与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其是涉及一种与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术

目前产KPC酶的细菌已经在全球范围内广泛传播，造成了对碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南在内的几乎所有β-内酰胺类抗菌药物耐药，并且产KPC酶的菌株种类正在增加，随时可能引起医院感染的爆发和流行，因此产KPC酶细菌的感染将是我们面临的严重问题，应引起微生物学家和临床医师的高度重视。自KPC-1在美国卡罗利亚州发现以来，不同国家地区陆续对产KPC酶细菌进行了报道，总体呈现出全球播散的趋势。KPC存在多个突变体，流行病学表明KPC-2与KPC-3为存在的主要亚型，几乎存在于已报道的所有国家。

KPC-1酶耐药表型表现出高度亚胺培南和美罗培南耐药性，当存在克拉维酸时，针对亚胺培南和美罗培南的β-内酰胺酶活性被抑制；对头孢菌素类抗菌药物和氨曲南也耐药。KPC-1基因由大约50kb的非结合性质粒携带。KPC-1酶是一种新的属于A类Bush2f组的可水解碳青霉烯的β-内酰胺酶，肺炎克雷伯菌1534的碳青霉烯耐药性主要由KPC-1酶介导，孔蛋白表达的改变可能也起了某种作用。KPC-2酶与KPC-1酶有一个氨基酸的改变，S174G，分类也属于A类Bush2f组。KPC-2酶从肠炎沙门菌和肺炎克雷伯菌而来，DNA序列表明，编码KPC-2的质粒与沙门菌中的质粒有98％的同源性，因此，此质粒可在肠杆菌中结合而传播KPC-2。KPC-2酶能单独引起碳青霉烯类耐药，不依赖于膜孔蛋白的丢失，基因由可转移的70kb质粒编码，位于质粒的转座子上，具有高传播可能。KPC-3酶由75kb的质粒编码，可以结合转移。KPC3酶是由882bp的碱基编码的293个氨基酸残基的肽链，和KPC-1酶相比有2个碱基的改变，可通过电穿孔转移和结合。所有的KPC结合子对碳青霉烯类的药敏比原菌株要敏感。KPC-1、KPC-3酶均需要结合膜孔蛋白ompK35，其表达缺失引起对碳青霉烯类的耐药。

根据CLSIM100S30文件，临床上对产KPC酶细菌的检测主要是常规的药敏试验，如肉汤稀释法、纸片扩散法以及浓度梯度法，这些方法对产KPC酶细菌的检测较为困难，原因如下：产KPC酶细菌仅对碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低，还达不到完全耐药的水平；产KPC酶细菌应用ESBLs确证试验检测为阳性，容易鉴定为ESBLs菌株；产KPC酶细菌接种效应会影响亚胺培南的MIC，造成错检。目前，大多使用改良的Hodge实验对碳青霉烯酶进行检测，却无法进一步确认其是否为KPC酶。除CarbaNP法外，其他几种方法基本都是基于培养的，耗时长达3-7天，且操作复杂，需要有专业背景的技术人员，对于难培养或生长缓慢的细菌无能为力，难以满足临床需要。CarbaNP方法需要特殊试剂，其中一些需自制，有效期短，灵敏度低。现在普遍认为，产KPC酶细菌的检测金标准是分子生物学方法，但PCR检测需要配备专门的实验仪器，工作人员需要获得检测资质，单个检测成本较高，并未在临床实验室得到常规开展。产KPC酶细菌的准确检测对临床实验室检查仍然是一个巨大的挑战。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤细胞制备，基于细胞融合技术，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，培养成细胞群后，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。

特异性抗体检测的目的首先是协助临床诊断，在某些疾病中亦是观察疗效及预后的一个指标，耐药性以及传染病流行病学调查中，特异性抗体的检测也具有特殊的、重要的意义。抗体免疫学检测具有以下优点：特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测；操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，可操作性增加，容易推广和便于普查；影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。因此，能够特异性结合KPC酶的单克隆抗体是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段，以缓解现有技术中与KPC酶结合的单克隆抗体效果不佳的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种与上述KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段相关的生物材料、试剂、试剂盒以及它们的应用，以改善现有的对KPC酶的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区和/或重链可变区；

所述轻链可变区具有由CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3组成的轻链CDR，所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_1、Seq_2和Seq_3所示；

或者，所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_11、Seq_12和Seq_13所示；

所述重链可变区具有由CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3组成的重链CDR，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_4、Seq_5和Seq_6所示；

或者，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_14、Seq_15和Seq_16所示。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种组合物，包括所述与IPM酶结合的抗体或其抗原结合片段和标记物；所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段偶联；或，所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段分别独立包装。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种生物材料，生物材料包括核酸片段、载体或宿主细胞；

所述核酸片段选自(a1)或(a2)：(a1)、DNA或RNA，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段；(a2)、与(a1)中定义的核酸片段互补的核酸片段；所述载体包括所述核酸片段；所述宿主细胞被所述载体转化，或，所述宿主细胞的基因组中整合有所述核酸。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段的生产方法，包括使用上述宿主细胞表达所述与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种用于检测KPC酶的试剂或试剂盒，包含上述抗体或其抗原结合片段，或上述组合物。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段，生物材料、生产方法、组合物或用于检测KPC酶的试剂或试剂盒在非诊断和治疗目的的检测KPC酶或非诊断和治疗目的检测产KPC酶的微生物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过NCBI序列比对，获得KPC酶(KPC-1～KPC-82)的保守序列，通过大肠杆菌表达纯化后得到高纯度蛋白。将KPC抗原蛋白免疫新西兰大耳白兔后获取分泌与KPC结合的抗体的脾脏细胞制备杂交瘤细胞，通过筛选获取能够分泌特异性好的抗体的杂交瘤细胞，经测序后得到分别如Seq_1～3所示，或分别如Seq_11～13所示的轻链CDR；以及分别如Seq_4～6所示，或分别如Seq_14～16所示的重链CDR。

本发明提供的与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段的CDR区序列来源于兔，对KPC酶的不同亚型均有特异性结合的能力，具有上述CDR序列的抗体或其抗原结合片段具有特异性好、亲和力高等特点，在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于体外诊断KPC酶或分泌KPC酶的微生物，效价达到了1:1280000以上。尤其是上述轻链CDR和重链CDR在一些组合中构成的不同抗体之间可以良好的配对，可以应用于以形成抗体-抗原-抗体复合物为原理的免疫检测方法中，例如分别作为双抗夹心ELISA中的一抗和二抗；或分别作为免疫层析检测卡中的标记抗体和包被于检测区的抗体等。

本发明提供的与KPC结合的抗体或其抗原结合片段，以及与其相关的生物材料制备得到的试剂或试剂盒能够用于耐药菌株的早期分型，并指导临床用药，辅助临床感染控制和治疗。含有具有上述CDR序列的抗体或其抗原结合片段的试剂或试剂盒能够通过定性或半定量的检测从患者分离出来的细菌样本或者阳性血培养样本中的KPC酶，来快速准确地判断患者细菌耐药的程度，快速检测细菌样本中是否存在KPC酶，为临床上用于指导用药的方法提供了更多选择。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例制备得到的抗体1和抗体2的SDS-PAGE电泳结果；

图2为本发明实施例制备得到的抗体1和抗体2采用ELISA方法检测的对KPC酶的亲和活性的结果；

图3为本发明实施例制备得到的抗体1与KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48酶的反应结果；

图4为本发明实施例制备得到的抗体2与KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48酶的反应结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段至少包含一个轻链可变区或一个重链可变区，或者同时包含轻链可变区和重链可变区。

轻链可变区：

所述轻链可变区具有由CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3组成的轻链CDR。

所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如下所示：

CDR-L1:RASQSVRSNLA(Seq_1)；

CDR-L2:GASTRAT(Seq_2)；

CDR-L3:QQYNTWPPLT(Seq_3)。

含有由上述CDR-L1(Seq_1)、CDR-L2(Seq_2)和CDR-L3(Seq_3)组成的轻链CDR的轻链可变区的氨基酸序列优选如Seq_7所示：

TGETTQAPASLSFSLGEEATLSCRASQSVRSNLAWYQQKAEQVPRLLQHGASTRATGVPVRFSGTGDGTDFTLTISSLEPEDAAVYYCQQYNTWPPLTFGGGTKVEIK(Seq_7)。

或者，所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如下所示：

CDR-L1:RSSQSLLHSNGYNYLD(Seq_11)；

CDR-L2:LGSHRAS(Seq_12)；

CDR-L3:MQALQRRT(Seq_13)。

含有由上述CDR-L1(Seq_11)、CDR-L2(Seq_12)和CDR-L3(Seq_13)组成的轻链CDR的轻链可变区的氨基酸序列优选如Seq_17所示：

DVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPKLPIYLGSHRASGKPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCMQALQRRTFGQGTKVEIK(Seq_17)。

在一些可选的实施方式中，上述轻链可变区的氮端还含有信号肽，轻链可变区的信号肽的氨基酸序列为：

MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(Seq_21)。

重链可变区：

所述重链可变区具有由CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3组成的重链CDR。

所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如下所示：

CDR-H1:NYAMH(Seq_4)；

CDR-H2:AIRSNGGGTYYANSVKG(Seq_5)；

CDR-H3:DSGGPVREWYFDL(Seq_6)。

含有由上述CDR-H1(Seq_4)、CDR-H2(Seq_5)和CDR-H3(Seq_6)组成的重链CDR的重链可变区的氨基酸序列优选如Seq_9所示：

EVQLVESGSGLVQPGGSLKLSCAASVFTFSNYAMHWVVQTPDKRLELVAAIRSNGGGTYYANSVKGRFTISRDNAKNTLYDQMSSLKSEDMAVYYCARDSGGPVREWYFDLWGRGTLVTVSS。

或者，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_14、15和16所示：

CDR-H1:SYYVH(Seq_14)；

CDR-H2:LINPSGGSTRYAQKFQG(Seq_15)；

CDR-H3:DYGSVATGDFYFNY(Seq_16)。

含有由上述CDR-H1(Seq_14)、CDR-H2(Seq_15)和CDR-H3(Seq_16)组成的重链CDR的重链可变区的氨基酸序列优选如Seq_19所示：

QVQLQQSGPELVQPGASVKISCKAKGYTFTSYYVHWVKQRPYQGLEWIGLINPSGGSTRYAQKFQGKATLTSDTSSDTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDYGSVATGDFYFNYWGQGTLVTVSS(Seq_19)。

在一些可选的实施方式中，上述重链可变区的氮端还含有信号肽，重链可变区的信号肽的氨基酸序列为：

MDWTWRFLFVVAAATGVQS(Seq_22)。

在一些优选的实施方式中，与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段同时含有轻链可变区和重链可变区。当同时含有轻链可变区和重链可变区时，轻链CDR和重链CDR优选为抗体1或抗体2。

抗体1：

组成轻链可变区轻链CDR的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_1、Seq_2和Seq_3所示；

同时，组成重链可变区重链CDR的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_4、Seq_5和Seq_6所示。

在该组合方式中，优选的实施方式为轻链可变区的氨基酸序列如Seq_7或Seq_23所示，同时重链可变区的氨基酸序列如Seq_9或Seq_24所示。Seq_23所示的轻链可变区为Seq_7所示氨基酸序列的氮端融合有Seq_21所示的信号肽；Seq_24所示的重链可变区为Seq_9所示氨基酸序列的氮端融合有Seq_22所示的信号肽。

抗体2：

组成轻链可变区轻链CDR的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如Seq_11、Seq_12和Seq_13所示；同时组成重链可变区重链CDR的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如Seq_14、Seq_15和Seq_16所示。

在该组合方式中，优选的实施方式为轻链可变区的氨基酸序列如Seq_17或Seq_25所示，同时重链可变区的氨基酸序列如Seq_19或Seq_26所示。Seq_25所示的轻链可变区为Seq_17所示氨基酸序列的氮端融合有Seq_21所示的信号肽；Seq_26所示的重链可变区为Seq_19所示氨基酸序列的氮端融合有Seq_22所示的信号肽。

上述抗体1和抗体2不仅分别独立的对KPC酶具有良好的特异性和结合能力；抗体1和抗体2还可以组成配对抗体，应用于以形成抗体-抗原-抗体复合物检测原理的检测方法，例如应用于双抗夹心ELISA或免疫层析检测卡，在一些可选的实施方式中，以抗体1/抗体2包被于固相载体作为一抗，对应的抗体2/抗体1连接标记物作为二抗，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；或，抗体1/抗体2标记标记物，对应的抗体2/抗体1作为免疫层新检测卡检测区包被的抗体。上述抗体1和抗体2可选地分别独立的为完整抗体或抗原结合片段。

本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR序列完全相同的CDR序列的单克隆抗体变体，因其具有与本发明所述的与KPC酶结合的抗体完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。

抗原结合片段为与母体抗体相同特异性的抗体片段，例如可以为但不限于为F(ab’)

这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。

抗原结合片段还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过肽合成，例如自动肽合成仪获得；或者通过宿主细胞表达编码上述功能片段的基因得到。

本发明提供的与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段除去CDR区域，其余部分序列来源物种包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴和人中的一种或多种。

当与KPC酶抗体为完整的抗体分子时，其抗体类型例如可以为但不限于为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD。在本领域技术人员已知抗体的CDR区域或轻链和重链可变区的前提下，本领域技术人员可以采用本领域常规方法来获得不同类型的抗体，例如将可变区基因与相应的重链或重链恒定区编码基因融合，并在宿主细胞中表达融合蛋白，以获得不同类型的抗体。

在一些优选的实施方式中，所述抗体包含兔抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些优选的实施方式中，抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如Seq_31所示；抗体的重链恒定区的氨基酸序列如Seq_32所示。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种组合物，该组合物包括所述的与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段和标记物；所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段偶联；或，所述标记物与所述抗体或其抗原结合片段分别独立包装，待使用时再进行连接。所述标记物包括但不限于酶、乳胶颗粒、荧光分子标记、量子点、荧光微球、彩色微球、胶体金、胶体银、胶体碳、生物素或链霉亲和素中的一种或多种。

酶的实例例如可以为但不限于为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，标记有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的与KPC结合的抗体或其抗原结合片段可应用于化学发光酶联免疫检测方法和试剂盒中，作为二抗使用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，包括核酸片段、载体或宿主细胞。

核酸片段：选自(a1)或(a2):

(a1)、其编码与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段；在一些优选的实施方式中，核酸片段为DNA，其含有编码轻链可变区的DNA片段和/或编码重链可变区的DNA片段；

优选地，所述编码轻链可变区的DNA片段的核苷酸序列如Seq_8、Seq_18、Seq_27或Seq_28所示；Seq_27和Seq_28所示序列分别为Seq_8和Seq_18所示序列连接编码信号肽片段后得到的序列。

优选地，所述编码重链可变区的DNA片段的核苷酸序列如Seq_10、Seq_20、Seq_29或Seq_30所示；Seq_29和Seq_30所示序列分别为Seq_10和Seq_20所示序列连接编码信号肽片段后得到的序列。

优选地，编码轻链恒定区的DNA片段的核苷酸序列如Seq_33所示。

优选地，编码重链恒定区的DNA片段的核苷酸序列如Seq_34所示。

(a2)、与(a1)中定义的核酸片段互补的核酸片段。

载体：包括如上所述的核酸片段，所述载体还可以包括编码其他组成元件的部分，例如可以为但不限于为编码调控序列或标记基因等。载体例如可以为但不限于为原核表达载体、真核表达载体或昆虫表达载体。

宿主细胞：所述宿主细胞转化有上述载体，以使上述载体实现克隆或表达；或，所述宿主细胞的基因组中整合有所述核酸片段，以表达所述与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段的生产方法，包括使用上述的宿主细胞表达所述与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段。该方法原料来自稳定表达的细胞株，不存在原料供应的风险且性能稳定、成本低。并且产品稳定性强、批间差小，不受细胞株退化影响。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述与KPC结合的抗体或其抗原结合片段。可选的实例包括但不限于为ELISA检测试剂盒、Western Blot检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒或免疫层析测试纸等本领域常规检测方法的试剂盒。可以理解的是，所述试剂中还可以包含本领域常规的试剂，例如可以但不限于包括冻干保护剂，缓冲物质和溶剂等一种或多种；试剂盒还可以包含本领域常规的试剂或耗材，例如可以为但不限于包括缓冲液、封闭液、二抗、显色物质、标记物和反应底物、固相载体、试纸及其支撑部件等一种或多种。

在一些可选的实施方式中，上述试剂盒包括免疫层析检测卡，在样品结合垫上包埋标记物标记的抗KPC酶的单克隆抗体1/抗体2，在检测线(T)包被抗KPC酶的单克隆抗体2/抗体1。若检测样本为阳性，其中的KPC酶与标记物标记的抗体1/抗体2结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线(T)时被预包被的KPC酶抗体2/抗体1捕获，形成免疫复合物，出现可检测的信号值；若检测样本为阴性，不会形成免疫复合物，在检测线处不会出现可检测的信号值。标记物例如可以为但不限于为胶体金、胶体银、胶体碳、磁微球、荧光微球、彩色微球或量子点。优选抗体1包埋于样品结合垫，抗体2包被于检测线。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了上述与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段，生物材料、生产方法、组合物或用于检测KPC酶的试剂或试剂盒在非诊断和治疗目的的检测KPC酶或非诊断和治疗目的检测产KPC酶的微生物中的应用。

将与KPC酶结合的抗体或其抗原结合片段或上述组合物用于与制备检测KPC酶或产KPC酶的微生物的产品，这些产品能够用于耐药菌株的早期分型，并指导临床用药，辅助临床感染控制和治疗；够通过定性或半定量的检测从患者分离出来的细菌样本或者阳性血培养样本中的KPC酶，来快速准确地判断患者细菌耐药的程度，快速检测细菌样本中是否存在KPC酶，临床上用于指导用药。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1抗原的制备

通过NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)序列比对，获得KPC酶(KPC-1～KPC-82)的保守序列。采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pET-28a(+)-PM，采用CaCl

实施例2动物免疫

挑选适龄、重量在1.5公斤左右的新西兰大耳白兔，在标准动物房饲养3天，如无异常情况则开始进行免疫：将100μg KPC酶抗原加入到0.5mL高压灭菌的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀，加入0.5mL弗氏完全佐剂，用注射器相互推拉进行充分混合乳化，对新西兰大耳兔进行背部皮下多点注射免疫；两周后进行加强免疫，此后每隔一周加强免疫一次，共免疫六次，并且从第三次免疫开始，免疫一周后取大耳白兔耳缘静脉血200～500μL，测定效价和亲和性；在最后一次免疫后，取脾脏进行细胞融合，用于制备杂交瘤细胞。

实施例3杂交瘤细胞的制备和筛选

对制备的兔抗血清进行效价检测，合格的情况下使用兔脾脏进行细胞融合，制备单克隆杂交瘤细胞株，方法如下：将免疫完成的新西兰大耳兔处死，无菌条件下取出脾脏，用细胞培养液清洗1次后研碎，过不锈钢筛网，将得到的细胞离心并用细胞培养液清洗2次；取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合，用不含胎牛血清的细胞培养液清洗一次后离心、弃上清，加入聚乙二醇溶液，37℃恒温处理90s左右；用不含胎牛血清的细胞培养液终止反应后离心，用含20％胎牛血清的HAT选择培养液重悬细胞，将细胞加入到96孔板中，37℃、5.0％CO

实施例4利用RT-PCR从杂交瘤细胞中分离抗体可变区基因

将实施例3筛选出的杂交瘤细胞匀浆化后，加入细胞裂解液进行RNA提取，用异丙醇从水相层中沉淀出RNA，离心后洗涤沉淀RNA，去除杂质，重悬后进行反转录，得到cDNA；利用新西兰大耳兔的特异性引物进行PCR，以杂交瘤细胞cDNA为模板，扩增抗体的重、轻链可变区基因，50μL体系中含有5μL cDNA、HotStarTaq Plus酶、dNTPs和0.5μM特异性引物，按以下条件进行PCR扩增：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃7min；获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的片段，送样测序，测序结果与IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)进行比对，抗体1和抗体2的序列信息如下所示：

抗体1：

轻链：

MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARCTGETTQAPASLSFSLGEEATLSCRASQSVRSNLAWYQQKAEQVPRLLQHGASTRATGVPVRFSGTGDGTDFTLTISSLEPEDAAVYYCQQYNTWPPLTFGGGTKVEIK(Seq_23)。

其中1～22位为信号肽；23～45位为FR1；46～56位为CDR-L1；57～71位为FR2；72～78位为CDR-L2；79～110位为FR3；111～120位为CDR-L3；121～130位为FR4。

重链：

MDWTWRFLFVVAAATGVQSEVQLVESGSGLVQPGGSLKLSCAASVFTFSNYAMHWVVQTPDKRLELVAAIRSNGGGTYYANSVKGRFTISRDNAKNTLYDQMSSLKSEDMAVYYCARDSGGPVREWYFDLWGRGTLVTVSS(Seq_24)。

其中1～19位为信号肽；20～49位为FR1；50～54位为CDR-H1；55～68位为FR2；69～85位为CDR-H2；86～117位为FR3；118～130位为CDR-H3；131～141位为FR4。

抗体2：

轻链：

MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARCDVVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPKLPIYLGSHRASGKPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCMQALQRRTFGQGTKVEIK(Seq_25)。

其中，1～22位为信号肽；23～45位为FR1；46～61位为CDR-L1；62～76位为FR2；77～83位为CDR-L2；84～115位为FR3；116～123位为CDR-L3；124～133位为FR4。

重链：

MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLQQSGPELVQPGASVKISCKAKGYTFTSYYVHWVKQRPYQGLEWIGLINPSGGSTRYAQKFQGKATLTSDTSSDTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDYGSVATGDFYFNYWGQGTLVTVSS(Seq_26)。

其中，1～19位为信号肽；20～49位为FR1；50～54位为CDR-H1；55～68位为FR2；69～85位为CDR-H2；86～117位为FR3；118～131位为CDR-H3；132～142位为FR4。

实施例5单克隆抗体的构建、表达和纯化

利用同源重组引物分别在抗体重链可变区基因的两端和轻可变区基因的两端加入同源重组臂和信号肽序列，重链可变区信号肽的氨基酸序列如Seq_22所示，轻链可变区信号肽的氨基酸序列如Seq_21所示。使用双酶切将分别含有兔抗体重链IgG1恒定区的表达质粒和含有兔抗体轻链IgG1恒定区的表达质粒线性化，产生同源重组臂；轻链恒定区的氨基酸序列如Seq_31所示，核苷酸序列如Seq_33所示；重链恒定区的氨基酸序列如Seq_32所示，核苷酸序列如Seq_34所示。将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来，构成完整的轻链表达载体和重链表达载体，将重组产物转化进TOP10大肠杆菌感受态中，扩增质粒。

将得到的单克隆抗体重、轻链表达质粒按照1:1比例加入到Opti-Mem转染培养基中，充分混合后加入DNA 4倍质量的转染试剂PEI，混合后，室温避光放置30min，随后加入到293T细胞中；孵育6h后去除转染体系，加入FreeStyleTM293表达培养基，使用AKTA蛋白纯化系统，采用亲和纯化(Protein A)的方法纯化表达的抗体上清，得到抗KPC酶的单克隆抗体，具体步骤为：(1)将表达的抗体上清以2500×g室温离心10min，去除沉淀物；(2)将装有Protein A的亲和纯化柱用10倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分流洗；(3)将表达上清以5mL/min的流速通过纯化柱；(4)使用20倍纯化柱体积的结合缓冲液(BindingBuffer)充分洗涤纯化柱；(5)用0.1M pH＝3.0～3.5的柠檬酸缓冲液洗脱纯化柱，直至洗脱峰降至平衡状态，用1M pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH为7.0；(6)使用浓缩离心柱浓缩纯化后的单克隆抗体，用PBS作为抗体保存的缓冲液，最后用BSA蛋白浓度检测方法测定浓缩后的抗体浓度。

实施例6分子量测定

用SDS-PAGE电泳鉴定单克隆抗体的分子量，每个电泳道加样量为5μg，同时用已知分子量标准系列作为参照，首先在90V电压下电泳20min，再在140V电压下电泳直到指示剂全部跑出，取下凝胶，用考马斯亮蓝染色，染色后凝胶分析生物原料的分子量，SDS-PAGE电泳图如图1所示。

效果例1效价测定

采用ELISA方法检测单克隆抗体对KPC酶的亲和活性(效价)，主要步骤如下：(1)将KPC抗原用PBS稀释成1ng/μL，以每孔100μL加入到96孔酶标板中，37℃包被2h；(2)弃上清，用0.01M的PBST洗板3次，用PBST配制含3％BSA的封闭液，每孔加入100μL，37℃封闭2h；(3)弃上清，用PBST清洗5次，将纯化浓缩后的抗体进行梯度稀释，浓度从1:1000倍比稀释至1:2560000，加入各孔，每孔加入100μL，37℃温育1h；(4)弃抗体稀释液，用PBST清洗6遍，用1:5000封闭液稀释羊抗兔IgG-HRP，每孔加入100μL，37℃温育1h；(5)弃二抗稀释液，用PBST清洗6遍，加入TMB，100μL/孔，避光37℃放置15min；(6)每孔加入50μL 1M稀硫酸终止反应，在450nm处测定吸光度。结果如图2所示，筛选的单克隆抗体对KPC酶具有较强的结合能力，对KPC酶抗原的效价达到1:1280000(OD值＞0.5)。

效果例2与现有单克隆抗体的对比

采用ELISA方法分别用上述实施例制备得到的抗体1、抗体2、天然抗体和已公布的鼠源单克隆抗体(采购于珠海博美生物科技有限公司)检测对KPC酶的亲和活性(效价)，具体步骤同效果例1。结果如表1所示，表明上述实施例制备得到的单克隆抗体较现有技术亲和力增加，生物活性增强。

表1

效果例3交叉反应

分别用KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48酶包被酶标板，每孔包被量为50ng；将单克隆抗体稀释至10ng/mL，加入到各酶标板中，每孔加入100μL，37℃孵育1h；洗涤后加入HRP标记羊抗兔二抗，每孔加入100μL，37℃孵育0.5h；洗涤后加入TMB，37℃孵育15min，终止读数。抗体1结果如图3所示，抗体2结果如图4所示，表明抗体1和抗体2不与其他型碳青霉烯酶产生交叉反应，特异性强。

效果例4抗体配对验证

两种抗体，抗体1作为捕获抗体，抗体2作为标记抗体(HRP酶标记)，同时捕获抗体也进行HRP酶标记，作为对照组，将捕获抗体包被在抗原板上，先加入倍比稀释的抗原，孵育后洗去未结合的抗原，再加入标记抗体孵育后洗去未结合的标记抗体，最后加入显色液显色。如果可以显色，说明标记抗体与抗原特异性结合，该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。如果不能显色，说明标记抗体不能与抗原结合，从而被洗脱，该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体，结果如下表所示，表明这两种抗体的配对结合抗原的能力最好。

表2

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。