集记录DID标记的黄芩外泌体在小鼠体内心、肝、脾、肺、肾等各组织中的分布情况，结果如图4所示，黄芩外泌体被成功递送至肺部组织，且在肺部组织中能够长时间驻留，为进一步应用于治疗肺纤维化及相关肺部疾病提供了技术支持。

同时，本发明在对实施例2做上述实验的同时，还对实施例1、3、4也做了同样的实验，均取得了与实施例2相同和相近似的结果，这里不再一一列举，表明本发明效果好，方法稳定可靠。

由上可以清楚的看出，本发明提取方法简单，与传统的超速离心法相比，经过蔗糖梯度离心法得到纯净的黄芩外泌体，含有较少的蛋白聚集物、大细胞外囊泡等杂质，纯度为1-1.5×10