一种枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本申请涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种细菌，为革兰氏阳性的好气性菌，菌体表面生有鞭毛，体内形成的内生孢子可抵抗恶劣的外在环境而存活。枯草芽孢杆菌在食品、复合菌剂、饲料添加剂上被广泛使用。枯草芽孢杆菌作为一种微生物保鲜剂，能有效地抑制微生物的繁殖，因而能够作为果蔬的保鲜剂，但不同果蔬中被污染的主要微生物通常是不一样的，且果蔬不同组织(比如根、叶、果实)中的微生物也不同，所以，用含有枯草芽孢杆的保鲜剂对不同果蔬或果蔬不同组织进行保鲜时，效果也会大不相同。

番茄(Lycopersicom esculentum Mill.)原产南美洲。番茄果实色泽诱人、汁多味鲜，具有极高的营养价值，除包含糖、蛋白质、有机酸、纤维素、矿物质等基本营养物质外，还含有丰富的胡萝卜素、VC、维生素B族以及锰、铜、碘、锌等。不过，由于番茄果实在采后包装、运输、贮藏、消费的整个过程中，外观和食用品质会持续下降，因此，严重影响了经济效益，如何保持其采后品质也是人们关心的问题。

在番茄果实保鲜剂的研发过程中，有些保鲜剂在短期贮藏中保鲜效果好，有些保鲜剂在长期贮藏中保鲜有优势；有些保鲜剂侧重内部品质，比如抑制内部营养分子的流失等有效，有些保鲜剂侧重外部品质，比如防止腐烂或失水等效果好。也就是说，不同番茄保鲜剂可以适用于不同的保鲜目的。一方面，相比于短期的贮藏保鲜，人们更看重长期(10天以上，尤其是2周以上)的保鲜效果；另一方面，在采后过程中，番茄果实内部品质(如呼吸强度等)的变化需要仪器测定，而外部品质(比如腐烂、失重等)能被消费者直观感知，因此，对番茄果实外部品质具有直观保鲜效果的保鲜剂更受市场青睐。

目前，市场亟需一种能够长时间、对番茄果实的品质尤其是外部品质进行保鲜的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请首先提供了一种枯草芽孢杆菌。

本申请的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1号，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.26006。

本申请还提供上述枯草芽孢杆菌在番茄保鲜中的应用。

本申请还提供上述枯草芽孢杆菌抑制霉菌的用途。

本申请还提供一种复合菌剂，其包括上述的枯草芽孢杆菌、和/或该枯草芽孢杆菌的菌悬液、和/或上述的枯草芽孢杆菌的代谢物、和/或上述的枯草芽孢杆菌的发酵产物、和/或该枯草芽孢杆菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的一种或多种混合物。

本申请还提供一种保鲜剂，其包括上述的菌剂和其他保鲜剂；或者包括上述的菌剂和其他保鲜剂的有效成分。

本申请还提供制备上述的保鲜剂或上述的复合菌剂的方法，包括培养上述的枯草芽孢杆菌的步骤。

本申请还提供上述的保鲜剂或上述的复合菌剂在番茄果实保鲜中的应用。

本申请还提供上述的保鲜剂或上述的复合菌剂抑制霉菌的用途。

本申请还提供一种番茄果实保鲜的方法，使番茄果实与上述的保鲜剂或上述的复合菌剂接触。

在一些实施方式中，番茄果实保鲜为抑制呼吸强度、和/或抑制腐烂、和/或抑制失重。

本申请突出的有益效果：本申请的枯草芽孢杆菌对番茄果实的品质具有显著的长期保鲜效果：能在采后10天以上，尤其是2周后，使番茄果实的失重率更低、腐烂率更低、呼吸强度更低。

保藏说明

菌种名称：枯草芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus subtilis

菌株编号：1号

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年11月2日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.26006。

附图说明

附图用来提供对本申请的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请，并不构成对本申请的限制。

图1：1号菌株检测鉴定报告。

图2：1号菌株系统发育树。

图3：采后番茄果实失重率对比。

图4：采后番茄果实腐烂率对比。

图5：采后番茄果实呼吸强度对比。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本申请提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1号，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.26006。

本申请还提供一种菌剂，包括上述的枯草芽孢杆菌、和/或上述的枯草芽孢杆菌的菌悬液、和/或上述的枯草芽孢杆菌的代谢物、和/或上述的枯草芽孢杆菌的发酵产物、和/或该枯草芽孢杆菌的细胞培养物的滤液、和/或它们的一种或多种混合物。

本申请还提供一种保鲜剂，包括上述的菌剂和其他保鲜剂；或者包括上述的菌剂和其他保鲜剂的有效成分。

本申请还提供制备上述保鲜剂或上述菌剂的方法，包括培养上述枯草芽孢杆菌的步骤。

本申请还提供一种番茄保鲜的方法，使番茄果实与上述的枯草芽孢杆菌、或与上述的保鲜剂、或与上述的菌剂接触。

本申请还提供上述枯草芽孢杆菌、或上述保鲜剂、或上述菌剂在番茄保鲜中的用途。

在一些实施方式中，番茄果实保鲜为抑制呼吸强度、和/或抑制腐烂、和/或抑制失重。优选的，番茄为天丰系列。

本申请还提供上述枯草芽孢杆菌、上述保鲜剂、上述的菌剂抑制霉菌的用途。

在一些实施方式中，霉菌为黄曲霉或黑曲霉。

在一些实施方式中，枯草芽孢杆菌的接种浓度为3％-4％。

定义与术语

“整体品质”同时包含内部品质和外部品质。例如同时包含呼吸强度、失重率及腐烂率等品质。

“番茄”包括任意番茄品种，例如天丰系列(如天丰2号、天丰601号等)，威敌系列(如威敌8号)等。在一些实施方式中，所述番茄指番茄果实、番茄植株或番茄苗木。

“发酵产物”：指的是在培养基中接入菌种，经过一段时间培养后，该菌利用培养基中的营养成分发酵，并形成发酵后的产物，例如，高密度发酵液等，其起到与1号菌相同或近似的抑菌或保鲜作用。

“代谢物”：也称代谢产物，是指由菌株产生的代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物，如包括分泌物，环脂肽等混合物，其起到与1号菌相同或近似的抑菌或保鲜作用。

“细胞培养物的滤液”：是指一定时间一定空间内菌的细胞群或生长物。如菌的斜面培养物、摇瓶培养物等，其起到与1号菌相同或近似的抑菌或保鲜作用。

“菌悬液”：发酵后通过滤膜后的上清液，其起到与1号菌相同或近似的抑菌或保鲜作用。

“培养基”：可以为任意适宜的培养基，例如：

LB固体培养基：按照1000mL去离子水、15g琼脂粉、10g氯化钠、5g酵母浸粉、10g蛋白胨的比例配制，并在121℃高压蒸汽灭菌30min。

LB液体培养基：按照1000mL去离子水、10g氯化钠、5g酵母浸粉、10g蛋白胨的比例配制，并在121℃高压蒸汽灭菌30min。

NA培养基：按照1000mL去离子水、15g葡萄糖、5g氯化钠、5g酵母浸粉、10g蛋白胨的比例配制，并在121℃高压蒸汽灭菌30min。

PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基：按照1000mL去离子水、35g PDA琼脂粉的比例配制，先用沸水浴溶解，并在121℃高压蒸汽灭菌30min。

高密度发酵培养基：按照1000mL去离子水，葡萄糖10.0g，酵母粉5.0g，玉米粉10.75g，大豆粉9.0g，蛋白胨7.0g，KH2PO4 0.66g，NaCl 4g，MgSO4·7H2O 0.6g，CaCl2 3g和MnSO4·H2O 0.6g，装液量200mL(500mL锥形瓶)，调至pH6.5～6.7，高压灭菌(

“接触”是指任何可以将保鲜剂给予番茄果实的方法，例如将保鲜剂喷洒或涂布在番茄果实表面，或将番茄果实浸泡在保鲜剂中。

“其他保鲜剂”是指除本申请保鲜剂或菌剂之外的已有的保鲜剂。

“有效成分”是指具有抑菌或保鲜功能的成分。

实施例1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1号CGMCC No.26006的分离鉴定

发明人从实验中偶然获得一株枯草芽孢杆菌，相对于其他微生物，由于其对番茄果实的防腐保鲜效果十分显著，因此，发明人将该菌株分离并保存后进行了分子生物学鉴定，获得了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1号CGMCCNo.26006。随后，发明人还对该菌株进行了细菌形态和理化、gyrB基因序列、16SrRNA基因序列进行了测定，并通过基因序列测定结果绘制系统发育树。其中，鉴定结果参见图1，进化树分析结果参见图2。

实施例2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1号CGMCC No.26006的抑菌特性研究

1、实验方法：

①用接种环取1-2环枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1号CGMCCNo.26006的单菌落于灭菌LB培养基中，37℃培养24h。取单菌落菌液于NA培养基中进行培养，接种量为4％-5％(即NA培养基若为100mL，则取单菌落菌液4mL-5mL)，37℃恒温培养24h；取出后在4℃7000rpm/min条件下离心15min，取上清液，用0.22μm微孔过滤膜过滤得到枯草芽孢杆菌发酵液，用注射器取5-10mL离心后的上清液，将上清液注射在0.22μm微孔过滤膜上进行过滤，过滤完成后即得到枯草芽孢杆菌菌悬液。可放在4℃冰箱保存备用。

②取100-150μL无菌水于黑曲霉/黄曲霉平板上，用玻璃棒在霉菌菌落较多的地方轻轻滚动使孢子进入无菌水中。并将其转移至PDA固体培养基中，用玻璃棒将菌液涂布均匀。

③牛津杯法测抗菌活性：用镊子将牛津杯安置于PDA固体培养基正中央位置打孔，用移液枪向牛津杯中加入100μL的菌悬液，并在37℃恒温培养箱中正放培养，黑曲霉实验组培养48-72h，黄曲霉实验组培养96-120h。培养后观察实验现象，记录抑菌圈直径大小，通过抑菌圈的大小判断枯草芽孢杆菌对霉菌的抑菌效果。

2、实验结果：本申请的枯草芽孢菌对黑曲霉和黄曲霉均有抑制效果，而对黄曲霉的抑菌效果更好。

实施例3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1号CGMCC No.26006对番茄果实的防腐保鲜效果

1、主要实验材料：

①“天丰601”品种番茄，采摘自北京顺义，带柄采收，采后立即运回实验室进行实验。

②枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1号CGMCC No.26006的发酵液：对枯草芽孢杆菌进行高密度发酵培养，设置两个实验组，种子液接种量分别为3％和4％，37℃，200rpm/min，震荡培养24h，再静置培养24h，得到枯草芽孢杆菌培养物，将培养物离心后，用0.22μm滤膜过滤，即得。

2、实验方法：

选择新鲜、大小均匀、无机械损伤和病害、成熟度相近的果实，将其分为三组：一组为CK，不进行任何处理；另外两组为处理组，分别将灭菌后的喷壶装入枯草芽孢杆菌1号CGMCC No.26006的发酵液，均匀喷洒在番茄表面，静置5h待表面干透，将番茄装入PE包装袋，封口，打孔10个，每袋5个果实，置常温贮藏16d。取样测定其初始值作为第0d指标，每0d、4d、8d、12d、16d测定一次指标。重复三次。

3、评价指标

①失重率：失重率(％)＝(贮藏前番茄质量-贮藏后番茄质量)/贮藏前番茄的质量×100。

②腐烂率：腐烂率％＝(无商业价值番茄果实数/总番茄果实数)×100。

③呼吸强度：将1kg的番茄放入呼吸强度直读仪的腔室内，测定15min,记录结果。

4、实验结果

①失重率：1周后，例如从第8天到第16天，枯草芽孢杆菌1号CGMCCNo.26006的发酵液对番茄失重率的抑制效果都明显好于对照见表1(仅展示差异显著的结果)和图3。

表1失重率显著性分析

②腐烂率：无论短期(如1周内)还是长期(如2周以上)，枯草芽孢杆菌1号CGMCCNo.26006的发酵液对番茄腐烂率的抑制效果都明显好于对照，参见表2(仅展示差异显著的结果)和图4。

表2腐烂率显著性分析

③呼吸强度：贮藏时间超过2周后，如16天，枯草芽孢杆菌1号CGMCCNo.26006的发酵液对番茄呼吸强度的抑制效果明显好于对照，参见表3(仅展示差异显著的结果)和图5。

表3呼吸强度显著性分析

综上，本申请的枯草芽孢杆菌对番茄果实的品质具有显著的长期保鲜效果：能在采后10天以上，尤其是2周后，使番茄果实的失重率更低、腐烂率更低、呼吸强度更低。

显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。