一种无丙二酸柠檬酸杆菌及其催化生产2’-脱氧鸟苷的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种利用无丙二酸柠檬酸杆菌及其催化生产2’-脱氧鸟苷的方法。

背景技术

2’-脱氧鸟苷(2’-Deoxyguanosine)，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子脱氧核糖核酸(DNA)的结构片段，其化学结构式如式1所示。

2’-脱氧鸟苷作为一种重要的遗传物质组成成分，与其他的天然核苷一起参与着生物细胞的遗传信息的传递，对生物体细胞的生长调控起到非常重要的作用。2’-脱氧鸟苷可以作为化学试剂用于生化研究，在药物研发领域，经过研究发现，2’-脱氧鸟苷自身具有良好的生理活性，其不但是基因药物领域的重要原料，也可以作为中间体去生成抗病毒、抗肿瘤及抗艾滋病等药物。例如，以2’-脱氧鸟苷为原料制备的6-双硫取代-2’-脱氧鸟苷类化合物对多种类型肿瘤表现出显著的抑瘤作用，可应用于人体细胞增殖相关的肿瘤的药物中。另外，随着2019新型冠状病毒肺炎COVID-19的快速传播，作为病毒检测试剂盒中较为重要的一种前体原料，对2’-脱氧鸟苷的需求量也在急剧增加。

2’-脱氧鸟苷的传统制备是以DNA为原料，通过核酸酶水解为脱氧核苷酸，然后再用酶去除磷酸，生成脱氧核苷后从中分离出2’-脱氧鸟苷，该方法生产成本高，DNA来源问题也限制了2’-脱氧鸟苷的工业化生产。现目前，可用于2’-脱氧鸟苷制备的方法主要有化学合成法和生物酶催化法。关于化学合成法制备2’-脱氧鸟苷存在反应步骤长，反应条件较为苛刻，导致最终收率偏低，且反应过程中也需要用到各种有机试剂，对环境污染较为明显，因此，化学合成法制备2’-脱氧鸟苷不适于大规模工业化生产。而生物酶催化法制备2’-脱氧鸟苷已有多篇专利报道，如专利CN 104830930B公开了一种生物转化法生产脱氧鸟苷的方法，其通过采用发酵乳杆菌菌体浆状物为生物催化剂，在聚乙二醇10000/磷酸氢二钾双水相系统下进行生物催化反应，得到2’-脱氧鸟苷产物，最佳条件下胸苷转化率可达89％；专利CN 102174618A中也公开了一种利用乙酰短杆菌转化生产2’-脱氧鸟苷的方法，该专利通过采用具有核苷磷酸化酶活性的乙酰短杆菌菌体作为酶源，将其与作为转化反应底物的胸苷及鸟嘌呤供体混合进行转化反应合成2’-脱氧鸟苷；另，专利CN 108018252A中也公开了一种利用酶催化制备2’-脱氧鸟苷的方法，其利用重组大肠杆菌获得N-脱氧核糖转移酶去直接催化胸苷和鸟嘌呤合成2’-脱氧鸟苷。以上专利均公开了生物酶催化制备2’-脱氧鸟苷的方法，但是，专利CN 104830930B中用到的菌为乳杆菌，属于一种兼性厌氧菌，在常规培养条件下较难获得菌体，且反应体系为双水相体系，工艺较为复杂，制造成本高，不利于工业化应用；专利CN 102174618A中催化反应中的底物浓度较低，反应转化率也仅有60％，不适于工业化应用；专利CN 108018252A中重组大肠杆菌菌株需要在培养过程中添加昂贵的诱导剂才可以诱导N-脱氧核糖转移酶的合成，另，作为异源表达蛋白，重组菌在表达N-脱氧核糖转移酶时存在蛋白折叠不成功，易产生包涵体的问题，且以上所公开的酶催化专利均需要对菌体进行离心处理，大多需要对菌体进行破壁处理才可以获得相应的催化酶进行后续的催化反应，该过程显著增加了工艺步骤，增加了生产成本，从而不利于工业化应用。

发明内容

基于上述技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.24523，保藏日期为2022年03月11日，并登记在册，证明存活。

本发明的另一目的在于提供了无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液的新用途。

本发明提供了无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液在生产嘌呤核苷酸磷酸化酶或含嘌呤核苷酸磷酸化酶的产品中的应用。

本发明提供了无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)或其种子液或其发酵液或其菌悬液或其培养液中在制备2’-脱氧鸟苷或含2’-脱氧鸟苷的药物组合物中的应用。

作为一种实施方式，上述应用中所述的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)为上述所述的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005。

本发明的再一目的在于提供了一种嘌呤核苷酸磷酸化酶的制备方法，包括采用无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)进行发酵制备。

进一步，所述的发酵过程包括在含有可同化的碳源和/或氮源的产酶培养基里，进行有氧发酵。

进一步，所述的碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘油或果糖；优选为葡萄糖。

进一步，所述的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素；优选为酵母膏或酵母抽提粉。

进一步，所述的产酶培养基还包括表面活性剂，所述的表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、吐温-20、吐温-80，优选为吐温-80。

进一步，所述的产酶培养基还包括无机盐，所述的无机盐选自柠檬酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰，优选为柠檬酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾或氯化钙。

进一步，所述的产酶培养基含有葡萄糖10-50g/L、酵母膏5-20g/L、酵母抽提粉5-15g/L、吐温-80 2-10g/L、柠檬酸铵2-5g/L、硫酸镁1-5g/L、磷酸二氢钾2-8g/L、氯化钾1-5g/L、氯化钙1-5g/L。

进一步，所述发酵温度为25-37℃，所述培养基pH为5.0-7.0；培养时间为24-72小时；通氧量为0.5-2.0vvm。

进一步，较为具体的，所述无丙二酸柠檬酸杆菌是通过种子液接种至所述酶发酵培养基中进行所述发酵培养的；

其中，所述种子液是将无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)在种子培养基里进行种子培养得到的。

所述种子培养的条件为：种子培养的温度为25℃-37℃；培养基pH为5.0-7.0；培养时间为12-36小时。

所述的种子培养基含有葡萄糖5-30g/L、蛋白胨5-20g/L、酵母膏2-10g/L、酵母抽提粉5-20g/L、氯化钙1-10g/L、硫酸镁1-10g/L、磷酸二氢钾1-10g/L。

作为一种具体实施方式，上述嘌呤核苷酸磷酸化酶的制备方法中所述的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)为上述所述的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005。

本发明还有一个目的在于提供了一种2’-脱氧鸟苷的制备方法。

本发明所述的2’-脱氧鸟苷的制备方法包括采用权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005进行发酵得到含嘌呤核苷酸磷酸化酶的发酵液，并向所述的发酵液中加入磷酸盐、脱氧胸苷和鸟苷，得到2’-脱氧鸟苷。

进一步，所述的发酵过程包括在含有可同化的碳源和/或氮源的产酶培养基里，进行有氧发酵。

进一步，所述的碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘油或果糖；优选为葡萄糖。

进一步，所述的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨或尿素；优选为酵母膏或酵母抽提粉。

进一步，所述的产酶培养基还包括表面活性剂，所述的表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、吐温-20、吐温-80，优选为吐温-80。

进一步，所述的产酶培养基还包括无机盐，所述的无机盐选自柠檬酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰，优选为柠檬酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾或氯化钙。

进一步，所述的产酶培养基含有葡萄糖10-50g/L、酵母膏5-20g/L、酵母抽提粉5-15g/L、吐温-80 2-10g/L、柠檬酸铵2-5g/L、硫酸镁1-5g/L、磷酸二氢钾2-8g/L、氯化钾1-5g/L、氯化钙1-5g/L。

进一步，所述发酵温度为25-37℃，所述培养基pH为5.0-7.0；培养时间为24-72小时；通氧量为0.5-2.0vvm。

进一步，较为具体的，所述无丙二酸柠檬酸杆菌是通过种子液接种至所述酶发酵培养基中进行所述发酵培养的；

其中，所述种子液是将无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)在种子培养基里进行种子培养得到的。

所述种子培养的条件为：种子培养的温度为25℃-37℃；培养基pH为5.0-7.0；培养时间为12-36小时。

所述的种子培养基含有葡萄糖5-30g/L、蛋白胨5-20g/L、酵母膏2-10g/L、酵母抽提粉5-20g/L、氯化钙1-10g/L、硫酸镁1-10g/L、磷酸二氢钾1-10g/L。

作为一种实施方式，所述的磷酸盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，两者添加比例均为0.05-0.5mol/L，优选的所述的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等物质的量加入。

作为一种实施方式，所述的脱氧胸苷的初始终浓度为20-40g/L，鸟苷的初始终浓度为25-50g/L。

作为一种实施方式，上述嘌呤核苷酸磷酸化酶的制备方法中所述的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)为无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)DHE005。

本发明通过以下条件进行HPLC检测：

本发明2’-脱氧鸟苷检测所用的液相检测方法条件如下：

色谱柱：Welch ultimate AQ-C18(250x 4.6mm,5um)

检测波长:260nm；柱温：60℃；流速:1.0ml/min；进样体积:5ul；流动相：10％甲醇溶液等度洗脱。

本发明公开了一种全新的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005，保藏编号为CGMCC NO.24523，该菌株具有极高核苷磷酸化酶活性，此菌种在酶发酵培养基中培养结束后，可以直接向含有菌体的培养基中直接投料进行催化反应，本发明可以直接向含有菌体的培养基中投料进行催化反应，与其他已公开的技术相比，不需要再对菌体进行离心富集，不需要对菌体进行破壁处理，显著减少了催化工艺，且产物2’-脱氧鸟苷的最高浓度可达33.5g/L。

综上所述，与传统工艺相比，本发明技术具有催化工艺简单易操作，催化活性强，产物浓度高，整个催化工艺成本较低，便于工业化生产的系列优点。

附图说明

图1为菌株DHE005(CGMCC NO.24523)在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落特征图。

图2为菌株DHE005(CGMCC NO.24523)对底物进行催化反应后，经HPLC检测的2’-脱氧鸟苷图谱。

具体实施方式

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1：菌株来源

无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005(CGMCC NO.24523)是从中国浙江省台州市天台山养殖场中分离得到。

在天台山养殖场中进行交叉采样，随机取5个采样点，每个点取土壤样品10g，放入锥形瓶中，混合均匀后取样品10g，加入到一个装入90mL无菌水的锥形瓶中(瓶中有一个磁力搅拌器)，漩涡搅拌30分钟，使其充分混匀制成悬浊液，即为10

牛肉膏蛋白胨固体培养基(g/L)：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，琼脂20g/L，pH 7.0。

种子培养基配方(g/L)：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提粉5g/L，碳酸钙15g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸二氢钾1g/L，加水定容至1000mL，pH 7.0±0.1。

发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖50g/L，酵母抽提粉5g/L，酵母粉10g/L，酵母膏10g/L，碳酸钙30g/L，加水定容至1000mL，pH 7.0±0.1。

实施例2：无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005(CGMCCNO.24523)的形态学、培养学特征、生理生化特征。

菌株DHE005在牛肉膏蛋白胨固体培养基30℃培养24h后的菌落特征如图1所示，菌落扁平呈乳白色、凸起、不透明、表明干燥、正反面颜色一致。菌体革兰氏染色阳性，显微镜下观察为杆状、部分菌体中存在芽孢。

参照根据《伯杰氏系统细菌学手册》、《常见细菌系统鉴定手册》等书中的有关内容进行鉴定，菌株的生理反应如表1所示。

表1.无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005(CGMCCNO.24523)生理反应

备注：+：阳性；－：阴性。

实施例3菌种鉴定

无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)DHE005(CGMCC NO.24523)的16S rDNA序列分析参照《分子克隆实验指南》书中的有关内容进行实验。收集菌体，然后用细菌DNA提取试剂盒抽提总DNA。

设计引物：Forward primer27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:2))，Revese primer1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO:3))，进行PCR扩增，PCR产物检测采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物纯化回收采用SanPrep柱式PCR纯化产物试剂盒，纯化后的PCR产物直接送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

菌株DHE005(CGMCC NO.24523)所测的16S rDNA的序列经校对后，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。

菌株DHE005(CGMCC NO.24523)所测得到的16S rDNA序列，提交NCBI与GenBank中相关序列进行BLAST比较，结果见表2(表中只列出同源性较高的模式菌株)。

表2菌株DHE005(CGMCC NO.24523)和典型模式菌株的同源性

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通过对菌株DHE005(CGMCC NO.24523)16S rDNA(SEQ ID NO:1)区域进行测序，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，发现其与无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus strain CECT 863、Citrobacter amalonaticusstrainHAMBI1296、Citrobacter amalonaticus strain 133355-SW-C4-Cam、Citrobacteramalonaticus strain SWTPB14和Citrobacter amalonaticus JCM 1661)同源性均高达99.93％-100％，同时对菌株DHE005(CGMCC NO.24523)进行表观特征试验，发现该菌株和无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)分类相关参数非常接近，故将菌株DHE005(CGMCC NO.24523)鉴定为无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)菌株。

实施例4催化生产2’-脱氧鸟苷

(1)斜面菌种的制备与培养：

斜面培养基配方(g/L)：酵母抽提粉4.0g/L，麦芽抽提物10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，琼脂20.0g/L，消前pH 7.2～7.4，试管30×200mm，装量15mL，经121℃灭菌20min，冷却至55-60℃左右摆斜面，待冷却凝固后，接种至斜面，30±1℃培养3天后，菌种成熟。

(2)种子液的制备与培养：

种子培养基配方：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、酵母抽提粉5g/L、氯化钙2g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾5g/L。消前pH 7.0；250mL规格的三角摇瓶，装量50mL，121℃灭菌20min。接种斜面单菌落1-2颗至种子培养基中，30±1℃，250rpm振荡培养24小时，此时培养液pH 6.8-7.2，菌体OD600为10-20。

(3)酶发酵培养基的制备与菌体培养：

酶发酵培养基配方：葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、酵母抽提粉5g/L、吐温-802g/L、柠檬酸铵2g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钾1g/L、氯化钙1g/L，灭菌前调pH至5.0。250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在25±1℃，250rpm振荡培养72小时。

(4)2’-脱氧鸟苷的催化反应：

无丙二酸柠檬酸杆菌发酵结束后，向发酵液中添加磷酸氢二钠和磷酸二氢钠各0.05mol，升温至40℃，随后加入脱氧胸苷20g/L和鸟苷25g/L，搅拌反应0.5h后结束，经HPLC方法检测催化反应液中2’-脱氧鸟苷的含量，测得为18.4g/L。

实施例5催化生产2’-脱氧鸟苷

(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)；

(2)种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)；

(3)酶发酵培养基的制备与菌体培养：

酶发酵培养基配方：葡萄糖30g/L、酵母膏10g/L、酵母抽提粉10g/L、吐温-806g/L、柠檬酸铵4g/L、硫酸镁3g/L、磷酸二氢钾6g/L、氯化钾3g/L、氯化钙3g/L，灭菌前调pH至6.0。250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在37±1℃，250rpm振荡培养24小时。

(4)2’-脱氧鸟苷的催化反应：

无丙二酸柠檬酸杆菌发酵结束后，向发酵液中添加磷酸氢二钠和磷酸二氢钠各0.1mol，升温至60℃，随后加入脱氧胸苷30g/L和鸟苷35g/L，搅拌反应3h后结束，经HPLC方法检测催化反应液中2’-脱氧鸟苷的含量，测得为27.6g/L。

实施例6催化生产2’-脱氧鸟苷

(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)；一级种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)；

(2)种子罐种子液的制备：

种子罐中种子液培养基配方同实施例4中步骤(2)中种子培养基；

在15L的种子罐中投入10L的种子培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌20min，待冷却至30℃后接入一级的摇瓶种子液200mL，搅拌转速200rpm，通气量1.0vvm，30±1℃培养16小时，此时种子液pH7.0-7.4，菌体浓度12-15％(体积比)；

(3)酶发酵培养基的制备与菌体培养：

酶发酵培养基配方：葡萄糖50g/L、酵母膏20g/L、酵母抽提粉15g/L、吐温-8010g/L、柠檬酸铵5g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾8g/L、氯化钾5g/L、氯化钙5g/L，灭菌前调pH至7.0。

发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃，20min，待冷却至30℃后接入种子罐种子液3L，搅拌转速300-600rpm(转速在前3天逐渐从300rpm升至600rpm)，通气量2.0vvm，30℃培养24小时。

(4)2’-脱氧鸟苷的催化反应：

无丙二酸柠檬酸杆菌罐上发酵结束后，向罐内发酵液中直接添加磷酸氢二钠和磷酸二氢钠各0.5mol，升温至70℃，随后加入脱氧胸苷40g/L和鸟苷50g/L，搅拌反应5h后结束，经HPLC方法检测催化反应液中2’-脱氧鸟苷的含量，测得为33.5g/L。