掌桥专利:专业的专利平台
掌桥专利
首页

猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型疫苗株及其应用

文献发布时间:2023-06-19 19:07:35


猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制缺陷型疫苗株及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种猪接触性传染病,临床以母猪发热、厌食、流产、死胎、弱胎等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征,给我国及世界养猪业造成了严重影响。PRRSV一直处于不断的变异及进化过程中,自2006年夏季以来,PRRSV变异株引起的PRRS在我国暴发并流行,给养猪业造成严重的经济损失。近年来的NADC30-like、NADC34-like及各种重组的PRRSV持续困扰着养猪业。

疫苗接种是目前防控PRRSV病毒感染最有效的措施,目前商品化的PRRSV疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两类。PRRSV灭活疫苗由于不能有效诱导中和抗体的产生,其有效性不是非常明确;其优点是安全性好,但是灭活苗存在免疫剂量大、免疫次数多、免疫力产生期较长等缺点。据报道,注射灭活疫苗后进行攻毒不能保护仔猪不感染PRRSV,并且感染后病毒血症的持续时间和病毒的滴度与非免疫组无显著差异。PRRSV弱毒疫苗能够很好地诱导猪体产生细胞免疫和体液免疫,提供有效的免疫保护,接种弱毒苗后猪体抗体产生快,且持续时间持久,保护力强。但是弱毒疫苗也有缺点,有研究表明弱毒疫苗病毒可经胎盘感染胎儿,并向未接种疫苗的母猪传播,或者表现出急性PRRS综合症状。所以PRRSV弱毒疫苗安全性问题是目前阻碍PRRSV弱毒疫苗广泛应用的重要原因之一。

PRRSV基因组中ORF2-7分别编码病毒的结构蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白,其中GP5、M、N蛋白是主要结构蛋白,GP2a、E、GP3、GP4是次要结构蛋白。E蛋白是一种分子量较小的囊膜蛋白,没有糖基化,具有疏水性,由73(北美型)或70(欧洲型)个氨基酸组成。E蛋白对病毒的感染性至关重要,在病毒脱壳过程中可能发挥着离子通道的功能。

稳定细胞系是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中,使外源基因能够在宿主细胞中长期稳定表达。其原理是将外源基因克隆到具有某种抗性的载体上,通过转染宿主细胞,外源基因整合到宿主染色体上,用载体中所含抗性基因进行筛选即可得到成功整合目的基因的细胞。在试验过程中,常用的真核表达载体抗性筛选标志物有嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)等。通过筛选可得到符合实验要求的稳定高表达目的蛋白细胞株或者稳定沉默目的基因的细胞株。利用慢病毒感染筛选单克隆是目前最常用的稳定细胞系构建方法之一。慢病毒可以感染几乎所有类型的细胞,并且可以将遗传物质整合到宿主细胞基因组中,进行长时间的稳定表达。

发明内容

本发明要解决现有商品化PRRSV灭活疫苗免疫效果差以及PRRSV弱毒疫苗持续带毒、间歇排毒、毒力返强的技术问题,提供一种PRRSV复制缺陷型疫苗候选株,该疫苗株不能在正常细胞内复制,只能利用表达PRRSV E蛋白细胞系进行增殖,可以有效解决现有商品化疫苗的缺点,有望成为一种安全有效的新型PRRSV活疫苗。

为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面,提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒复制子,所述复制子包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸突变体,该突变体是将HuN4-F112基因组的E蛋白基因突变使该E蛋白不表达。

优选的,所述突变体是将HuN4-F112基因组的E蛋白起始密码子ATG突变为GTG。

在本发明的另一方面,还提供了一种稳定表达PRRSV E蛋白的细胞系。

优选的,所述细胞系为Marc-145细胞系。

所述细胞系的构建方法,包括以下步骤:

将HuN4-F112弱毒疫苗株E蛋白DNA序列克隆至具有潮霉素(hygromycin)/嘌呤霉素(puromycin)抗性的慢病毒载体上,应用慢病毒三质粒包装系统在293T细胞包装慢病毒,然后感染Marc-145细胞,用潮霉素或者嘌呤霉素选择性筛选,挑选单克隆细胞纯化,得到可稳定表达PRRSV E蛋白的Marc-145细胞株。

在本发明的另一方面,还提供了一种包含HuN4-F112的基因组核酸突变体分子的重组载体,该突变体是将HuN4-F112基因组的E蛋白基因突变使该E蛋白不表达。

在本发明的另一方面,还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型疫苗株,所述疫苗株包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸突变体,该突变体是将HuN4-F112基因组的E蛋白基因突变使该E蛋白不表达。

所述疫苗株在稳定表达PRRSV E蛋白的细胞系中正常持续复制,在不表达PRRSV E蛋白的细胞系中进行一次性的感染与复制。

所述猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型疫苗株的制备方法,包括以下步骤:

将猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112基因组的E蛋白起始密码子突变,构建E蛋白缺失的复制子;将突变后的复制子载体线性化并且体外转录成病毒RNA,再将该病毒RNA转染到稳定表达PRRSV E蛋白的细胞系,进行病毒拯救,获得PRRSV复制缺陷型疫苗株。

在本发明的另一方面,还提供了上述猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

本发明的PRRSV复制缺陷型疫苗株,在PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆(中国专利ZL201010559005.X)的基础上,突变了PRRSV E蛋白的起始密码子,使其不能表达E蛋白,因此本发明疫苗株不能在正常细胞内连续复制,只能利用表达PRRSV E蛋白的细胞系进行增殖。经实验证实,本发明PRRSV复制缺陷型疫苗株,在稳定表达PRRSV E蛋白的Marc-145细胞系正常复制且具有较高的病毒滴度,在普通Marc-145细胞系只能进行一次性感染与复制。该疫苗株有望成为一种安全有效的新型PRRSV活疫苗,有效解决PRRSV灭活疫苗不能诱导细胞免疫等缺点,同时解决PRRSV弱毒疫苗持续带毒、间歇排毒、毒力返强等安全性问题,本发明的PRRSV复制缺陷型疫苗在畜牧生产中具有广泛的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的E蛋白缺失复制子的构建示意图;

图2是本发明实施例1PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的E蛋白缺失复制子构建过程中的核酸电泳结果图,其中a是overlapping PCR获得的A、B片段;b是将E蛋白的起始密码子ATG突变为GTG的基因片段;c是限制性内切酶Asc I和EcoR V酶切突变片段的结果图;d是限制性内切酶Asc I和EcoR V酶切感染性克隆pSK-HuN4-F112的结果图;

图3是本发明实施例2PRRSV E蛋白基因重组慢病毒表达载体构建过程中的核酸电泳结果图;其中a是PCR扩增PRRSV E蛋白的片段;b是限制性内切酶EcoR I酶切慢病毒骨干质粒pLV-EF1a-IRES-Puro、pLV-EF1a-IRES-Hygro的结果图;

图4是本发明实施例3重组慢病毒的RT-PCR鉴定结果图;

图5是本发明实施例4Marc-145-E细胞系western blot检测结果图;

图6是本发明实施例4Marc-145-E细胞系间接免疫荧光实验结果图;

图7是本发明实施例5E蛋白缺失复制子pHuN4-F112-E酶切及纯化产物鉴定结果图;

图8是本发明实施例5拯救病毒在Marc-145-E细胞及Marc-145细胞的细胞病变图;

图9是本发明实施例5PRRSV复制缺陷型疫苗株HuN4-F112-E的P4代在Marc-145-E细胞复制的生长曲线图;

图10是本发明实施例5PRRSV复制缺陷型疫苗株HuN4-F112-E的P4代生长曲线每个时间点对应的细胞病变图。

具体实施方式

下列实施例中,未注明具体条件的实验方法,通常按常规条件,如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编,马学军,舒跃龙的译.北京:科学出版社,2004)中所述的方法进行。

为了解决现有商品化PRRSV灭活疫苗免疫效果差以及PRRSV弱毒疫苗持续带毒、间歇排毒、毒力返强等安全性问题,本发明通过分子生物学手段对PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组进行设计和改造。PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112是本实验室通过将高致病性PRRSV强毒HuN4株体外传代致弱获得的减毒活疫苗株,之前的大量临床实验证实HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好的免疫保护力(专利号为200810097546.8的中国发明专利)。本发明在PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株感染性分子克隆(专利号为201010559005.X的中国发明专利)的基础上,将HuN4-F112基因组的E蛋白的起始密码子ATG突变为GTG,突变导致E蛋白不能表达,构建E蛋白缺失的复制子pHuN4-F112-E。

同时,将HuN4-F112弱毒疫苗株E蛋白DNA序列克隆到具有潮霉素(hygromycin)/嘌呤霉素(puromycin)抗性的慢病毒载体上,应用慢病毒三质粒包装系统在293T细胞包装慢病毒,然后感染Marc-145细胞,用潮霉素或者嘌呤霉素选择性筛选,挑选单克隆细胞纯化,得到可稳定表达PRRSV E蛋白的Marc-145细胞株。

用限制性内切酶SwaΙ将复制子pHuN4-F112-E线性化,然后通过体外转录获得病毒RNA,用脂质体法将该病毒RNA转染稳定表达PRRSV E蛋白的Marc-145细胞,进行病毒拯救,获得PRRSV复制缺陷型疫苗株,该疫苗株在稳定表达PRRSV E蛋白的Marc-145细胞系正常复制且具有较高的病毒滴度,在普通Marc-145细胞系只能进行一次性感染与复制。本发明的PRRSV复制缺陷型疫苗株,为PRRSV的防控与净化提供了一种安全有效的新型PRRSV活疫苗。

实施例1 PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的E蛋白缺失复制子的构建

1.1材料与方法

1.1.1病毒株、细胞及载体

PRRSV疫苗株HuN4-F112由本实验室传代致弱并保存、感染性克隆pSK-HuN4-F112由本实验室构建并保存(Tong GZ et al.,2007;Zhou YJ et al.,2008;周艳君等2011;Zhang SR et al.,2011),Marc-145细胞由中国农科院上海兽医研究所猪传染病研究室保存,抗PRRSV E蛋白的小鼠多抗由本实验室制备并保存。

1.1.2主要试剂

DNA纯化回收试剂盒购置Omega公司;脂质体DMRIE-C购自Invitrogen公司;T4DNA连接酶购自NEB公司;外转录试剂盒mMessage High Yield Capped RNA Transcriptionkit;AMV反转录酶RNA酶抑制剂、Taq酶、dNTP均购自TaKaRa公司;其他化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3引物设计

根据PRRSV HuN4株(GenBank登录号:EF635006)基因序列,在E蛋白起始密码子上下游各寻找一个酶切位点,扩增包含Asc I和EcoR V限制性酶切位点的这段序列,并将HuN4-F112基因组的E蛋白的起始密码子ATG突变为GTG,设计方案如图1所示,设计4条用于overlapping PCR的引物(见表1)。

表1 overlapping PCR的引物

1.2PRRSV E蛋白缺失复制子的构建

以感染性克隆pSK-HuN4-F112为模板,利用表1两对特异性引物进行PCR扩增获得A、B两个片段,其中A片段的核酸序列如SEQ ID NO.5所示,B片段的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。反应体系和反应条件如下:

表2 PCR扩增体系

反应过程:95℃预变性1min、95℃变性20s、60℃退火20s、72℃延伸30s,35个循环后72℃再延伸10min,4℃保存。PCR产物跑核酸胶如图2a,胶回收纯化目的片段,测浓度。

以纯化后的A、B两个片段为模板,用F1和R2引物,按上述反应体系和条件进行PCR扩增,核酸胶结果如图2b,然后纯化,得到包含Asc I和EcoR V限制性酶切位点的突变序列,根据pLB零背景快速克隆试剂盒(天根)说明书,将这段序列连接到PLB载体上,连接体系如下:

表3 PLB载体连接体系

将体系混匀后,16℃金属浴30min;经过转化,挑菌送测序,选取带有突变位点序列正确的菌液,提取质粒;以上述质粒为模板,用F1和R2引物,按上述表2的反应体系和条件进行PCR扩增,并纯化PCR产物。用Asc I和EcoR V-HF限制性内切酶按下表(表4)体系将感染性克隆pSK-HuN4-F112和PCR产物37℃过夜酶切:

表4酶切体系

将酶切后目的片段与克隆载体跑核酸胶,结果如图2c,2d,然后将胶回收产物用T4DNA连接酶进行连接,体系见下表5,将连接体系配置混匀好后,放于16℃恒温金属浴过夜连接。

表5 T4 DNA连接体系

将上述连接产物转化到DH5α大肠埃希氏菌中并挑取单菌落送测序;选取测序正确包含突变位点的质粒大量摇菌,中提质粒,命名为pHuN4-F112-E,保存于-20℃冰箱。

1.3结果

利用overlapping PCR方法将HuN4-F112基因组的E蛋白的起始密码子ATG突变为GTG,经PCR测序鉴定证实,获得了突变的PRRSV全长cDNA 克隆,本发明把突变了PRRSV E蛋白的起始密码子所获得的PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的E蛋白缺失复制子命名为pHuN4-F112-E。

实施例2 PRRSV E蛋白基因重组慢病毒表达载体的构建

2.1材料与方法

2.1.1细胞及质粒

慢病毒骨干质粒pLV-EF1a-IRES-Puro、pLV-EF1a-IRES-Hygro、慢病毒包装质粒psPAX2、VSV-G包膜表达质粒pMD2.G,293T细胞,Marc-145细胞均由中国农科院上海兽医研究所猪传染病研究室保存。

2.1.2主要试剂

质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自上海华舜生物科技有限公司;DNA纯化回收试剂盒购置Omega公司;PfuUltraⅡFusion HS DNA Polymerase购自Stratagene公司;Taq酶、dNTP、DL-2000DNA Marker、DL-1 5000DNA Marker均购自TaKaRa公司;胎牛血清、

2.1.3引物设计

根据PRRSV HuN4株(GenBank登录号:EF635006)基因序列,用Primer 5.0软件设计了1对带有同源臂的引物用于扩增PRRSV E蛋白(见表6),小写字母部分为质粒pLV-EF1a-IRES-Puro和pLV-EF1a-IRES-Hygro的同源臂。

表6 PRRSV蛋白的引物

2.2PRRSV E蛋白基因重组慢病毒表达载体的构建

2.2.1PRRSV E蛋白基因的PCR扩增

以感染性克隆载体pSK-Hun4-F112质粒为模板,利用表6特异性引物和高保真酶Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase进行PCR扩增。反应体系和反应条件如下:

表7 PCR反应体系

反应过程:95℃预变性3min、95℃变性20s、65℃退火20s、72℃延伸30s,35个循环后72℃再延伸10min,4℃保存。PCR产物跑核酸胶如图3a,纯化目的片段,测浓度并置于-20℃保存。

2.2.2pLV-EF1a-IRES-Puro和pLV-EF1a-IRES-Hygro载体线性化

将pLV-EF1a-IRES-Puro和pLV-EF1a-IRES-Hygro载体按以下表8反应体系37℃过夜酶切。通过琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段如图3b,并进行胶回收,步骤参考试剂盒说明书。

表8酶切反应体系

2.2.3PRRSV E蛋白基因重组慢病毒表达载体的构建

根据ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒说明书,利用胶回收的线性化载体pLV-EF1a-IRES-Puro和pLV-EF1a-IRES-Hygro与带有同源臂的PRRSV E蛋白片段进行同源重组,体系如下:

表9同源重组反应体系

将配好的同源重组体系用枪吹打混匀,在37℃水浴孵育30min。孵育结束后将同源重组产物加入到DH5α感受态中,冰浴30min后,42℃热激80s,继而冰上冷却2~3min;然后在超净台后加入900μL无抗LB培养基,37℃摇床摇50min后,将菌液3000×g离心4min,留约100μL上清将离心产物重悬,涂在具有氨苄抗性的LB平板上。在37℃培养14h后,挑菌落扩大培养并测序。将测序正确的菌液大量培养抽提质粒,命名为pLV-Puro-E和pLV-Hygro-E,保存于-20℃备用。

实施例3 PRRSV E蛋白重组慢病毒的包装与鉴定

3.1慢病毒的包装

复苏293T细胞,待细胞长至80%时,准备包装慢病毒。试验中同时设置慢病毒表达载体pLV-EF1a-IRES-Puro/pLV-EF1a-IRES-Hygro转染以及未转染293T细胞作为对照。质粒转染具体操作如下:

(1)将293T细胞培养于T75细胞瓶中,待细胞长到80%左右且分布均匀时,准备进行质粒转染。

(2)按照Lipofectamine

(3)在等待的15min内,弃掉细胞瓶中原有培养基,立即轻柔缓慢加入PBS清洗细胞洗2遍,吸干残留PBS。

(4)将孵育好的混合液沿瓶壁缓缓加入T75中,放置于5%CO

(5)6~8h后换液,弃掉培养孔中液体换成10mL含10%FBS的DMEM培养基继续培养。

(6)转染后48h收取上清病毒液离心,过滤,分装,标记好,保存于-80℃冰箱,一次性使用,不可反复冻融。

3.2重组慢病毒的浓缩

用冻融的方法使细胞破碎释放病毒,3000rpm室温离心5min,除去细胞碎片;然后用0.22μm的过滤器过滤。取20mL病毒液加入4.66mL的PEG6000(polyethylene glycol)以及2.47mL NaCl(4mol/L)混匀,4℃静置7~8h。③5000rpm离心40~50min,收集病毒沉淀;在病毒沉淀中加入适量的Tris-HCl(50mmol/L)重悬病毒颗粒,即可获得10~100倍浓缩的重组慢病毒液,分装,置-80℃保存备用。

3.3重组慢病毒的鉴定

使用RNA提取试剂盒提取重组慢病毒病毒液RNA,并反转录为cDNA 作为模板,使用PRRSV E蛋白基因特异性引物进行RT-PCR检测,引物序列、反应体系及反应程序均同1.2.1.,用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,结果如图4所示,图4中,1、2、3为pLV-Puro-E包装的慢病毒,4、5为pLV-Hygro-E包装的慢病毒,6为293T细胞,7为水。

实施例4重组慢病毒感染Marc-145细胞及其稳转细胞系筛选鉴定

4.1慢病毒感染细胞

复苏Marc-145细胞,加入含10%FBS的DMEM培养液,于37℃5%CO

用PBS清洗Marc-145细胞,加入2mL/孔10%FBS的DMEM培养基。取50μL浓缩后的慢病毒悬液感染细胞,再加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺(Polybrene),置于37℃5%CO

4.2嘌呤霉素/潮霉素筛选

将感染后的细胞用PBS清洗三次,加入含终浓度1μg/ml嘌呤霉素(10μg/ml潮霉素)10%FBS的DMEM培养基进行筛选培养,每隔24h换液一次,直至对照组未用慢病毒感染的Marc-145细胞全部死亡。实验组细胞在压力筛选下不断增殖,当细胞汇合度约为50%时,将细胞用胰酶消化后继续维持筛选,随后根据细胞生长情况,再进行扩大培养。

4.3稳转细胞系的鉴定

4.3.1Western blot检测

向RIPA蛋白裂解液中按1:100加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,混匀后置于冰上。用PBS将六孔板中上述稳转细胞系及普通Marc-145细胞清洗2遍,加入配好的细胞裂解液200μL/孔。将六孔板置于摇床上冰浴15min。然后将细胞样品移入EP管中,4℃离心机12000rpm离心10min,按上清与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液4:1的比例充分混匀,置于沸水中煮10min。

用15%聚丙烯酰胺凝胶对所得蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳,待蛋白maker分离至所需位置时停止电泳,然后将蛋白胶分离的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。在室温下,用0.1%TBST配制5%脱脂牛奶将NC膜室温封闭1h,再用0.1%TBST洗涤3次。按照蛋白maker切下目的条带,做好标记,加入一抗置于摇床上室温孵育1-2h。用TBST清洗三次,每次5min,再加入酶标二抗室温孵育1h。TBST漂洗三次,加入化学发光底物用于显影,保存并分析图片(图5,1为Marc-145-E-pure细胞系,2为Marc-145-E-Hygro细胞系,3为Marc-145细胞)。western blot结果显示Marc-145-E-pure和Marc-145-E-Hygro细胞系都能表达PRRSV E蛋白。

4.3.2间接免疫荧光实验

将稳转细胞系及普通Marc-145细胞铺在24孔板中,待其长满时取出做间接免疫荧光实验。将细胞在室温下用冰甲醇固定30min;然后用PBS洗涤3次后,用5%的BSA于37℃恒温箱中封闭30min。将一抗小鼠血清用1%的BSA按1:100稀释好后每孔加200μL,37℃下孵育2h。弃上清,将细胞用PBS洗涤三遍,用1%的BSA将Alexa Fluor 488goat anti-mouse Ig G(H+L)抗体以1:1000的比例稀释加入到细胞板中,37℃温育1h。洗涤细胞然后通过倒置荧光显微镜观察并留图(图6)。间接免疫荧光实验结果显示Marc-145-E-pure和Marc-145-E-Hygro细胞系都有较明显的绿色荧光,表明它们都能表达PRRSV E蛋白。

4.4结果

将HuN4-F112弱毒疫苗株E蛋白DNA序列克隆到具有潮霉素(hygromycin)/嘌呤霉素(puromycin)抗性的慢病毒载体上,应用慢病毒三质粒包装系统在293T细胞包装慢病毒,然后感染Marc-145细胞,用潮霉素或者嘌呤霉素选择性筛选,经过western blot和间接免疫荧光实验验证,PRRSV E蛋白成功在Marc-145细胞上表达,将该株可稳定表达PRRSV E蛋白的Marc-145细胞株命名为Marc-145-E。

实施例5 PRRSV复制缺陷性病毒的拯救鉴定及多步生长曲线的绘制

5.1RNA的体外合成

利用3’末段的SwaI酶切位点将复制子pHuN4-F112-E进行线性化,将酶切产物纯化;取原质粒,酶切产物以及纯化产物样品跑核酸胶鉴定(图7)。根据体外转录试剂盒mMessage High Yield Capped RNA Transcription kit试剂盒说明书合成病毒RNA,将如下体系在无RNA酶的EP管内混匀,37℃水浴2h。

表10体外转录体系

5.2RNA的转染与拯救

将Marc145-E细胞系培养于六孔细胞培养板中,待细胞长到90%左右准备转染。预热opti-MEM,取两个无RNA酶的EP管A、B,加入500μL预热的opti-MEM,管A加入12μL DMRI-C转染试剂混匀,管B加入体外转录产物轻轻吹打混匀;然后将管B中的混合物加入管A中充分混匀;将六孔板的Marc145-E细胞系弃掉原有培养基,加opti-MEM洗一遍,将1mL混合物加入到细胞孔中;对另一孔Marc145-E细胞系进行同样的操作,但是最后只加入1mL opti-MEM作为阴性对照。同时在普通Marc145细胞上进行一组转染实验。转染后的细胞置于37℃CO

结果显示在Marc-145-E细胞系上拯救的病毒在四天后,出现明显的细胞病变(CPE),细胞表现为聚集、圆缩和脱落等,与其亲本毒HuN4-F112产生的CPE基本一致;同步在普通Marc-145细胞上拯救的病毒未出现细胞病变(图8),将突变病毒命名为HuN4-F112-E。图8中箭头所指的地方即为出现明显细胞病变的区域。

5.3救获突变病毒的测序鉴定

提取救获的PRRSV复制缺陷型疫苗株HuN4-F112-E的RNA,经反转录,利用上述引物F1/R2进行RT-PCR扩增,并将产物连接PLB载体进行测序。测序结果显示,拯救毒株HuN4-F112-E E蛋白的起始密码子ATG突变为GTG,与实验设计相符。

5.4重组病毒多步生长曲线的绘制

将Macr-145-E细胞系与普通Macr-145细胞铺12孔板,待细胞长满后准备感染HuN4-F112-E病毒。将病毒HuN4-F112-E分别按0.01MOI的感染剂量感染Macr-145-E细胞系和普通Macr-145细胞,吸附2h后,用PBS洗一遍细胞,换成2%DMEM培养基。在感染后每隔12h(12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h)分别收取Macr-145-E细胞系和普通Macr-145细胞3个孔病毒感染的细胞上清液,采用96孔组织培养板法进行病毒滴度测定,按Reed-Muench法计算病毒的计算半数感染量(TCID50/0.1mL),绘制病毒多步生长曲线。

利用第四代突变病毒绘制病毒的多步生长曲线,结果显示在Macr-145-E细胞系正常复制且具有较高的病毒滴度,感染后48h至72h即达到复制高峰期,其整个增殖过程与其亲本病毒HuN4-F112的增殖特性基本一致,而在普通Marc-145细胞系接种的救获病毒不能测出病毒滴度(图9)。复制缺陷性PRRSV病毒HuN4-F112-E在Macr-145-E细胞系48h出现比较明显的细胞病变,96h细胞完全脱落,在普通Marc-145细胞系60h出现较多的细胞碎片,说明HuN4-F112-E在普通Marc-145细胞上具有感染性(图10)。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序 列 表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)

<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型疫苗株及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

agtgcatacc atggtgaaat gcctc 25

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gcatagaccc cacttcattt caattc 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gaattgaaat gaagtggggt ctatgc 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tgaacggtag agcgcgcacg gagta 25

<210> 5

<211> 292

<212> DNA

<213> 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆(PRRSV HuN4-F112)

<400> 5

agtgcatacc atggtgaaat gcctccaggt tacaaaattc tggcgtgcgc ggagttctcg 60

cttgatgacc cagtaaggta caaacacacc tggggatttg aatcggatac agcgtatctg 120

tacgagttta ctggaaatgg tgaggactgg gaggattaca atgatgcgtt tcgggcgcgc 180

cagaaaggga aaatttataa agctaatgcc atcagcatga ggtttcattt tcccccgggc 240

cctgtcattg aaccaacttt aggcctgaat tgaaatgaag tggggtctat gc 292

<210> 6

<211> 207

<212> DNA

<213> 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆(PRRSV HuN4-F112)

<400> 6

gaattgaaat gaagtggggt ctatgcaaag cctctttaac aaaattggcc aactttttgt 60

ggatgctttc acggaatttc tggtgtccat tgttgatatc atcatatttt tggccatttt 120

gtttggcttc acaatcgccg gttggctggt ggtcttctgc atcagactgg tttgctccgc 180

ggtactccgt gcgcgctcta ccgttca 207

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

agatcgcgaa cgcgtgaatt catggggtct atgcaaagcc tc 42

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

gcggccgccc tcgaggaatt ctcataagat cttctgtaat tgctcagg 48

相关技术
  • 猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用
  • 猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用
技术分类

06120115802869