卵巢癌类器官的培养基、培养方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于卵巢癌类器官培养的培养基、使用该培养基培养卵巢癌类器官的方法、及其在药物的疗效评估和筛选中的应用。

背景技术

卵巢癌是指发生在卵巢的恶性肿瘤性疾病，是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。卵巢癌以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤，其中卵巢上皮癌死亡率占各类妇科肿瘤的首位，对女性生命可造成严重威胁。卵巢癌早期多无症状，晚期可出现下腹不适、腹胀、食欲下降等消化道症状，主要的治疗方式包括手术切除、药物治疗和放射治疗，总体预后较差。

传统临床药物敏感性检测大多采用二维细胞培养。然而，二维培养的细胞仅在有限程度上模拟组织生理条件，缺乏体内真实的组织结构，易导致低分化水平和细胞生理功能的丢失，进而导致获得的实验结果很难预测临床实际结果。类器官，属于三维(3D)细胞培养物，主要来源于人体具有分化能力的胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞和成体干细胞。不同组织器官都存在内源组织干细胞，在维持各器官的功能形态发挥着重要作用。这些干细胞在体外一定的诱导条件下，可以自组织形成一个直径仅为几毫米的迷你结构。肿瘤类器官是用取自患者体内原发性肿瘤，在实验室中培养出一些微型的3D肿瘤细胞模型。肿瘤类器官高度模拟了来源肿瘤组织的特征，保留了个体之间的肿瘤异质性，可用于功能性的测试，如进行高通量药物筛选和个体化精准治疗。

当前，卵巢癌类器官培养方法多采用R-spondin-1、Noggin以及一些昂贵的蛋白因子，导致类器官培养成本较高；且这项技术操作复杂和技术难度大，导致其大规模商业化应用受到限制。因此，需要开发一种低成本、简单且成功率高的类器官培养方法和培养基。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于在体外快速扩增卵巢癌类器官的培养基及培养方法。

本发明的一个方面在于提供一种卵巢癌类器官的培养基，所述培养基包含MST1/2激酶抑制剂；B27添加剂；N2添加剂；胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂；胰岛素；表皮细胞因子；胎牛血清；碱性成纤维生长因子；成纤维细胞生长因子7；以及选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的Rho蛋白酶抑制剂。其中，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。

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最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。

另外优选地，本发明的Rho蛋白激酶抑制剂为Y27632。

在本发明的实施方式中，本发明的培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：

(1)所述MST1/2激酶抑制剂的浓度范围通常为2.5～40μM，更优选为5～20μM；

(2)所述B27添加剂相对于培养基的体积比范围通常为1：25～1：400，更优选为1：50～1：100；

(3)所述N2添加剂相对于培养基的体积比范围通常为1：100～1：800，更优选为1：200～1：800；

(4)所述表皮细胞因子的浓度范围通常为2.5～10ng/mL；

(5)所述胰岛素的浓度范围通常为0.25～4μg/mL，更优选为0.5～1μg/mL；

(6)所述胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂相对于培养基的体积比范围通常为1:50～1:400，更优选为1:50～1:200；

(7)所述Rho蛋白激酶抑制剂的浓度范围通常为2.5～40μM，更优选为5～10μM；

(8)所述胎牛血清相对于培养基的体积比范围通常为1.25％(v/v)～20％(v/v)，更优选为5％(v/v)～20％(v/v)；

(9)所述碱性成纤维生长因子的浓度范围通常为2.5～20ng/mL，更优选为2.5～10ng/mL；

(10)所述成纤维细胞生长因子7的浓度范围通常为2.5～20ng/mL，更优选为5～20ng/mL。

在本发明的实施方式中，所述培养基还含有选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。

在优选的实施方式中，当抗生素选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/mL，青霉素浓度范围为25～400U/mL，当抗生素选自两性霉素B时，浓度范围为0.25～4μg/mL，当抗生素选自Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL。

根据第二个方面，本发明还提供一种卵巢癌类器官的体外培养方法。本发明的卵巢癌类器官的体外培养方法中，使用本发明的卵巢癌类器官培养基对卵巢癌原代细胞进行体外培养。

本发明的卵巢癌类器官培养方法包括以下步骤：

1.从卵巢癌实体瘤组织分离样本，获得卵巢癌原代细胞。该处理过程包括以下步骤。

(1)分离卵巢癌组织样本，按1:3的体积比加入基础培养基和组织消化液(注：组织消化液的加入量是1g肿瘤组织使用约5-10mL组织消化液)，置于恒温摇床中进行消化，消化温度范围为4～37℃，消化转速范围为200rpm～350rpm；

(2)消化充分直至未见明显组织块即可终止消化，消化时间为3～6小时；

(3)离心后弃去上清液，离心转速范围为1200～1600rpm，离心时间为2～6分钟，加入基础培养基重悬备用。

其中，基础培养基配方包括选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。组织消化液配方包括1640培养基、胶原酶Ⅱ(1～2mg/mL)、胶原酶Ⅳ(1～2mg/mL)、DNA酶(50～100U/mL)、透明质酸酶(0.5～1mg/mL)、氯化钙(1～5mM)、牛血清白蛋白BSA(5～10mg/mL)。

2.使用本发明的卵巢癌类器官培养基进行培养

将上述步骤1中获得的卵巢癌原代细胞用基础培养基重悬并计数，按照1:1的体积比与基质胶冰上混合均匀，细胞终密度为1～8×10

本发明还提供一种用于评估或筛选治疗卵巢癌疾病的药物的方法，其包括以下步骤：

(1)使用本发明的卵巢癌类器官的培养方法培养卵巢癌类器官；

(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

(3)对(1)中培养得到的类器官添加稀释后的所述药物；

(4)进行类器官大小或类器官活力测试。

本发明的技术方案能够取得以下技术效果：

(1)提高卵巢癌类器官培养的成功率，成功率达到90％以上；

(2)保证体外原代培养的卵巢癌类器官能够保持病人的病理特性；

(3)扩增效率高，能快速培养出卵巢癌类器官，扩增出的卵巢癌类器官还可以连续传代；

(4)培养成本可控，培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、Noggin蛋白、BMP抑制剂、成纤维细胞生长因子10(FGF10)等因子；

(5)所述技术培养获得的卵巢癌类器官数量大，适合高通量筛选候选化合物和为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。

附图说明

图1为表示卵巢癌类器官培养基中不同添加因子组合对卵巢癌类器官生长的影响的图。

图2A-2J为显示卵巢癌类器官培养基的添加因子的不同浓度对卵巢癌类器官生长影响的图。

图3A-3F为利用显微镜观察使用本发明的卵巢癌类器官培养基培养得到的卵巢癌类器官的照片。

图4A-4G为原始卵巢癌组织细胞的免疫组化结果。

图5A-5G为使用本发明的卵巢癌类器官培养基培养原始卵巢癌组织细胞至第三代得到的卵巢癌类器官的免疫组化结果。

图6为分别使用本发明的卵巢癌类器官培养基和文献培养基对卵巢癌原代细胞进行培养得到的卵巢癌类器官的显微镜照片。

图7A和7B显示使用本发明的卵巢癌类器官培养基培养得到卵巢癌类器官进行药物敏感性测试的结果，其中图7A显示未加药处理时类器官生长的照片和加药处理3天后类器官生长的照片；图7B显示不同浓度的测试药物对卵巢癌类器官生长的药物敏感图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]

本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并降低其活性的化合物。

1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯

2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。

2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。

2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备

本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。

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实施例1卵巢癌类器官培养基中各添加因子对卵巢癌类器官生长的影响

(1)卵巢癌类器官培养基的配制

首先配制含有初始培养基的基础培养基。初始培养基可选自本领域常用的DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640。在本实施例中，基础培养基的配方为：DMEM/F12培养基(购自Corning公司)+100μg/mL Primocin(购自InvivoGen公司，0.2％(v/v)，市售产品浓度50mg/ml)。在基础培养基内分别加入不同种类的添加剂(参见表1)配制成含有不同添加成分的卵巢癌类器官培养基。

(2)卵巢癌原代细胞的分离和处理

1样品选择

卵巢癌实体瘤组织样品(术中/内镜)由专业医疗机构的专业医务人员从患者获取，患者均签署了知情同意书。术中样本0.25cm

2材料准备

15mL无菌离心管、移液枪、10mL移液管、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。提前30分钟从4℃冰箱取出基础培养基，提前30分钟从-20℃冰箱取出组织消化液(配方如下)。

组织消化液：1640培养基(Corning，10-040-CVR)、胶原酶Ⅱ(2mg/mL)、胶原酶Ⅳ(2mg/mL)、DNA酶(50U/mL)、透明质酸酶(0.75mg/mL)、氯化钙(3.3mM)、BSA(10mg/mL)。

以上提及的胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、DNA酶、和透明质酸酶均购自Sigma公司；氯化钙购自生工生物工程(上海)股份有限公司；BSA购自Biofroxx公司。

3.卵巢癌原代细胞的分离

3.1超净台中取组织样品于培养皿中，去除带血液的组织，用基础培养基冲洗2次，将组织转移至另一培养皿中用无菌手术刀进行机械分离，将组织块分割为1×1×1mm

3.2将切割后的术中或内镜组织吸至15mL离心管中，加入5mL基础培养基，混匀，于1500rpm离心4分钟；

3.3弃上清，按1:3比例加入基础培养基和组织消化液(注：组织消化液的加入量是1g肿瘤组织使用约10mL组织消化液)，标记样品名称及编号，用封口膜密封，在37℃下于300rpm摇床(知楚仪器ZQLY-180N)中进行消化，期间每30分钟观察消化是否完成，判断依据为无肉眼可见的颗粒物，消化时间约4小时；

3.4消化完成后，经100μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用基础培养基冲洗入离心管中以减少细胞损失，于25℃下1500rpm离心4分钟；

3.5弃上清，观察是否有血细胞，若有血细胞，加8mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解20分钟，期间颠倒混匀一次，25℃下1500rpm离心4分钟；

3.6弃上清，加入2mL基础培养基重悬细胞，备用。

4细胞计数及处理

4.1镜下观察：移取少量重悬细胞平铺于培养皿中，显微镜(CNOPTEC，BDS400)下观察癌细胞密度和形态；

4.2活细胞计数：取重悬的细胞悬液12μL，12μL台盼蓝染液(生工生物工程(上海)股份有限公司)充分混合后，取20μL加入细胞计数板(Countstar，规格：50片/盒)，细胞计数仪(Countstar，IC1000)下计算出活的大细胞(细胞粒径>10μm)百分率＝活细胞数/总细胞数×100％。

(3)卵巢癌类器官的培养

将按照上述步骤(2)从2例卵巢癌组织(编号为L55、L56)分离得到的卵巢癌原代细胞用基础培养基重悬并计数，按照1:1的体积比与基质胶(

表1培养基中的添加成分及促细胞增殖效果

其中，“+”表示与基础培养基相比，加入该添加成分的培养基对从卵巢癌组织分离出的卵巢癌原代细胞中的至少两例有促进增殖的作用；“－”表示添加该添加成分的培养基对从卵巢癌组织分离出的卵巢癌原代细胞中的一例显示促进增殖的作用；“○”表示添加该添加成分的培养基对从卵巢癌组织分离出的卵巢癌原代细胞的增殖无明显的影响。

根据以上结果，拟选择化合物1、B27、N2、表皮细胞因子、胰岛素、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、Y-27632、胎牛血清、碱性成纤维生长因子、Forsklin、成纤维细胞生长因子7、霍乱毒素等添加成分进行进一步培养实验。

实施例2卵巢癌类器官培养基中不同添加因子的组合对卵巢癌类器官生长的影响

根据表2中的成分配制不同添加因子组合的卵巢癌类器官培养基，考察不同添加因子组合对卵巢癌类器官的促生长作用。

表2不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从卵巢癌组织(编号为L53、L57、L58)获得卵巢癌原代细胞，用基础培养基重悬并计数，按照1:1的体积比与基质胶(

根据图1的结果可知，与基础培养基相比，在使用上述No.1～No.13培养基时，均能够不同程度地促进卵巢癌原代细胞的增殖。当省略添加因子Forsklin(No.11)、霍乱毒素(No.13)时，培养基配方的促增殖作用更为明显。因此，在后续实施例中，使用含化合物1、B27、N2、表皮细胞因子、胰岛素、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、Y-27632、胎牛血清、碱性成纤维生长因子、成纤维细胞生长因子7等因子作为培养卵巢癌类器官的培养基配方进行进一步研究。

实施例3卵巢癌类器官培养基所添加因子的不同浓度对卵巢癌类器官的增殖作用

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从卵巢癌组织(编号为L74)获得卵巢癌原代细胞，用基础培养基重悬并计数，按照1:1的体积比与基质胶(

接着，配制含有基础培养基BM、20μM化合物1、1:50(v/v)B27、1:100(v/v)N2、10ng/mL表皮细胞因子、1μg/mL胰岛素、1:100(v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、10μM Y-27632、10％(v/v)胎牛血清、10ng/mL碱性成纤维生长因子、5ng/mL成纤维细胞生长因子7的卵巢癌类器官培养基和以下10种配方培养基进行实验。

配方1：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含化合物1；

配方2：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含B27；

配方3：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含N2；

配方4：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含表皮细胞因子；

配方5：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含胰岛素；

配方6：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂；

配方7：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含Y-27632；

配方8：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含胎牛血清；

配方9：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含碱性成纤维生长因子；

配方10：上述卵巢癌类器官培养基组分中不含成纤维细胞生长因子7；

在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的化合物1每孔100μL，化合物1的终浓度分别为2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的B27每孔100μL，B27相对于培养基的体积比分别为1:400(v/v)、1:200(v/v)、1:100(v/v)、1:50(v/v)、1:25(v/v)；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的N2每孔100μL，N2相对于培养基的体积比分别为1:800(v/v)、1:400(v/v)、1:200(v/v)、1:100(v/v)、1:50(v/v)；并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的表皮细胞因子每孔100μL，表皮细胞因子的终浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的胰岛素每孔100μL，胰岛素的终浓度分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂每孔100μL，胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂相对于培养基的体积比分别为1:400(v/v)、1:200(v/v)、1:100(v/v)、1:50(v/v)、1:25(v/v)；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的Y-27632每孔100μL，Y-27632的终浓度分别为2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方8的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的胎牛血清每孔100μL，胎牛血清相对于培养基的体积比分别为1.25％(v/v)、2.5％(v/v)、5％(v/v)、10％(v/v)、20％(v/v)；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方9的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的碱性成纤维生长因子每孔100μL，碱性成纤维生长因子的终浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL；并使用配方9的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方10的培养基时，在接种有原代细胞的96孔板中分别添加配制好的成纤维细胞生长因子7每孔100μL，成纤维细胞生长因子7的终浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL；并使用配方10的培养基设置对照孔(BC)。

待类器官培养7-10天后，分别参比对照孔(BC)细胞数计算相对增殖倍数，将结果分别示于图2A～2J。图2A～2J中，相对增殖倍数为使用各培养基培养类器官培养7～10天后的卵巢癌类器官增殖倍数，与对应的对照孔培养7～10天后的卵巢癌类器官增殖倍数的比值。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基；比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。

根据图2A～2J的结果，化合物1的浓度范围优选为2.5～40μM，更优选为5～20μM；B27添加剂相对于培养基的体积比范围优选为1:25(v/v)～1:400(v/v)，更优选为1:50(v/v)～1:100(v/v)；N2添加剂相对于培养基的体积比范围优选为1:100～1:800，更优选为1:200～1:800；表皮细胞因子的浓度范围优选为2.5～10ng/mL；胰岛素的含量优选为0.25～4μg/ml，更优选为0.25～1μg/ml；胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂相对于培养基的体积比范围优选为1:50(v/v)～1:400(v/v)，更优选为1:50(v/v)～1:200(v/v)；Y-27632的含量优选为2.5～40μM，更优选为5～10μM；胎牛血清的体积含量优选为1.25～20％(v/v)，更优选5～20％(v/v)；碱性成纤维生长因子的含量优选为2.5～20ng/ml，更优选为2.5～10ng/ml；成纤维细胞生长因子7的含量优选为2.5～20ng/ml，更优选为5～20ng/ml。

在下面实施例中使用的本发明的卵巢癌类器官培养基，其含有：基础培养基BM、10μM化合物1、1:100(v/v)B27、1:200(v/v)N2、5ng/mL表皮细胞因子、0.5μg/mL胰岛素、1:200(v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、10μM Y-27632、10％(v/v)胎牛血清、5ng/mL碱性成纤维生长因子、和5ng/mL成纤维细胞生长因子7(以下称为“OC-3”培养基)。

实施例4卵巢癌类器官培养

按照实施例1之(2)所述的方法获得卵巢癌原代细胞(L65、L66、L70、L74、L82、L84)，并用基础培养基重悬并计数，按照1:1的体积比与基质胶(

实施例5培养的卵巢癌类器官组化鉴定

从一例卵巢癌患者的术中组织(样本编号L74)取出约0.25cm

图4A-4G和5A-5G分别是原始组织和采用本发明的卵巢癌类器官培养基OC-3培养原始组织细胞而获得的卵巢癌类器官的免疫组化结果对比图。其中，图4A和图5A分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌类器官的标记ER抗体的图片，图4B和图5B分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌类器官的标记PR抗体的图片，图4C和图5C分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌类器官的标记P53抗体的图片，图4D和图5D分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌类器官的标记NapsinA抗体的图片，图4E和图5E分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌类器官的标记Pax-8抗体的图片，图4F和图5F分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌类器官的标记WT-1抗体的图片，图4G和图5G分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌类器官的标记Ki-67抗体的图片。由此可以确认，采用本发明技术培养的卵巢癌类器官培养至第3代时，卵巢癌类器官上与卵巢癌相关的生物标记物的表达情况与卵巢癌类器官来源的原始组织切片的标记物表达情况基本一致。这说明采用本发明技术所培养的卵巢癌类器官保持了卵巢癌病人癌组织的原始病理特性。

实施例5与文献培养基培养效果的比较

(1)培养基的配制

文献培养基(Oded Kopper等，Nature medicine，2019，838-849)：DMEM/F12+25％(v/v)Wnt3A(购自Invitrogen)+1％青霉素/链霉素+1:100(v/v)谷氨酰胺添加剂(购自thermo)+1％(v/v)HEPES(购自Gibco)+1:100(v/v)N2(购自Gibco)+10ng/mL表皮细胞因子(购自R&D)+100ng/mL Noggin(购自R&D)+100ng/mL FGF10(购自R&D)+1mM烟酰胺(购自MCE)+9μM Y-27632(购自MCE)+0.5μM SB431542(购自MCE)。

(2)卵巢癌原代细胞获取与卵巢癌类器官培养

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从术中组织样本(编号为L68)获得卵巢癌原代细胞，并用基础培养基重悬并计数，按照1:1的体积比与基质胶(

根据图6的结果可知，与文献培养基相比，本发明的卵巢癌类器官培养基体外培养卵巢癌类器官时，类器官数量多且类器官结构完整，其效果明显优于文献培养基。

实施例6使用本发明的培养基扩增得到的卵巢癌类器官用于药物筛选

(1)卵巢癌类器官培养

从卵巢癌术中样本(L74)按照实施例1之(2)的方法分离得到卵巢癌原代细胞，并使用OC-3培养基进行类器官培养，待卵巢癌类器官直径超过50μm时进行药物筛选。

(2)筛选药物配制

按照下表配制5个浓度梯度的2种药物(卡铂、吉西他滨；均购自MCE公司)，保存待用。

表3药物作用浓度设置

(3)加药

取出配制好的药物，置于室温，将药物用OC-3培养基配制后备用。从孵箱取出按照步骤(1)培养获得的类器官，去除培养孔中的培养基，将含有药物的培养基400μL沿着孔壁慢慢将入到培养孔。加药结束后，48孔板表面消毒后移至培养箱中继续培养，3天后测定类器官活力。

(4)类器官活力测试

4℃冰箱取出CellTiter-Glo发光试剂(购自Promega公司)，培养箱中取出待检测48孔板，每孔加入50μL CellTiter-Glo发光试剂，静置30分钟后混匀，使用多功能酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测。

(5)数据处理

按照公式药物相对活率(％)＝(第三天培养孔化学发光数值药物处理组/第零天培养孔化学发光数值药物处理组)*100％，计算得到不同药物的相对活率，将结果示于图7A和7B。图7A为4倍物镜下显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)拍摄的未加药处理时类器官生长的照片和加药处理3天后类器官生长的照片，图7B为不同浓度的测试药物对卵巢癌类器官生长的药物敏感性曲线图。

由图7A和7B可以确认，使用本发明的类器官培养基OC-3培养得到的卵巢癌类器官可进行药物筛选，根据结果可以判断卵巢癌患者在临床使用该种药物时的有效性。

工业应用性

本发明提供一种用于卵巢癌类器官培养的培养基及培养方法，可将培养得到的类器官应用于药物的疗效评估和筛选。因而，本发明适于工业应用。

尽管本文对本发明作了详细说明，但本发明不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。