类肠膜魏斯氏菌在吸附金属铅中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及类肠膜魏斯氏菌在吸附金属铅中的应用。

背景技术

铅是一种对人体健康极其有害的重金属。而日常生活中，爆米花、罐头食品、皮蛋等或是土地受到铅污染而产的果蔬制品容易出现铅含量高，长期铅暴露使人们对铅的接触和吸收在逐渐增加，导致体内铅蓄积，进入人体的铅易蓄积且不易排出，长期对人体生殖系统、神经系统等产生损伤。同时，由于海养殖的规模化、集约化发展导致养殖密度不断提高，因受城市发展和工业污水排放等因素影响，重金属也已成为近海养殖水体及其生物体内常见的一类污染物，铅污染水平较高贝类主要为近江牡蛎、华贵栉孔扇贝、栉江跳等，季节分布总体表现为春夏秋冬逐级递增趋势。

目前，对于由铅蓄积和铅中毒引起的各种生理病症，传统治疗方法主要采用物理化学法去除铅，即依地酸二钠钙、二疏基丁二酸钠等整合剂进行注射治疗，以达到排铅的目的，然而，这些药物效率低下且都存在着一定的毒副作用。依地酸二钠钙是一种广谱性络合剂，具有较强的肾毒性，且用药时会经尿排出大量人体不可缺少的微量元素，例如锌、铜、锰、铁等。二疏基丁二酸钠可能导致消化系统功能素乱，并造成头痛、恶心、四肢酸痛等症状。因微生物培养容易、繁殖速度快、成本较低等成为重金属污染治理研究的重点，特别在土壤、淡水及食品中，因此，筛选出能具有强吸附重金属铅的微生物极具市场前景和意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为解决背景技术中的问题，本发明的目的是提供类肠膜魏斯氏菌在吸附金属铅中的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

类肠膜魏斯氏菌在吸附金属铅中的应用，所述类肠膜魏斯氏菌为类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）SL7，于2022年08月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62429。

优选的，吸附体内或环境中的金属铅。

优选的，吸附体内中金属铅时，类肠膜魏斯氏菌接种量为1.5%~3.5%。

优选的，吸附环境中的金属铅包含吸附水体中和吸附土壤中的金属铅。

优选的，吸附水体中金属铅时，类肠膜魏斯氏菌的用量为10~20g/L；吸附土壤中的金属铅时，类肠膜魏斯氏菌用量为土壤质量的3%~6%。

优选的，吸附体内金属铅时，将类肠膜魏斯氏菌作为发酵剂制备为食品直接食用。

优选的，所述发酵剂的制备包含以下步骤：

将类肠膜魏斯氏菌接入MRS肉汤培养基，35~37℃培养18~24h，得到发酵液；

将发酵液浓缩，向浓缩后的液体中添加脱脂奶粉和蔗糖，得到浓缩液；以及

对浓缩液在真空低温干燥的条件下，进行喷雾方式干燥处理。

优选的，按浓缩液重量百分比计，所述脱脂奶粉为2~4%、蔗糖1~3%。

与现有技术相比，本发明包含以下有益效果：

本发明的类肠膜魏斯氏菌SL7对铅离子有较强的耐受能力，在Pb

附图说明

图1 a b分别为类肠膜魏斯氏菌的培养特征及显微镜形态图；

图2 为类肠膜魏斯氏菌系统发育树；

图3 为不同pH条件下类肠膜魏斯氏菌的生长情况；

图4 为类肠膜魏斯氏菌铅耐受能力测定情况；

图5 为类肠膜魏斯氏菌与各对比菌株的铅吸附情况；

图6 为不同温度对类肠膜魏斯氏菌吸附Pb

图7 为类肠膜魏斯氏菌对铅暴露小鼠机体各部分铅水平的作用情况。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施方式提供了类肠膜魏斯氏菌在吸附金属铅中的应用，所述类肠膜魏斯氏菌为类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）SL7，于2022年08月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62429。

所述类肠膜魏斯氏菌可以吸附体内或环境中的金属铅，具体来说该类肠膜魏斯氏菌具有以下性质：

（1）具有强耐酸性，在pH3.0~8.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；

（2）在体外含铅培养基中培养，对铅离子有强耐受能力；

（3）在体外含铅水溶液中培养，对铅离子有强吸附能力；

（4）具有降低铅暴露小鼠体内铅含量的作用。

作为一些优选实施方式，吸附体内中金属铅时，类肠膜魏斯氏菌接种量为1.5%~3.5%；吸附水体中的金属铅时，类肠膜魏斯氏菌的用量为10~20g/L；吸附土壤中的金属铅时，类肠膜魏斯氏菌用量为3%~6%。

当在吸附体内金属铅时，将类肠膜魏斯氏菌作为发酵剂制备为食品直接食用。

此时，所述发酵剂的制备包含以下步骤：

将类肠膜魏斯氏菌接入MRS肉汤培养基，35~37℃培养18~24h，得到发酵液；

将发酵液浓缩，向浓缩后的液体中添加脱脂奶粉和蔗糖，得到浓缩液；以及

对浓缩液在真空低温干燥的条件下，进行喷雾方式干燥处理。

作为一些优选实施方式，按浓缩液重量百分比计，所述脱脂奶粉为2~4%、蔗糖1~3%。

以下用多个具体实施例对类肠膜魏斯氏菌SL7的应用及性能进行详细说明。

实施例1 菌株的分离、纯化和鉴定

1.1 菌株的分离、筛选

本发明所需菌种从四川腊肉中分离所得，在无菌条件下，取腊肉内部组分25g，剪碎，放入无菌均质袋中，加入225ml无菌生理盐水，于拍打式均质器中拍打3min；作10倍梯度稀释，共有10

将具有明显溶钙圈的菌落接种于MRS培养基，划线纯化直到出现单菌落且整个平板和镜下观察菌落形态一致，然后测定菌株的生理生化指标；挑取革兰氏阳性、不产H

2）对亚硝酸盐具有降解作用的菌株筛选

将上述分离到的菌株按1%接种于含150ug/mL NaNO

含碳酸钙的MRS培养基上乳酸菌的形态特征：乳白色菌落，大小、形状各异，温润，有溶钙圈，有透明圈。从MRS碳酸钙培养基的菌株中挑选出12株菌透明圈较大的形态不同的典型菌落，并纯化菌株，直到出现单菌落且整个平板和镜下观察菌落形态一致，再把所有菌株转接斜面-4℃保存，同时用甘油保存法封存备用。依据GB5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》进行测定。结果表明其中降解亚硝酸盐效果最好的是菌株SL7，降解率达到98%，显著高于其他菌株，所以，筛选出菌株SL7作为优良菌株，SL7菌株培养特征及显微镜形态图分别如图1a、b所示。

1.2 菌株的分子学鉴定

细菌基因组DNA提取：用 TSINGKE 植物 DNA 提取试剂盒（通用型）提取细菌DNA；

提取产物经过PCR扩增，扩增体系：1×TSE101 金牌 mix 45ul，27 F 2uL，1492 R2 L，Template 1ul；

PCR扩增反应条件：98℃ 4min预变性；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，38个循环；72℃修复延伸10min，4℃终止。

PCR产物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行测序，测序结果与GenBank基因数据库中16Sr DNA序列进行同源性比较分析，鉴定微生物种类。由此鉴定出菌株SL7为

将菌株类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）SL7于2022年08月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62429。

实施例2

（1）菌株耐酸性

将菌株SL7接种于MRS液体培养基中，35℃°、120r/min振荡培养活化18h。菌株SL7活化后按1%分别接种于不同pH值（3.0-9.0）的MRS液体培养基中，在温度35℃下培养24h，测定OD

试验结果证明菌株SL7有较强的酸耐受性，在pH3.0~8.0区间生长性良好，OD

（2）菌株铅耐受能力测定

将菌株SL7接种于MRS液体培养基中，35℃°、120r/min振荡培养活化18h。活化后按2%分别接种于Pb

如图4可知，菌株在800mg/L时OD

（3）菌株吸附重金属铅实验

将SL7与实施例1中分离的其他11株菌株35℃活化培养18h，5000r/min，10min离心得到菌体，用灭菌超纯水洗涤，重复3次后制成50g/L的湿菌体菌悬液备用。将100g/L硝酸铅母液定容于100ml容量瓶中，使溶液中Pb

铅的吸附率和单位质量菌体对铅的吸附量的计算方法分别如下所示：

吸附率（%）=[（M

单位菌体吸附量（mg/g）=（M

其中：M

由图5可以看出，与其它试验菌株相比，本发明类肠膜魏斯氏菌SL7对铅离子的吸附率最大，为89.32%，且效果显著优于其他菌株，对铅离子具有良好的吸附能力。

（4）不同温度对菌株吸附Pb

取相同体积的Pb

由图6可知，随着温度的升高，菌株SL7吸附铅的吸附量呈升高趋势。在温度为15℃时，吸附铅的吸附量显示比较低，为4.52mg/g；在15℃-35℃范围内，菌株SL7铅的吸附量上升趋势明显，上升幅度较大，35℃菌株SL7铅的吸附量为18.86mg/g。35℃-50℃之间，菌株SL7铅的吸附量上升趋势趋于平缓，变化幅度小。到温度为50℃时，吸附量基本达到最高为22.51mg/g，但高温更容易使菌体表面结构受到破坏，影响后续吸附效果，因此可选择35℃的温度作为最适吸附温度。

实施例3 类肠膜魏斯氏菌SL7灌喂小鼠的耐受剂量试验

将类肠膜魏斯氏菌SL7冻干菌粉重悬于脱脂乳粉中，制成浓度为1.0×10

表1 灌喂类肠膜魏斯氏菌SL7对小鼠体重的变化情况

。

其中：“-”表示小鼠无死亡。

从表1中结果可知，灌喂浓度1.0×10

实施例4 对铅暴露小鼠具有缓解铅毒性的能力

取20-30g健康雄性小鼠40只（购于成都达硕实验动物有限公司），随机分为4组：阴性对照组、醋酸铅模型对照组、类肠膜魏斯氏菌SL7治疗组与依地酸二钠钙阳性治疗对照组。

试验设置：阴性对照组进水为普通饮用水；其余3组的进水为1g/L醋酸铅溶液，在造成铅暴露感染模型后，类肠膜魏斯氏菌SL7治疗组每日灌喂本发明实施例3制备的浓度1.0×10

实验结束后取血并处死小鼠，分别取胃、肝、肾、血液采用火焰原子吸收分光光度计测定铅含量，结果如图7。

由图7可知，通过各组小鼠血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量的比较，发现本发明类肠膜魏斯氏菌SL7能够显著降低小鼠血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量。图7数据表明，类肠膜魏斯氏菌SL7治疗组中的小鼠血液、肝脏、肾脏、胃中铅含量分别为0.36ug/g、0.66ug/g、1.95ug/g、0.38ug/g。环境中的铅经食物和呼吸途径进入人体，对消化、神经、呼吸和免疫系统造成急性或慢性毒性影响，在体内长期积累导致贫血、肌肉雍疾等病症，严重时可发生脑病或死亡。由试验结果可知使用含有本发明类肠膜魏斯氏菌SL7菌剂，能够降低铅中毒小鼠的血、肝脏、肾组织中的铅含量，缓解机体氧化应激减轻铅中毒小鼠的病理症状，具有促进排铅的保健功能。因此，我们可以通过类肠膜魏斯氏菌SL7制备食品，实现机体内的铅中毒现象减轻或消失的过程。

实施例5 制备含有类肠膜魏斯氏菌SL7的乳制品

将原料乳脱脂奶在95℃杀菌20min，然后冷却至4℃，再加入按照实施方式中制备的类肠膜魏斯氏菌SL7发酵剂，使其活菌数达到1.0×10

实施例6 制备含有类肠膜魏斯氏菌SL7制备的果蔬饮料

选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温到温度约37℃，再接入本发明制备的类肠膜魏斯氏菌SL7菌剂发酵剂，使其活菌数达到1.0×10

实施例7 使用类肠膜魏斯氏菌SL7制备用于生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂

将类肠膜魏斯氏菌SL7按照以所述培养基重量计2%接种量接种于在MRS培养基中，pH6.8，35℃培养24h，5000r/min离心10min，使用pH7.2磷酸盐缓冲液洗涤两次后用保护剂重悬，使活菌数达到1.0×10

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。