一种生物发酵培养制备paraherquamide A的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物发酵培养制备paraherquamide A的方法。

背景技术

是由动物保健药和疫苗公司硕腾Zoetis开发的一种新型的绵羊口服短效杀虫药，该药的药效成分是得曲恩特(Derquantel，10mg/mL)和阿维菌素(1mg/mL)。

得曲恩特是真菌代谢产物paraherquamide A(简称PHQ A，CAS号77392-58-6，化学式如式Ⅰ所示)的化学衍生物，可由paraherquamide A经酰胺羰基还原、脱氧而获得(Mauragis Micheal A,Lipton Micheal F,Veley Micheal F.Process Development andPreparation of 2-Deoxyparaherquamide:Implementation of a Selective Reductionof Secondary Amides on a Kilogram Scale.Organic Process Research&Development,2002,6,192-196.)，是目前工业生产得曲恩特的工艺路线。该化学反应得率达到75％以上，因此得曲恩特的工业原料供应主要是受paraherquamide A产量影响。而paraherquamide类天然产物产物化学结构复杂，虽然已有利用工业原料异戊二烯或异戊二烯环氧化物化学全合成paraherquamide A的方法，但其化学反应步骤多达46步(Williams Robert M,CaoJianhua,Tsujishima H,et al.Asymmetric,stereocontrolled total synthesis ofparaherquamide A.Journal of American Chemistry Society,2003,125,12172-12178)，收率极低，不适用于工业生产。利用微生物发酵生产paraherquamide A是目前大规模获得该化合物的唯一途径。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种生物发酵培养制备paraherquamide A的方法。

本发明首先提供了一种产paraherquamide A的青霉菌，命名为青霉(Penicilliumsp.)，株号KWF31，保藏号CCTCC NO.M 20221625。

本发明又提供了一种生物发酵培养制备paraherquamide A的方法，包括以下步骤：在培养基中接种权利要求1所述青霉菌并进行发酵培养，发酵培养完成后分离纯化获得化合物paraherquamide A，

其中，培养基中碳源为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉中的至少一种；

氮源为蛋白胨、黄豆饼粉、酵母粉和硝酸盐中的至少一种；

接种量为孢子终浓度为10

发酵培养温度为20～30℃，发酵培养时初始pH为6.0～9.0。

培养基中碳源包括可溶性淀粉，可溶性淀粉质量体积比浓度为0.5％～4％；优选的，可溶性淀粉质量体积比浓度为2％～2.5％。更优选的，培养基中碳源包括可溶性淀粉和葡萄糖，其中，葡萄糖的质量体积比浓度为0.5％～4％。

氮源包括酵母粉，酵母粉质量体积比浓度为0.3％～2.4％；优选的，酵母粉的质量体积比浓度为0.9％～1.8％。更优选的，氮源包括酵母粉和硝酸盐，其中，硝酸盐的质量体积比含量为0.2％～1.6％；优选的，硝酸盐的质量体积比含量为0.6％～1.2％；更优选的，硝酸盐的质量体积比含量为0.6％～0.8％。

优选的，培养基中还包括无机盐，无机盐包括MgSO

更优选的，无机盐包括MgSO

发酵培养时接种量为孢子终浓度为10

分离纯化时使用大孔吸附树脂进行吸附，然后使用体积比浓度为20％的乙醇洗去杂质，然后使用体积比浓度为80％的乙醇解吸；大孔吸附树脂型号为SP825L。

各组分均按质量体积比浓度计，优化后的最优的培养基配方为SGY(％)：可溶性淀粉3.1％，葡萄糖1.28％，酵母粉1.44％，硝酸钠(NaNO

本发明筛选获得了一株能够产paraherquamide A的青霉菌株，并且本发明经过培养条件优化，使得生物发酵培养时paraherquamide A的产量得到了提高，最高比初始产量(42mg/L)提高了约6倍。并进一步优化了分离纯化的方法，能够获得较为纯净的产物。

附图说明

图1为菌株KWF31的菌落图。

图2为不同碳源对发酵水平的影响结果图。

图3为可溶性淀粉含量对发酵水平的影响结果图。

图4为葡萄糖含量对发酵水平的影响结果图。

图5为不同氮源对发酵水平的影响结果图。

图6为酵母粉含量对发酵水平的影响结果图。

图7为NaNO

图8为不同无机盐对发酵水平的影响结果图。

图9为MgSO

图10为不同微量元素含量对发酵水平的影响结果图，其中，A为Mn元素，B为Zn元素，C为Co元素。

图11为接种孢子浓度对发酵水平的影响结果图。

图12为温度对发酵水平的影响结果图。

图13为初始pH对发酵水平的影响结果图。

图14为不同乙醇洗脱比例对MAR解吸PHQ A的影响结果图。

图15为不同乙醇浓度洗脱后液相分析图，其中，A：菌液；B：20％乙醇浓度；C：80％乙醇浓度，箭头所指的峰为目标产物paraherquamide A。

具体实施方式

本申请发酵使用的菌株为青霉(Penicillium sp.)KWF31，分离自海洋沉积物样品。已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日为2022年10月21日，保藏号CCTCCNO.M 20221625。

本申请中培养基中添加成分，包括碳源、氮源、无机盐，均以质量体积比计。

实施例1

菌株KWF31的采集、分离和鉴定

从南海(16°43′43.64″N，110°28′23.84″E，深度1352m)采集到沉积物样品，沉积物用灭菌海水冲稀释后涂布于2216E固体培养基上25℃静置培养、根据菌斑外形及颜色挑取单菌落，采用平板划线分离的方法纯化得到一株丝状真菌，命名为KWF31，后移至斜面4℃保存备用。

在培养基上，菌株KWF31的菌落生长速度较快，质地疏松，平坦，丝绒放射状，边缘整齐；分生孢子球形，呈深绿色，最外围紫粉色，如图1所示。

提取菌株DNA，对提取出的DNA基因进行ITS片段的扩增，所用的引物为ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。扩增获得的ITS序列为546bp，序列如SEQ ID No.1所示。

将ITS序列与NCBI数据库数据进行对比，KWF31与数据库中多株青霉Penicilliumsp.相似度达98％以上，将其鉴定为青霉Penicillium sp.，命名为青霉(Penicillium sp.)，株号KWF31，保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日为2022年10月21日，保藏号CCTCC NO.M 20221625。

实施例2

发酵培养基的单因素优化实验：碳源优化。

培养基中碳源不仅是微生物生长主要的能量来源，也是构成微生物细胞成分和代谢产物中的主要元素。本实验采用微生物培养常用的碳源：蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、甘露醇这6种碳源替换基础培养基(察氏培养基：蔗糖30.0g，硝酸钠3.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁(MgSO

由图2可以看出，并不是所有的碳源均可以产Paraherquamide A，当碳源为乳糖时基本不产，而当可溶性淀粉作为碳源时，Paraherquamide A的产量最高，因此选择可溶性淀粉为最佳碳源。在此基础上，进一步对可溶性淀粉的配方含量进行考察，以添加0.5％可溶性淀粉含量为对照。发酵结果如图3所示。

由图3可知，随着淀粉含量的增加，效价也增大，当可溶性淀粉含量在2.5％时，效价最高，而当含量继续增大时，效价逐渐下降。可能是由于过高含量的可溶性淀粉对菌体产次级代谢产物产生抑制作用，从而不利于Paraherquamide A的积累，因此选择可溶性淀粉含量为2.5％。

微生物在发酵过程中需要不同的碳源，快速碳源和慢速碳源。快速碳源多是小分子碳源，容易被吸收利用，利于微生物前期的快速生长，但成分简单，不利于代谢产物的合成，而慢速碳源虽然利用较慢，但等量的情况下却可以提供更多的能量，有助于次级代谢产物的合成产生。可溶性淀粉是大分子碳源，作为KWF31发酵中的慢速碳源，利于Paraherquamide A的合成，且由图2中可知，葡萄糖的对发酵的影响仅次于可溶性淀粉，所以有必要考察可溶性淀粉和葡萄糖对发酵的影响。其中以可溶性淀粉含量2.5％，葡萄糖含量0％为对照组，实验结果如图4所示。

图4表明，在主要碳源添加2.5％可溶性淀粉的基础上，添加快速碳源葡萄糖有利于Paraherquamide A的合成，在葡萄糖含量1.0％时的效价相比不添加葡萄糖时的效价提高了50％，但随着葡萄糖的增加，Paraherquamide A的合成并没有明显的增加，综合考虑到经济环保等方面，最终确定复合碳源的添加组合为可溶性淀粉2.5％、葡萄糖1.0％。

实施例3

发酵培养基的单因素优化实验：氮源优化。

氮源主要用于微生物合成自身蛋白质和遗传物质的主要来源，也是含氮代谢产物的来源之一。常用氮源可分为有机氮源和无机氮源，本实验探究的有机氮源为蛋白胨、黄豆饼粉、尿素、酵母粉；无机氮源为NaNO

由图5可知，仅添加尿素、(NH4)

由图6可以看出，当氮源含量较低时，氮源含量的增加能给菌体提供足够的养分产生代谢产物，因此发酵效价随着氮源含量增加而增大，但是当氮源含量增加到一定程度时，氮源含量增加反而会使发酵效价减低。实验发现，过高的酵母粉含量会严重抑制菌体的生长，从而不利于Paraherquamide A的积累，因此选择酵母粉含量为1.2％。

有机氮源酵母粉是有利于Paraherquamide A合成的延迟氮源，而在微生物的生长前期，速效氮源通常有利于菌体的生长，因此本实验考虑效氮源与长效氮源搭配添加，由图5中可知，NaNO

从图7中可以看出，在酵母粉作为主要氮源的基础上添加NaNO

实施例4

发酵培养基的单因素优化实验：无机盐优化。

无机盐对发酵过程中微生物的生长及代谢产物生成都具有一定的影响，参与细胞结构物质的组成，构成酶的活性基团，激活酶的活性，调节细胞渗透压等作用。无机盐分为微量元素和大量元素两大类。K

由图8得知，大量元素Mg

实验结果显示，向培养基中添加Mg

实施例5

发酵培养基的响应面优化实验。

单因素实验筛选出的最佳发酵培养基只是各单因素最佳条件的集合，无法明确各因素之间的相互作用，无法获得发酵培养基组分的最佳配比。因此还需要通过响应面实验进一步优化发酵培养基。

一、Plackeet-Burman实验

本实验选取培养基中的八个因素(可溶性淀粉，葡萄糖，酵母粉，NaNO

表1 Plackett-Burman实验设计因素与水平

表2 Plackett-Burman实验设计与结果

表3回归方程误差统计分析

表4中得出的回归模型的P值(0.0243)<0.05，表明该模型显著，即该模型在被研究的整个回归区域的拟合度良好；R

表4 Plackett-Burman实验显著性分析

注：如果P<＝0.05，则说明模型中的因素的影响是显著的。

从表2中可以看出，第3组实验的发酵效价最高，达到248.00μg/mL；第10组实验的发酵效价最低，仅有192.95μg/mL。将实验所得的数据利用Design expert软件回归分析后得多元一次回归方程为：

Y＝221.77+9.63X

由实验显著性分析结果表4可知，对发酵效价影响最大的因素依次为酵母粉X

二、最陡爬坡实验

通过Plackeet-Burman实验设计筛选到影响海洋真菌KWF31生产ParaherquamideA显著影响因素有酵母粉、可溶性淀粉、葡萄糖。在得到各显著因素贡献程度之后，为了确保响应面实验的准确性及可靠性，需要通过最陡爬坡试验逼近中心点。以三个显著因素为考察对象，按照Design expert所拟合的多元一次方程式(1)中各因素的效应系数来设计爬坡步长，其他影响因素的取值则采用单因素实验的最佳条件，其中NaNO

表5最陡爬坡试验设计及结果

根据表5的结果可知，Paraherquamide A的发酵效价在初始值增加5个步长时，达到了最高值，发酵效价可达到257.58mg/mL，产量进一步提高了12.3％，是原始察氏培养基产量的6.13倍。这与之前PB实验结果的预期相符合。而随着步长的增加，发酵效价反而降低，推测可能是因为培养基太浓稠不利于菌株KWF31的生长。因此，将30g/L可溶性淀粉、13.5g/L葡萄糖，14.5g/L酵母粉作为响应面实验的中心点。

三、Box-Behnken设计实验

根据最陡爬坡实验结果，以30g/L可溶性淀粉、13.5g/L葡萄糖，14.5g/L酵母粉作为响应面实验设计零水平，将这三种因素运用Box-Behnken设计实验法，通过构建多元回归方程模型，拟合得到响应值与变量间关系，并以3D图形方式直观显示产量与变量间的相互作用，来优化野生株KWF31发酵培养基组分，从而使Paraherquamide A的发酵单位更高。本实验借助统计分析软件Design expert 8.0.2设计实验方案，实验中三个因素各取3水平，分别用“-1，0，1”表示，各个因素真实值和编码值见表6，发酵后测定17组样品发酵效价值见表7。

表6试验因素水平编码及水平设置

表7 Box-Behnken设计实验结果表

表8 Box-Behnken设计实验结果的ANOVA分析

由表8可以看出，在一次方项上可溶性淀粉P值均小于0.01，说明可溶性淀粉对Paraherquamide A的发酵效价有极显著的影响；决定系数R

Y＝215.49+11.5X

利用design-expert8.02软件获得最佳优化条件和预测结果。当X

四、发酵条件优化

(1)接种量优化

本实验考察不同接种量对发酵的影响，发酵结果如图11所示。

由图11可知，接种终浓度10

(2)温度优化

每种微生物都有其最适和能耐受的范围，微生物在生长代谢活动中其最适温度也不尽相同，主要是因为微生物体内各种酶都有其最适温度。本实验考察不同温度对发酵的影响，其结果见图12。

由图12可知，随着温度的升高，发酵效价先上升后下降，温度在25℃时发酵效价最高。虽然23℃与25℃的发酵效价差别不大，但是考虑到经济环保的角度，最终选择25℃作为发酵培养的温度。

(3)初始pH优化

本实验考察了发酵初始pH对Paraherquamide A合成的影响，实验结果如图13。

由图13可知，发酵液初始pH对发酵结果有明显的影响作用。随着pH的增加，Paraherquamide A的发酵效价呈现先上升后下降的趋势，初始pH 7.0时，达到最高点，猜测可能是在偏中性的环境下更有利于该菌株的生长。

综上所述，通过单因素实验和响应面优化实验，确定了优化后的培养基配方为SGY(％)：可溶性淀粉3.1％，葡萄糖1.28％，酵母粉1.44％，硝酸钠(NaNO3)0.8％，MgSO

实施例6

分离纯化工艺优化筛选。

(1)大孔树脂预处理方法：

a.取适量大孔树脂放置与容器中，用无水乙醇浸泡24h，然后过滤，水洗至无醇味；

b.用质量分数5％的HCI溶液浸泡4-6h，然后过滤，水洗至中性；

c.用质量分数5％的NaOH溶液浸泡4-6h，然后过滤，水洗至中性。

d.大孔树脂如果长时间不用，需保存在95％乙醇中，防止滋生细菌产生污染。

(2)大孔树脂含水率测定

称取六种2.00g(湿重)预处理好的大孔树脂置于恒重的样品瓶内，在70℃的干燥箱中烘36h，取出并置于干燥器内冷却0.5h，称其质量；在同样的温度条件下再烘30min，取出并置于干燥器内冷却0.5h，称其质量。重复前面测重过程，直到前后两次质量差<0.003g。根据烘干前后的质量差计算其含水率。每种树脂在测定含水率时取三份平行样，以保证称量的精确性。含水率结果如表9所示。

表9大孔吸附树脂含水率％

(3)大孔树脂型号筛选

a.配制PHQ A初试浓度C

b.分别称取0.5000g(干重)预处理过的六种树脂，置于500mL锥形瓶中，每个锥形瓶中加入0.22mg/mL PHQ A粗品溶液250mL(V

c.吸附结束后，取锥形瓶中的上层清液500μL，加500μL液相甲醇充分混匀后过0.45μm有机滤膜，进HPLC检测其峰面积，得到吸附后溶液PHQ A质量浓度C

d.然后将吸附后的树脂转移至另一个干净的500mL锥形瓶中，加入80％乙醇水溶液250mL(V

e.解吸完成后，取锥形瓶中的上层清液500μL，加500μL液相甲醇充分混匀后过0.45μm有机滤膜，进HPLC检测其峰面积，得到解吸后溶液PHQ A质量浓度C

f.计算6种树脂对PHQ A的比吸附容量(mg/g)、吸附率(％)和解吸率(％)。按式(3)～式(5)计算。

式中：C

C

C

V

V

m为湿树脂的质量，g。

表10不同树脂对Paraherquamide A的吸附性能

如表10所示，综合考虑吸附量和解析率，最终决定使用SP825L型号对PHQ A这个化合物进行吸附纯化工艺优化。

(4)乙醇洗脱浓度

a.准备9L菌液，取上层清液500μL，加500μL液相甲醇充分混匀后过0.45μm有机滤膜，进HPLC检测PHQ A峰面积。

b.分别称取30份1.0000g(湿重)预处理过的SP825L，置于500mL锥形瓶中，每个锥形瓶中加入300mL菌液，置于恒温振荡器，在室温(25℃)、180r/min条件下吸附3h。

c.吸附结束后，取锥形瓶中的上层清液500μL，加500μL液相甲醇充分混匀后过0.45μm有机滤膜，进HPLC检测其峰面积。

d.然后将吸附后的树脂转移至另一个干净的500mL锥形瓶中，分别加入(v/v)10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇水溶液100mL(平行3份)，置于恒温振荡器，在在室温(25℃)，180r/min条件下解吸24h。

e.解吸完成后，取锥形瓶中的上层清液1mL，过0.45μm有机滤膜，进HPLC检测其峰面积。

表11不同乙醇洗脱比例对MAR解吸PHQ A的影响

由表11及图14所示，选取10％、20％、30％为洗杂浓度，80％、90％、100％乙醇浓度为解吸浓度，组合进行实验，得到表12，确定以20％乙醇浓度洗去杂质，再用80％乙醇溶液进行解吸。

表12不同乙醇洗脱比例对MAR解吸PHQ A的影响

如图15所示，确定以20％乙醇浓度洗去杂质，再用80％乙醇溶液进行解吸PHQ A。