一种膝骨关节炎早期标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种膝骨关节炎早期标志物及其应用。

背景技术

膝关节炎是一种常见的关节疾病，其主要的病理特征为关节软骨的退行性病变。然而，膝关节炎的发病机制尚不清楚，且缺乏有效的治疗手段。虽然可以通过关节置换术对有症状的终末期患者进行治疗，但置换假体的寿命有限，并且手术费用较高。因此，识别疾病相关的生物标志物以发现骨关节炎高危人群并进行早期干预，有助于有效控制疾病的发病率、降低骨关节炎对患者带来的疾病负担。

线粒体是复杂的多功能细胞器，参与多种细胞功能，如热调节、钙稳态、活性氧(ROS)的产生和促炎细胞因子的产生，其损伤可在一定程度上影响软骨细胞的健康。它们有自己的基因组(线粒体DNA)，包含37个基因，13个编码蛋白质，22个转移RNA(tRNAs)和2个核糖体RNA(rRNA)。线粒体DNA作为多拷贝基因组，在人群中普遍存在序列突变和拷贝数变异。线粒体异序性(mitochondrial heteroplasmy,MtHz)是线粒体DNA质量特征之一，不同序列的线粒体DNA共存于人类的许多疾病中，包括经典的线粒体疾病和多病因疾病。

一直以来，膝关节炎被认为是一种潜在的线粒体疾病，其发病机制与线粒体功能息息相关。然而，线粒体和膝关节炎之间的因果关系很少被研究。本申请通过使用双样本孟德尔随机化方法，探索了线粒体异序性与膝关节炎发生的因果关联。本申请基于大规模全基因组关联研究(genome wide association study,GWAS)的汇总统计数据。孟德尔随机化分析方法使用单核苷酸位点作为工具变量，可以消除传统流行病学研究中，由于混杂因素作用和反向因果关联所导致的偏倚。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种膝骨关节炎诊断标志物及其应用，该膝关节炎标志物存在于血液中，适用于大规模筛查的非侵入性检测；而该标志物的检测试剂盒，便于膝关节炎的大规模筛查，可大幅提高筛查的准确性与实用性，促进方法的标准化。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种膝骨关节炎早期标志物，该标志物为与线粒体异序性有关的SNP序列组合。

进一步地，与线粒体异序性有关的SNP序列组合为rs10063311和/或rs1049432。

膝骨关节炎早期标志物在制备膝关节炎检测试剂中的应用。

一种检测膝骨关节炎的试剂盒，该试剂盒含有检测血液中膝关节炎诊断标志物的试剂，所述标志物为与线粒体异序性相关的15个SNP组合。

本发明经过大量的实验，筛选出来了人血液中与膝关节炎诊断相关的线粒体异质性。特别地，线粒体异序性rs10063311和/或rs1049432对于早期的膝关节炎样本的针对性非常强，这些生物标记物的选择对于早期膝关节炎的风险预测是非常好的。进一步，在生物标记物的基础上，构建血液中线粒体异质性与膝关节炎诊断相关检测平台，利用这些位点以及相应的检测技术开展膝关节炎的无创早筛早诊意义重大。

附图说明

图1为本发明应用方法图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

线粒体异质性相关遗传变异位点选择：文献检索，应用23andME研究项目中欧洲血统人群基因组遗传变异资料，获取基因多态性位点的信息，符合以下条件:1.这些单核苷酸多态性位点与线粒体异序性关联P值均小于5×10

表1

表1结果中F统计量值为36.357>10，说明所选SNP均为与线粒体异序性存在强相关的变量，可以作为线粒体异序性的工具变量，用来探索线粒体异序性与膝骨关节炎之间的因果关联。

膝关节炎数据来源：膝骨关节炎来自于Cell最新发布的汇总全基因组序列分析数据集(PMID：34450027)，共包含826,000人。该数据集为目前整合了来自骨关节炎相关组织的功能基因组学分析结果，包括基因表达、蛋白质丰度和全基因组甲基化、小鼠敲除模型和单基因人类疾病表型等数据，以识别可能的效应基因，并通过增强我们对疾病病因病理学的理解，促进急需的转化为治疗。

统计学分析：在R软件(R版本4.3.0)中使用TwoSampleMR(版本0.5.6)、MR-PRESSO(版本1.0)和MR.raps(版本0.2)R包执行两个样品孟德尔随机化分析。本研究中应用的方法如图1所示。MR steiger检验用于推断被调查性状之间的因果方向。采用四种方法，包括逆方差加权法(IVW)、加权中值法(WM)、MR Egger法和MR稳健调整剖面评分法(MR-RAPS)，估计线粒体异质性和膝关节炎之间的因果关系。在本研究中，IVW被视为主要的分析方法，该方法基于以下假设：所有选定的遗传工具都是有效的，并给出了一个总体因果估计，以加强因果推断。MR-Egger回归考虑了定向多效性的存在，并用回归截距测量水平多效性，而这种方法的结果容易受到外围遗传变异的影响。基于至少50％的变量有效的假设的加权中值提高了因果效应检测的能力，但降低了精确度。MR-RAPS应用稳健的调整后的轮廓分数来校正多效性，使本研究的结果更加可靠。应用几种敏感性分析来检测和纠正异质性和多效性。MR-PRESSO用于检测水平多效性的存在，并校正受可能多效性异常值影响的因果估计。根据1000次模拟得出相应的p值。MR-Egger回归截距的估计也用于反映多效性的存在(p<0.05)，采用IVW方法研究异质性，异质性水平通过Cochran Q统计进行量化，进行漏出灵敏度分析以确定可能有影响的SNP，重复孟德尔随机化分析，依次排除每个SNP。由于在本研究中测试了五个独立的结果，在Bonferroni校正后，主要结果在p值<0.01时具有统计学意义。

实施例

线粒体异序性相关SNP识别：取15个LD独立的遗传变异进行重复MR分析(补充表1)。我们从膝骨关节炎的汇总GWAS中提取了上述SNP的数据,如表2所示。

表2

线粒体异序性与膝骨关节炎因果关联分析：使用孟德尔随机化方法，对表1和表2的SNP进行联合分析，探索线粒体异序性与膝骨关节炎发病之间的因果关联。得到如表3所示的结果。

表3

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