PCR试剂盒、反应体系及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种PCR试剂盒、反应体系及方法。

背景技术

真菌(学名：Fungi)，是一种具真核的、产孢的、无叶绿体的真核生物。包含霉菌、酵母、蕈菌以及其他人类所熟知的菌菇类，目前已经发现了十二万多种真菌。与人类的健康密切相关，同时某些真菌还能被安全地利用于食品生产和生物化工领域。

真菌分子生物学研究是微生物研究的一个重要领域，但由于真菌的细胞壁结构特殊，抗逆性强，使得真菌的核酸提取尤其困难，使用传统的真菌基因组提取方法较为繁琐。传统的真菌DNA提取方式耗时费力，而市面上通过裂解液裂解后直接PCR的直扩法虽然操作简单，但成功率较低。现在市面上相关产品的裂解液还存在以下问题：裂解的上清中或多或少的都会存在PCR的抑制物，导致PCR反应的成功率不高和PCR产量较低。目前已有一些报道提供了裂解液和PCR预混液的配方，都可用于PCR直扩反应，成功率较高。如CN115181740A记载的一种裂解液和CN115109844A记载的一种PCR预混液。但是这些专利申请都是基于水稻叶片分子水平上的研究，通过提取水稻叶片的DNA和扩增出相应的基因片段，不适用于真菌DNA提取和PCR直扩领域。

目前还未有高准确率、高成功率的PCR反应提取液和PCR预混液，适用于真菌PCR直扩领域。

发明内容

基于此，有必要提供一种PCR试剂盒、反应体系及方法，使裂解液与预混液相互适配，保证PCR直扩反应的成功率和提高PCR产量。

本申请的第一个方面，提供了一种PCR试剂盒，包含裂解液；和/或，PCR预混液；

所述裂解液包含水以及10mM～100mM Tris-HCl、0.5mM～1mM Na

所述PCR预混液包含水以及亲和体、Taq DNA聚合酶、Mg

在其中一些实施例中，所述PCR预混液中亲和体和Taq DNA聚合酶的浓度比为1：(0.6～10)。

在其中一些实施例中，所述PCR预混液包含水以及100ng/μL～500ng/μL亲和体、Taq DNA聚合酶、Mg

在其中一些实施例中，所述PCR预混液包含40mM～60mM Tris-HCl、1mM～4mM Mg

在其中一些实施例中，所述的试剂盒包含所述裂解液和所述PCR预混液。

本申请的第二个方面，提供了一种PCR反应体系，包含水以及所述的PCR预混液、上游引物、下游引物和模板DNA。

在其中一些实施例中，每25μL所述反应体系包含水以及所述的PCR预混液、9.5μM～10.5μM上游引物0.9μL～1μL、9.5μM～10.5μM下游引物0.9μL～1μL和0.9μL～1μL模板DNA。

在其中一些实施例中，每25μL所述反应体系包含水以及2×PCR预混液12.4μL～12.5μL、10μM上游引物0.9μL～1μL、10μM下游引物0.9μL～1μL、模板DNA 0.9μL～1μL。

在其中一些实施例中，所述模板DNA通过所述的裂解液制备。

本申请的第三个方面，提供了一种PCR方法，使用所述的试剂盒对真菌进行处理后，进行PCR反应。

与传统方案相比，本申请具有以下有益效果：

本申请提供了一种免DNA提取的真菌PCR直扩的试剂盒，本申请的试剂盒中的裂解液，无需进行核酸提取，可以用样本粗裂解液直接进行扩增，通过调整PCR预混液的配方成分，加入亲和体，海藻糖、甘油，Taq DNA聚合酶，融合了亲合体热启动技术，最大程度的匹配了所述裂解液，减弱了所述裂解液中PCR抑制物的抑制效果，通过改造核心酶的性能，提升了预混液的耐脏性，使裂解液与预混液相互适配，保证PCR直扩反应的成功率和提高PCR产量。

附图说明

图1为一实施方式的本发明试剂盒与A公司直扩试剂盒对毕赤酵母GS115的PCR产物的凝胶电泳图；

图2为一实施方式的本发明试剂盒与A公司直扩试剂盒、B公司直扩试剂盒对毕赤酵母GS115的PCR产物的凝胶电泳图；

图3为一实施方式的本发明试剂盒对东方伊萨酵母的PCR产物的凝胶电泳图；

图4为一实施方式的本发明试剂盒对酿酒酵母的PCR产物的凝胶电泳图；

图5为一实施方式的本发明试剂盒对马克斯克鲁维酵母的PCR产物的凝胶电泳图；

图6为一实施方式的本发明试剂盒对黑曲霉菌丝的PCR产物的凝胶电泳图；

图7为一实施方式的本发明试剂盒对米根霉菌丝的PCR产物的凝胶电泳图；

图8为一实施方式的本发明试剂盒对毕赤酵母GS115单菌落的PCR产物的凝胶电泳图；

图9为一实施方式的本发明试剂盒对酿酒酵母单菌落的PCR直产物的凝胶电泳图；

图10为一实施方式的本发明试剂盒与A公司直扩试剂盒、B公司直扩试剂盒对桔青霉菌丝的PCR产物的凝胶电泳图；

图11为一实施方式的本发明试剂盒与A公司直扩试剂盒使用1000bp引物扩增毕赤酵母的PCR产物和使用500bp引物扩增酿酒酵母的PCR产物的凝胶电泳图；

图12为一实施方式的本发明试剂盒PCR产物的凝胶电泳图；

图13为C公司基因提取试剂盒的PCR产物的凝胶电泳图；

图14为一实施方式的本发明试剂盒与D公司质粒提取试剂盒的PCR产物的凝胶电泳图；

图15为一实施方式的不同单菌落挑菌量采用本试剂盒的PCR产物的凝胶电泳图；

图16为实施例1和对比例1～3的PCR产物的凝胶电泳对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本申请中，涉及“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

本申请中，涉及“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本申请的一个方面，提供了一种PCR试剂盒，包含裂解液；和/或，PCR预混液；

所述裂解液包含水以及10mM～100mM Tris-HCl、0.5mM～1mM Na

所述PCR预混液包含水以及亲和体、Taq DNA聚合酶、Mg

可选地，所述PCR预混液中亲和体和Taq DNA聚合酶的浓度比为1：(0.6～10)。

可选地，Mg

可选地，所述PCR预混液包含水以及100ng/μL～500ng/μL亲和体、Taq DNA聚合酶、Mg

可选地，所述PCR预混液包含40mM～60mM Tris-HCl、1mM～4mM Mg

优选地，所述亲和体的浓度为440ng/μL～500ng/μL。

优选地，所述海藻糖的浓度为0.03M～0.1M。

优选地，所述甘油的浓度为0.1％～2％。

可选地，所述的试剂盒包含所述裂解液和所述PCR预混液。

经本申请发明人验证，采用本申请的PCR试剂盒能够提升扩增效果，扩增成功率和扩增量都能提高。

具体地，440ng/μL～500ng/μL所述亲和体能用于提高所述PCR试剂盒的扩增产量和扩增成功率。

在本申请中，“成功率”是指扩增的成功的程度，例如采用16个引物进行扩增，能够通过电泳检测到16条清晰条带则成功率为100％，若能检测到14条清晰条带则成功率为87.5％。

本申请的第二个方面，提供了一种PCR反应体系，包含水以及所述的PCR预混液、上游引物、下游引物和模板DNA。

可选地，每25μL所述反应体系包含水以及所述的PCR预混液、9.5μM～10.5μM上游引物0.9μL～1μL、9.5μM～10.5μM下游引物0.9μL～1μL和0.9μL～1μL模板DNA。

可选地，每25μL所述反应体系包含水以及2×PCR预混液12.4μL～12.5μL、10μM上游引物0.9μL～1μL、10μM下游引物0.9μL～1μL、模板DNA 0.9μL～1μL。

优选地，每25μL所述反应体系包括2×PCR预混液12.5μL、10μM上游引物1μL、10μM下游引物1μL、模板DNA 1μL、ddH

可选地，所述模板DNA通过所述的裂解液制备。

本申请的第三个方面，提供了一种PCR方法，使用所述的试剂盒对真菌进行处理后，进行PCR反应。

可选地，所述PCR扩增程序包括预变性93℃～95℃3min，1个循环，变性93℃～95℃30s，退火Tm 30s，延伸71℃～73℃30s/kb，30～35个循环，终延伸71℃～73℃5min～10min，1个循环，4℃～12℃保存。

优选地，所述PCR扩增程序包括预变性94℃3min，1个循环，变性94℃30s，退火Tm30s，延伸72℃30s/kb，30～35个循环，终延伸72℃5min～10min，1个循环，4℃～12℃保存。

以下为具体实施例。

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。在本文中，表示浓度的M是指mol/L；表示浓度的mM是指mmol/L。

“Mix”是指用于PCR扩增时模板和引物外的其他组分的混合物，包含PCR反应所必须的离子、DNA聚合酶、dNTP等。以下实施例中，如未特殊说明，PCR扩增体系为25μL体系。

如未特殊说明，PCR扩增程序和PCR反应时的体系如下，PCR扩增反应体系如表1所示，PCR扩增反应条件如表2所示。

表1

表2

实施例1

本实施例1提供了一种在毕赤酵母GS115中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成如下：100mM Tris-HCl、1mM Na

PCR预混液组成如下：60mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

取250μL毕赤酵母GS115菌液到PCR管中，瞬时离心10s左右，弃上清，然后加入50μL上述裂解液，置于PCR仪中98℃加热5min。裂解完成后，瞬时离心10s左右，取1μL上清液作为扩增模板。

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

分别使用16个扩增引物采用本发明的试剂盒和A公司试剂盒对毕赤酵母GS115进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图1所示。相对于A公司试剂盒，采用本发明的裂解液和PCR预混液处理的毕赤酵母GS115，经PCR扩增后，16个扩增引物的对应基因都被扩增出来，与目的靶序列条带一致，条带亮度更高，PCR产量更高。分别采用本发明的试剂盒、A公司试剂盒和B公司试剂盒对毕赤酵母GS115进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图2所示。相对于A公司和B公司试剂盒，采用本发明的试剂盒处理的毕赤酵母GS115，经PCR扩增后，第17至24个通用扩增引物的对应基因都被扩增出来，与目的靶序列条带一致，条带亮度更高，PCR产量更高。

实施例2

本实施例2提供了一种在东方伊萨酵母中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成：100mM Tris-HCl、0.5mM Na

PCR预混液的组成：60mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

取250μL东方伊萨酵母菌液到PCR管中，瞬时离心10s左右，弃上清，然后加入50μL上述裂解液，置于PCR仪中98℃加热5min。裂解完成后，瞬时离心10s左右，取1μL上清液作为扩增模板。

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

采用本发明的试剂盒对东方伊萨酵母进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图3所示，采用本发明的试剂盒处理的东方伊萨酵母，经PCR扩增后，8个随机引物和8个通用引物的对应基因均被扩增出来。

实施例3

本实施例3供了一种在酿酒酵母中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成：80mM Tris-HCl、1mM Na

PCR预混液的组成：50mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

取250μL酿酒酵母菌液到PCR管中，瞬时离心10s左右，弃上清，然后加入50μL上述裂解液，置于PCR仪中98℃加热5min。裂解完成后，瞬时离心10s左右，取1μL上清液作为扩增模板。

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

采用本发明的试剂盒对酿酒酵母进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图4所示，采用本发明的试剂盒处理的酿酒酵母，经PCR扩增后，16个引物的对应基因均被扩增出来，与目的靶序列条带一致。

实施例4

本实施例4一种在马克斯克鲁维酵母中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成：80mM Tris-HCl、1mM Na

PCR预混液的组成：60mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

取250μL马克斯克鲁维酵母菌液到PCR管中，瞬时离心10s左右，弃上清，然后加入50μL上述裂解液，置于PCR仪中98℃加热5min。裂解完成后，瞬时离心10s左右，取1μL上清液作为扩增模板。

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

采用本发明的试剂盒对马克斯克鲁维酵母进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图5所示，采用本发明的试剂盒处理的马克斯克鲁维酵母，经PCR扩增后，8个随机引物和8个通用引物的对应基因均被扩增出来，与目的靶序列条带一致。

实施例5

本实施例5提供了一种黑曲霉菌丝中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成：80mM Tris-HCl、0.5mM Na

PCR预混液的组成：50mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

吸取10μL裂解液到PCR管中，然后使用10μL无菌枪头挑取黑曲霉菌丝到所述裂解液里，吸打混匀后，置于PCR仪中98℃加热5min。裂解完成后，瞬时离心10s左右，取1μL上清液作为扩增模板。

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

采用本发明的试剂盒对黑曲霉菌丝进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图6所示，采用本发明的试剂盒处理的黑曲霉菌丝，经PCR扩增后，16个扩增引物的对应基因均被扩增出来，与目的靶序列条带一致。

实施例6

本实施例6提供了一种米根霉菌丝中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成：100mM Tris-HCl、0.5mM Na

PCR预混液的组成：40mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

采用本发明的试剂盒对米根霉菌丝进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图7所示，采用本发明的试剂盒处理的米根霉菌，经PCR扩增后，16个扩增引物的对应基因均被扩增出来，与目的靶序列条带一致。

实施例7

本实施例7提供了一种毕赤酵母GS115单菌落中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成：100mM Tris-HCl、0.5mM Na

PCR预混液的组成：60mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

吸取10μL裂解液到PCR管中，然后使用10μL无菌枪头挑取毕赤酵母GS115单菌落到所述裂解液里，吸打混匀后，置于PCR仪中98℃加热5min。裂解完成后，瞬时离心10s左右，取1μL上清液作为扩增模板。

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

采用本发明的试剂盒对毕赤酵母GS115单菌落进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图8所示，采用本发明的试剂盒处理的毕赤酵母GS115单菌落，经PCR扩增后，8个通用扩增引物的对应基因均被扩增出来，与目的靶序列条带一致。

实施例8

本实施例8提供了一种酿酒酵母单菌落中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成：100mM Tris-HCl、0.5mM Na

PCR预混液的组成：40mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

吸取10μL裂解液到PCR管中，然后使用10μL无菌枪头挑取酿酒酵母单菌落到所述裂解液里，吸打混匀后，置于PCR仪中98℃加热5min。裂解完成后，瞬时离心10s左右，取1μL上清液作为扩增模板。

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

采用本发明的试剂盒对酿酒酵母单菌落进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图9所示，采用本发明的试剂盒处理的酿酒酵母单菌落，经PCR扩增后，8个通用扩增引物的对应基因均被扩增出来，与目的靶序列条带一致。

实施例9

本实施例9提供了一种桔青霉菌丝中的PCR方法。

1试剂盒的配方：

裂解液的组成：80mM Tris-HCl、1mM Na

PCR预混液的组成：40mM Tris-HCl、2mM Mg

2PCR方法：

吸取10μL裂解液到PCR管中，然后使用10μL无菌枪头挑取桔青霉菌丝到所述裂解液里，吸打混匀后，置于PCR仪中98℃加热5min。裂解完成后，瞬时离心10s左右，取1μL上清液作为扩增模板。

选择对应的扩增引物，按照表1配制PCR扩增反应体系，扩增的模板DNA为上述1μL上清液。使用25μL体系，一切配制完成后，再按照表2推荐的PCR反应条件进行扩增，最终即可获得实验所需的PCR产物。所述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的方式来判断扩增的效果。

分别使用16个引物采用本发明的试剂盒、A公司试剂盒和B公司试剂盒对桔青霉菌丝进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图10所示。相对于A公司和B公司试剂盒，采用本发明的试剂盒处理的桔青霉菌丝，经PCR扩增后，16个扩增引物的对应基因都被扩增出来，与目的靶序列条带一致，条带亮度更高，PCR产量更高。

实施例1～9的裂解液总结于下表3和PCR预混液的部分组成总结于表4：

表3

表4

实施例10

分别采用8个1800bp引物使用本发明实施例1中的试剂盒和A公司试剂盒对毕赤酵母GS115进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图11(左图)所示。采用本发明的裂解液和PCR预混液处理的毕赤酵母GS115，经PCR扩增后，8个1800bp扩增引物的对应基因都被扩增出来，与目的靶序列条带一致，条带亮度更高。

分别采用8个500bp引物使用本发明实施例3中的试剂盒和A公司试剂盒对酿酒酵母进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳的结果如图11(右图)所示。采用本发明的裂解液和PCR预混液处理的酿酒酵母，经PCR扩增后，8个500bp扩增引物的对应基因都被扩增出来，与目的靶序列条带一致，条带亮度更高。

上述结果说明，采用800bp引物及1800bp引物扩增不同长度的基因时，本发明的试剂盒的PCR产量和扩增成功率都要明显优于A公司。

实施例11

本发明的试剂盒与C公司基因片段提取试剂盒测试

分别采用第1～16个引物使用本发明实施例3中的试剂盒和C公司基因片段提取试剂盒对酿酒酵母进行PCR扩增，结果分别如图12和图13所示。采用本发明的试剂盒，进行PCR扩增，1～16个引物和17～24个引物对应基因均被扩增出来，相比较于C公司基因片段提取试剂盒，本发明试剂盒的PCR扩增的成功率更高，PCR产物的产量更高。

实施例12

本发明的PCR方法与D公司质粒提取DNA试剂盒测试

使用本发明实施例7中的试剂盒和D公司试剂盒对毕赤酵母单菌落处理，分别采用质粒引物1～2，进行PCR扩增。如图14所示，本发明的试剂盒的PCR产物产量基本能达到质粒直接扩增的结果。

实施例13

单菌落挑菌量对本试剂盒PCR扩增结果的影响

使用本发明实施例7中的试剂盒分别对不同挑菌量的毕赤酵母单菌落处理，进行PCR扩增，如图15所示。说明本发明的试剂盒的PCR方法不会受到单菌落挑菌量的影响。

对比例1

对比例1的PCR方法与实施例1基本相同，不同之处在于：对比例1的试剂盒与实施例1相比，PCR预混液中不添加亲和体，也不添加添加剂海藻糖和甘油。PCR反应结果如图16所示。

对比例2

对比例2的PCR方法与实施例1基本相同，PCR预混液中添加剂海藻糖和甘油的添加量和实施例1相同，不同之处在于：对比例2的试剂盒与实施例1相比，不添加亲和体。PCR反应结果如图16所示。

对比例3

对比例3的PCR方法与实施例1基本相同，预混液中亲和体的添加量和实施例1相同，不同之处在于：对比例3的试剂盒与实施例1相比，不添加添加剂海藻糖和甘油。PCR反应结果如图16所示。

对比例1～3及实施例1中的试剂盒的PCR扩增结果如图16所示。由图16可知，添加亲和体时，PCR直扩成功率及产量得到明显提升，而亲和体和添加剂的组合使这种促进作用得到强化。说明本发明的试剂盒中的裂解液和PCR预混液相互适配，相得益彰，保证了PCR反应的成功率和提高了PCR产量。

本发明提供的裂解液组成简单，裂解真菌仅需5min，时间短；裂解上清无须进行中和稀释步骤，步骤少，操作简单；裂解单菌落、菌丝或子实体的用量既节省了成本，又增加了抗实验失败无模板可用的风险能力；裂解步骤可以兼容少量和大量样品的处理；裂解上清无须特别处理，直接可用来进行后续PCR扩增，扩增效果好；本发明提供的PCR预混液耐脏性提升，可以兼容不同的裂解液。

本发明提供的裂解液、预混液的试剂盒及配套方法适用于多种真菌及其单菌落，进行PCR反应的成功率较高和PCR产量高，且效果优于市面上现有的PCR直扩试剂盒、基因抽提试剂盒和质粒DNA提取试剂盒，适用于不同片段引物，产物不受挑菌量的影响。使用本发明的试剂盒进行PCR扩增时，裂解液和PCR预混液相互适配，相得益彰，特别适用于真菌PCR的直接扩增，应用效果良好，保证PCR反应的成功率和提高PCR产量。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。