小麦条锈病苗期抗性主效QTL的AQP分子标记、其引物及其应用

技术领域

本申请涉及基因工程技术领域，具体涉及一种小麦条锈病苗期抗性主效QTL的AQP分子标记、其引物及其应用。

背景技术

小麦是我国最重要的口粮作物之一，随着粮食需求的刚性增长与粮食增产难度的日益显现，我国粮食供求在很长一段时间内都将处于紧平衡状态。在众多的生物胁迫中，条锈病是世界性重要真菌病害，严重威胁着小麦的安全生产。

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型（

随着条中34号（CYR34）小种的出现，迅速成为我国目前优势小种，具有出现频率高、毒性强、致病范围广、耐高温的特点，对抗病基因

公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

鉴于以上技术问题中的至少一项，本申请在发掘与小麦条锈病主效抗性QTL紧密连锁标记的基础上，开发并提供了一种基于小麦条锈病苗期抗性主效QTL的AQP分子标记及其扩增引物，并给出了其利用的技术途径，旨在解决当前缺乏对CYR34具有稳定抗性QTL的技术问题。

根据本公开的一个方面，提供一种小麦条锈病苗期抗性主效QTL的AQP分子标记，所述主效QTL为定位于小麦第七染色体长臂上的

根据本公开的另一个方面，提供一种小麦条锈病苗期抗性主效QTL的AQP分子标记，所述主效QTL为定位于小麦第七染色体长臂上

根据本公开的再一个方面，提供了一种AQP分子标记引物，其引物序列如下：

。

根据本公开的再一个方面，提供了一种含有上述AQP分子标记引物检测试剂盒。

根据本公开的又一个方面，将所述AQP分子标记、所述AQP分子标记引物或所述检测试剂盒分别应用于小麦育种、小麦条锈病抗性鉴定、小麦条锈病苗期抗性主效QTL的基因分型当中。

在本公开的一些实施例中，进行小麦条锈病苗期抗性主效QTL的基因分型的主要方法步骤包括：

（1）提取小麦基因组DNA；

（2）以

（3）基因分型：对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇确定基因型。

在本公开的一些实施例中，所述PCR扩增的步骤包括：

PCR反应体系：包括浓度为100 ng/uL的模板DNA 4 uL，HiGeno 2x Probe Mix A与 AQP Primer Mix 混合物 4 uL（HiGeno 2x Probe Mix A 取 420 uL、AQP Primer Mix取 12.5 uL 轻微斡旋混匀后离心），共计8 uL；

PCR反应程序：95℃预变性10 min；第一步扩增反应：95℃变性20 s，61℃梯度退火并延伸40 s，10 个循环，每个循环的退火温度降低0.6℃；第二步扩增反应：95℃变性20 s，55℃退火并延伸40 s，28～34个循环；25℃保存；

AQP引物混合物包括：FAM正向引物、HEX正向引物、反向引物和纯化水；所述FAM正向引物浓度为12 uM，所述HEX正向引物浓度为12 uM，所述反向引物浓度为30 uM；

检测结果分析：在35℃下使用实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher, QuantStudioTM 5)收集扩增产物终点荧光信号，并通过QuantStudio TM Design & Analysis Softwarev1.4.3实现数据可视化。

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本申请所得AQP分子标记定位的QTL遗传效应均值达到32.4，较大且稳定，AQP分子标记与QTL遗传距离较近（遗传距离为0.76 cM），且与该QTL两侧标记连锁不平衡系数D’值为0.98，具有紧密的连锁不平衡关系，能够满足分子育种的需求。

附图说明

图1是本申请一实施例中YN1813条锈病苗期期抗性主效QTL（

图2是本申请一实施例中

具体实施方式

为了更好的理解本申请技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及试剂、原料如无特别说明，均为常规市售产品；所涉及的检测、试验方法等，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一

（1）QTL定位群体：

利用高抗条锈病新品系YN1813与感条锈病地方品种中国春杂交产生F

（2）条锈病苗期抗性鉴定：

重组自交系群体、亲本及344份不同来源的小麦种质资源苗期抗性鉴定于2021年春在河南农业大学许昌校区进行，使用的条锈菌为单一小种CYR34。鉴定材料分别种在50孔穴盘中，每孔种植10粒，每穴盘的两个窄边行种植感病对照铭贤169。在小麦生长至二叶期，采用抖粉法加喷孢子液法对其进行接种：首先将吐温20按照约1:1000比例稀释成混合液，使用喷雾器对叶片进行喷雾脱蜡，再用含有条锈菌夏孢子的混合液（1:2000）对叶片进行喷孢子液接种，将伴有条锈菌夏孢子的滑石粉（约1:30）放入广口塑料瓶中，在瓶口上套2～3层纱布固定，防止脱落，倒置轻轻拍打塑料瓶，将滑石粉抖落在叶片上完成接种。接种后的麦苗放入9～11℃，相对湿度大于80%的暗室中培养36小时，再将其转移到温室中培养，培养条件为温度17℃左右，光照14小时（强光培养）。大约15天后其感病对照发病完全，此时开始调查反应型。反应型调查参考0～9级判定标准。依据9级标准，0～6级为抗病类型，7～9级为感病类型。根据实际发病情况，反应型进行记载2次，期间间隔2～3天。苗期抗性鉴定进行2次重复，按照2次重复结果（IT1、IT2）、2次重复最大值（ITmax）和2次重复平均值（ITmean）作为4个数据进行QTL定位。

（3）DNA提取及QTL定位：

用CTAB法提取亲本、RIL群体及种质资源的DNA。利用小麦55K SNP芯片对“YN1813/中国春”RIL群体进行基因分型，利用QTL定位软件IciMapping v4.2软件中的Kosambimapping function进行遗传连锁图谱构建。用BIP（Biparental populations）功能通过完备复合区间作图（Inclusive composite interval mapping，ICIM）法进行QTL定位研究。

通过“YN1813/中国春”RIL群体，将YN1813控制条锈病抗性的主效QTL定位在小麦的第七染色体的长臂上（7BL），命名为

（4）AQP标记开发及验证：

根据定位区间两侧（

利用本研究新定位的QTL位点物理区间内部紧密连锁的SNP标记信息，参考小麦中国春RefSeq_v1.0（http://wheatomics.sdau.edu.cn/）版本基因组序列，使用DNAMAN软件和PolyMarker在线工具（http://www.polymarker.info/）设计AQP引物（表1）。引物设计好后，需要在两个正向引物5'末端分别加上一个不同的接头序列，两个接头序列能够分别被FAM（5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，标记为蓝色）和HEX（5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，标记为红色）标记的荧光探针识别，在PCR扩增反应过程中产生荧光信号。

表1 AQP标记引物序列

。

按照合成引物标签显示的补加ddH

表2 AQP

基于“YN1813/中国春”RIL群体和344份不同来源的种质资源进行基因分型后，发现

本申请所得AQP分子标记定位的QTL遗传效应均值达到32.4，较大且稳定，AQP分子标记与QTL遗传距离较近，遗传距离为0.76 cM，且与该QTL两侧标记连锁不平衡系数D’值为0.98，具有紧密的连锁不平衡关系，能够满足分子育种的需求。

尽管已描述了本发明的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。