MK-886在作为或制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物新应用技术领域，具体涉及一种MK-886在制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

背景技术

心肌缺血是发病率和死亡率最高的心血管疾病最常见的形式，对于改善患者预后，及时恢复缺血性心肌的血流(再灌注)是必不可少的。然而，这种再灌注可能导致进一步的心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)，从而导致心肌功能障碍，例如心肌惊晕、再灌注心律失常、肌细胞死亡以及内皮和微血管功能障碍等，包括无回流现象、炎症反应和其他心肌组织损伤，比原始缺血性损伤引起的损伤更可怕。根据一份报告，致死性再灌注损伤占最终心肌梗死大小的50％。MI/RI病理机制涉及的复杂系统网络，例如氧化应激、炎症反应、钙超负荷和线粒体功能障碍等。

MK-886是体内和体外白三烯形成的高效抑制剂，该化合物通过结合膜结合的5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的机制间接抑制白三烯的生物合成，从而抑制5-脂氧合酶的易位和活化；还发现MK-886可防止缺血后白三烯积累和缺血再灌注后的微循环变化；MK-886还被发现通过减少肝脏I/R模型中的细胞凋亡和氧化应激来有效预防肝脏和肠道损伤；MK-886的抗炎特性和抑制脂质过氧化可以保护(I/R)损伤中的这些器官；MK886可以降低过氧化物酶体增殖物激活的受体α(PPAR-α)活性。

然而，目前关于MK-886在心肌缺血再灌注中的作用还未见报道。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种MK-886在作为或制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。MK-886可以有效改善心脏功能、减少心脏梗死面积、减少心肌细胞凋亡和氧化应激、提高蛋白酶体活性从而有效预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。

为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种MK-886在作为或制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

需要说明的是，MK-886是白三烯形成的高效抑制剂，是一种小分子化合物，分子式为C

在一些具体示例中，上述应用中，MK-886通过改善心脏功能从而预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。

在一些具体示例中，上述应用中，MK-886通过减少心脏梗死面积从而预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。

在一些具体示例中，上述应用中，MK-886通过减少心肌细胞凋亡和氧化应激从而预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。

在一些具体示例中，上述应用中，MK-886通过提高蛋白酶体活性而预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。

在一些具体示例中，上述应用中，药物为注射药剂剂型。需要说明的是，施药方法为腹腔注射。

在一些具体示例中，上述应用中，MK-886还可以同其他一些预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物联用，进行增效。

需要说明的是，上述应用中，在一些具体示例中，通过建立了小鼠心肌缺血再灌注模型，于造模前给药，利用心脏超声、TTC染色、Western blot、RT-PCR等实验技术，评估小鼠心脏功能、内在机制及信号分子，发现MK-886能够改善MI/R后小鼠的心功能，增加射血分数，减少心脏的梗死面积；另外，提前给小鼠腹腔注射MK-886，能够减少缺血再灌注后心肌细胞的凋亡，降低氧化应激水平。除此之外，MK-886能够提高蛋白酶体活性，改善心肌缺血再灌注后的线粒体功能和状态，使线粒体膜电位升高，ATP生成增多，膜通透转化孔减少，线粒体分裂减少。即说明MK-886可作为或者制备预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的新药物，具有重要的临床指导意义。

本发明有益效果包括：本发明通过建立了小鼠心肌缺血后再灌注动物模型，腹腔注射MK-886(20mg/Kg)进行干预，评估心功能、能量代谢及相关信号分子，验证了MK-886能提升梗死后心脏功能，减少心肌梗死面积和细胞凋亡以及氧化应激，提高蛋白酶体活性并改善线粒体结构功能，从而有效预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。

附图说明

图1为MK-886改善小鼠缺血/再灌注诱导的心肌功能障碍的左心室的典型M型超声心动图；

图2为MK-886改善小鼠缺血/再灌注诱导的心肌功能障碍的EF％和FS％的测量(n＝6)情况；

图3为给药MK-886(20mg/Kg)后缺血再灌注小鼠的EvansBlue和TTC染色的梗死面积代表性图像；

图4为给药MK-886(20mg/Kg)后缺血再灌注小鼠I/R损伤后24h梗死面积/LV和AAR/LV的定量分析(n＝6)；

图5为给药MK-886(20mg/Kg)后缺血再灌注小鼠心肌细胞的TUNEL染色的代表性图像(左)和TUNEL阳性细胞核的百分比，比例尺＝50μm(n＝6，右)；

图6为给药MK-886(20mg/Kg)后缺血再灌注小鼠心肌细胞的心脏横截面的DHE染色代表性图像，比例尺：50μm，DHE荧光强度的量化(n＝8，右)；

图7为给药MK-886(20mg/Kg)后缺血再灌注小鼠蛋白酶体活性(Trypsin-like、Chymotryspin-like)升高。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，使用的动物为C57BL/6雄性小鼠，8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

一、构建小鼠缺血再灌注损伤模型

(1)实验动物饲养及分组

C57BL/6雄性小鼠，8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；分笼饲养，恒温(23-25℃)，恒湿(55-70％)；

动物实验分为4组：健康对照组(Vehicle组)、正常药物组(MK-886组)、模型组(I/R组)和治疗组(MK-8886+I/R组)，每组各6只；其中，Vehicle组和I/R组小鼠是将C57BL/6小鼠腹腔注射玉米油0.2ml/只；MK-886组和MK-886+I/R组均是用MK-886预处理实验小鼠(20mg/kg，玉米油稀释0.2ml/只，腹腔注射)，随后对I/R组和MK-886+I/R组小鼠行心肌缺血再灌注模型(I/R)构建。

(2)构建小鼠缺血再灌注损伤模型

麻醉与术前准备：小鼠术前涂脱毛膏进行备皮处理；1.5％异氟烷吸入麻醉后，取仰卧位，将小鼠四肢用胶布将头部与四肢固定在操作台上，以1％异氟烷维持麻醉。

手术方法：将小鼠置于实验台上，用75％酒精多次消毒小鼠胸前皮肤，用眼科剪沿小鼠左锁骨中线第2肋间至第6肋间剪一1-2cm小口，用4-0缝合线缝合切口，荷包缝合但不打结，用弯镊及止血钳钝性分离皮下组织暴露胸骨，用弯血管钳钝性分离左4、5肋间可见心脏，左手将心脏挤出，顺势将心脏左翻可见左心耳，在心脏左心耳前下可见一般的细血管及左前降支，用6-0缝合线在左心耳前下方1mm处结扎左前降支并打一活结，将心脏放回心腔，缝合皮肤放回笼中并放在加热毯上，计时30min并观察小鼠状态，30min结束后将小鼠心脏上的活结拔出恢复血流，过程缓慢，注意记录心脏血流再灌注的时间。

二、模型评价

实施例1心脏超声心动图评价

上述小鼠缺血再灌注损伤模型再灌注后24h，将四组小鼠分别放在1.5％异氟烷的麻醉箱中麻醉后，仰卧位固定于操作台上，以1％异氟烷维持麻醉；先找到胸骨旁长轴切面，保存B-mode数据，旋转探头90°获取小鼠心脏左心室胸骨旁短轴切面，胸骨旁短轴切面以左心室乳头肌水平的切面为标志点，用M型超声模式记录下左心室射血分数(LVEF)，左心室短轴缩短率(LVFS)，左心室收缩末期内径(LVESD)，左心室舒张末期内径(LVEDD)，左心室收缩末期容积(LVESV)，左心室舒张末期容积(LVEDV)；胸骨旁长轴切面以左心室流出道水平切面为标志点，用B型超声心动图记录室壁运动图像。

检测结果如下：M型超声心动图记录的四组小鼠心脏舒缩运动图像如图1所示，显示小鼠I/R后的心脏收缩舒张功能明显下降，而MK-886预处理的模型小鼠，心脏舒缩功能显著改善；图2依次为四组小鼠LVEF和LVFS比较图，表明模型小鼠MK-886预处理后LVEF和LVFS显著升高，能够有效缓解I/R损伤造成的心功能下降。以上结果显示对心肌缺血再灌注小鼠提前注射MK-886(20mg/Kg)改善了小鼠的心脏功能

实施例22，3，5-三苯基四氯化唑(TTC)染色

上述将4组小鼠腹腔注射0.2ml三溴乙烷过饱和溶液，小鼠麻醉后进行固定，未造模两组(Vehicle、MK-886)与I/R造模时一样结扎左前降支，而造过模的两组(I/R、MK+I/R)沿心梗造模肋间开口处，将心脏再次挤出，在上次结扎处再次将心脏左前降支结扎，在心尖处注射0.9ml1％伊文氏蓝染料，让其沿血流流向全身，可观察到小鼠全身变蓝；取下小鼠心脏用PBS清洗，将组织中的线取出，灌胶并将心脏放入-20℃冰箱冷冻定型30min，结束后将心脏放入模具中切成等厚的4个薄片并放入1％TTC染料中，37℃孵箱孵育30min，结束后将心脏切片放入4％组织固定液中固定一晚上，第二天取出拍照。

检测结果如下：四组小鼠心脏TTC染色的截面图如图3所示(其中，蓝色为正常区域，红色为缺血区域，白色为梗死区域)，与Vehicle组相比，I/R组的梗死区面积显著增大，而预处理MK-886的模型组小鼠的心肌梗死面积明显减小；图4为四组小鼠的心肌危险区、梗死区占左室心肌面积的比例。以上结果显示MK-886预处理后可部分挽救I/R损伤所致的心肌梗死面积。

实施例3DHE染色

将上述小鼠心脏取材后予以石蜡包埋、切片，烤片2h后上行走缸脱蜡，PBS清洗并用组画笔在片子上圈出组织，使用0.5％TritonX-100溶液打孔15min，PBS清洗，用PBS将DHE染料稀释100倍，每个组织30ul37℃孵育30min，PBS溶液清洗，结束后用抗荧光淬灭封片剂封片，全程避光操作；用荧光显微镜拍摄荧光亮度，使用ImageJ软件分析。

检测结果如下：图5是四组小鼠心脏组织的DHE荧光染色显微镜拍摄图以及四组相对的荧光强度对比统计图，结果显示I/R后小鼠的心肌组织中的氧化应激水平增高，活性氧含量增多；但预处理MK-886后，小鼠心肌的氧化应激水平明显下降，说明预处理MK-886能够减少小鼠心肌缺血再灌注损伤后的氧化应激。

实施例4TUNEL染色

将上述小鼠心脏取材后予以石蜡包埋、切片，烤片2h后上行走缸脱蜡，PBS清洗并用组画笔在片子上圈出组织，使用0.1％TritonX-100溶液4℃打孔2min，PBS溶液清洗，TUNEL染料37℃孵箱孵育60min，PBS溶液清洗，DAPI染色5min，PBS溶液清洗，将α-actinin染料用PBS稀释100倍，每个组织30ul4℃过夜。第二天复温30min后，将488荧光二抗用PBS稀释100倍，每个组织30ul37℃孵育30min，结束后PBS溶液清洗，用抗荧光淬灭封片剂封片，全程避光操作；用荧光显微镜拍摄荧光亮度，使用ImageJ软件分析。

检测结果如下：图6为四组小鼠心脏组织的TUNEL荧光染色显微镜拍摄图以及四组TUNEL阳性细胞核数百分比对比统计图，结果表明I/R后小鼠的心肌细胞凋亡增多；而预处理MK-886后，小鼠心肌细胞凋亡明显减少，说明预处理MK-886能够使小鼠心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡减少。

实施例5蛋白酶体活性测定

各取上述4组心肌组织约10mg(n＝6)，剪碎后匀浆、超声，4℃13300rpm离心，使用BCA方法测定蛋白浓度，定量后使用proteasome-GloTMChymo-trypsin-like，Trypsin-likeandCaspase-likecell-BasedAssays(promega，货号G8661,G8760.G8861)试剂盒测量四组小鼠的心脏组织和血清的蛋白酶体活性水平。

检测结果如图7所示，与Vehicle组相比，I/R后小鼠心肌组织中的Trypsin-like、Chymotryspin-like蛋白酶体活性下降，而预处理MK-886能逆转这一情况，提高了蛋白酶体活性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。