抗CD39抗体-药物偶联物及其用途

技术领域

本发明涉及一类全新结构的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物。具体地说，本发明涉及抗CD39抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，包含所述抗体-药物偶联物的药物组合物，以及所述抗体-药物偶联物或药物组合物在医药上的应用。

背景技术

肿瘤微环境(TME)中的嘌呤能信号传导在免疫反应调节中起着关键作用。在实体瘤中，肿瘤细胞死亡、代谢、缺氧应激和促炎信号，都会导致细胞内的ATP大量释放到细胞外并堆积，远远超过健康组织中的水平(PloS One.2008,3(7):e2599；Curr OpinPharmacol.2016,29:17-25)。胞外的ATP通过结合免疫细胞上的P2嘌呤能受体产生促炎刺激，对肿瘤细胞的杀伤起到正相调节作用(Trends Immunol.2016,37(7):427-39)。然而，肿瘤细胞通过表达CD39(也称为胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，NTPDase 1)和CD73(也称为胞外-5'-核苷酸酶)，将ATP转化为腺苷，后者通过结合免疫细胞上的A2A受体，抑制了免疫细胞的活性，进而导致肿瘤细胞的免疫逃逸。

在肿瘤微环境中，调节性T细胞(Tregs)和骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)上CD39高表达，并且展示出对杀伤型T细胞的抑制作用(Blood.2007,110(4):1225-32；Cell MolImmunol.2017,14(6):521-8；Cancer Res.2016,76(18):5241-52；J ImmunotherCancer.2016,4:49)。在多种血液瘤和实体瘤的肿瘤细胞上也观察到CD39表达的升高，如甲状腺癌、结直肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤等(Human Protein Atlas)。此外，也有文献报道，CD39的过表达与癌症预后差相关(Int JClin Exp Pathol.2015,8(11):14757-14764)。因此，CD39被认为是一种非常有潜力的治疗靶点。目前，已有多个针对CD39靶点的单抗药物进入临床研究阶段，如单抗IPH5201和TTX-030，但临床上仍然有开发疗效更佳的药物分子的需求。

抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)是一种靶向治疗手段，将单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的接头与具有细胞毒性的毒素相连，充分利用抗体对肿瘤细胞表面抗原的靶向结合性，将毒素高效递送到肿瘤部位。ADC药物由抗体、接头和毒素三部分组成。其中，抗体部分决定了ADC药物的特异性，这不仅包括特异靶向结合，还包括有效的内吞。接头的类型和化学特性决定了毒素的偶联数量，在体内的释放机制以及ADC药物的药代动力学，同时也极大影响了治疗指数(疗效毒性比)。毒素的类型决定了ADC药物杀伤肿瘤细胞的作用机理，如靶向微管蛋白，抑制微管动力学，或靶向DNA凹槽，破坏DNA双螺旋。毒素本身的毒性强弱和化学性质也在一定程度上影响ADC药物的毒素偶联数量和稳定性，并且不同类型的肿瘤细胞通常对不同的毒素表现出不同的敏感性，这都会影响ADC药物的治疗指数。因此，一种新抗体与不同的接头和毒素组合获得的ADC的效果和安全性是无法确定和难以预测的。

目前已经有多种ADC药物被批准上市，如Kadcyla和Enhertu是靶向HER2的单抗分别和DM1、Deruxtecan偶联形成的ADC药物。I-394(在本申请中命名为F1)是innate公司开发的一种抗CD39的单克隆抗体，相关专利公开号为：WO2019096900A1，目前在1期临床试验阶段。目前没有公开任何一种靶向CD39的ADC药物进行临床研究。本领域技术人员致力于开发新的、有效的靶向CD39的ADC药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：

其中：

Ab为抗CD39的抗体或其抗原结合片段；

L为接头；

D为细胞毒素分子；

“—”为键；

n为偶联于所述抗体的所述细胞毒素分子的平均偶联数量，也是细胞毒素分子与抗体的比率(drug antibody ratio)的平均值，又称DAR值，0

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段包含以下的CDR区：

HCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；

HCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；

HCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；

LCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列；

LCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，或包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；

LCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，或包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或与SEQ ID NO:8具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段，进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区；和/或进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG4重链恒定区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选人源κ轻链恒定区。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的嵌合抗体或其抗原结合片段的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ ID NO:9具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，或与SEQ ID NO:10具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的抗CD39抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其抗原结合片段，进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人种系重链IGHV1-2*02或其变体的FR区；和/或进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区，优选包含人种系轻链IGKV1-33*01或其变体的FR区。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11、12、13、14或15所示，或与SEQ ID NO:11、12、13、14或15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16或17所示，或与SEQ ID NO:16或17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或与SEQ ID NO:12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与SEQ ID NO:13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与SEQ ID NO:14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或与SEQ ID NO:12具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或与SEQ ID NO:13具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，或与SEQ ID NO:14具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者

所述人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性，且其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或与SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG4重链恒定区，更优选所述的人源IgG4重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，或与SEQ ID NO：18具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述人源化抗体或其抗原结合片段进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，优选人源κ轻链恒定区，更优选人源κ轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，或与SEQ ID NO：19具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的接头L如通式(L)所示：

其中，

L

L

或者L

L

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的接头L选自以下结构：

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中细胞毒素分子D选自化疗剂、DNA烷化剂、微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、抗生素或放射性同位素的细胞毒剂。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中细胞毒素分子D选自以下结构：

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其包括通式(II)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：

其中m为1-8，优选为2-4，0

由本领域公知常识可知，在20种常见氨基酸中，具有与接头进行缩合反应活性、且反应后形成亚氨基残基的氨基酸侧链只有赖氨酸侧链，因此结合通式(II)的结构和本领域公知常识即可以知道，通式(II)中所述的接头与所述的Ab的赖氨酸侧链连接，同时抗体的赖氨酸侧链与接头反应后形成亚氨基，其数量与细胞毒素分子数量相同，因此记载在通式(II)方括号内的最左侧。

在本发明一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其包括通式(III)所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：

其中m为1-8，优选为3-5；0

由本领域公知常识可知，在20种常见氨基酸中，具有与接头进行缩合反应活性、且反应后形成-s-残基的氨基酸侧链只有半胱氨酸侧链，因此结合通式(II)的结构和本领域公知常识即可以知道，通式(II)中所述的接头与所述的Ab的半胱氨酸侧链连接，同时抗体的半胱氨酸侧链与接头反应后形成-s-残基，其数量与细胞毒素分子数量相同，因此记载在通式(II)方括号内的最左侧。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物包括但不限于：

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其中0

其中0

其中0

其中0

其中0

其中0

其中0

在更优选的实施方式中，本发明所述的抗体-药物偶联物为：

(1)F314-MC-VC-PAB-MMAE，其结构如下式所示：

其中，n为3.8-4.2，优选3.9-4.1，更优选4.0，所述的接头与所述的Ab的半胱氨酸侧链连接；

(2)F314-MC-MMAF，其结构如下式所示：

其中，n为1.3-1.7，优选1.4-1.6，更优选1.5，所述的接头与所述的Ab的半胱氨酸侧链连接；

(3)F314-SMCC-DM1，结构如下式所示：

其中，n为4.8-5.2，优选4.9-5.1，更优选5.0，所述的接头与所述的Ab的赖氨酸侧链连接；

(4)F314-SPDB-DM4，结构如下式所示：

其中，n为3.6-4.0，优选3.7-3.9，更优选3.8，所述的接头与所述的Ab的赖氨酸侧链连接；

(5)F314-C4-VC-PAB-MMAE，结构如下式所示：

其中，n为1.9-2.3，优选2.0-2.2，更优选2.1，所述的接头与所述的Ab的赖氨酸侧链连接；

(6)F314-C5-VC-PAB-MMAE，结构如下式所示：

其中，n为0.5-3.5，优选0.8-3.0，更优选0.8、1.8、2.3或3.0，所述的接头与所述的Ab的赖氨酸侧链连接；

(7)F314-C6-VC-PAB-MMAE，结构如下式所示：

其中，n为1.9-2.3，优选2.0-2.2，更优选2.1，所述的接头与所述的Ab的赖氨酸侧链连接；

其中，各式中F314表示人源化单抗F314，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:14所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。

本发明进一步提供一种药物组合物，其含有如上所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

本发明进一步提供一种如上所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物、或包含其的药物组合物，在制备用于治疗CD39介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症优选为癌症，优选为淋巴瘤(如滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、结直肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌或黑色素瘤。

本发明进一步提供一种治疗和预防CD39介导的疾病或病症的方法，该方法包括给予所需患者治疗有效量的如上所述的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物、或包含其的药物组合物；其中所述的疾病或病症优选为癌症，优选为淋巴瘤(如滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、结直肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌或黑色素瘤。

本发明设计的抗CD39抗体-药物偶联物，不仅保留了单抗的亲和性和内吞活性，同时通过偶联的毒素分子实现了对肿瘤细胞的直接靶向杀伤作用，ADC的活性比单抗显著增加。

附图说明

图1：裸抗与不同ADC对CD39阳性肿瘤细胞的体外杀伤活性。

图2：裸抗与不同ADC对接种了CD39阳性肿瘤细胞的小鼠的体内抗肿瘤活性。

图3：裸抗与不同ADC对CD39阴性肿瘤细胞的体外杀伤活性。

图4：裸抗与不同ADC对CD39阳性肿瘤细胞的亲和活性。

图5：裸抗与不同ADC的内吞活性。

图6：不同DAR值的F314-C5-VC-PAB-MMAE对CD39阳性肿瘤细胞的体外杀伤活性。

具体实施方式

一、术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

“CD39”和“CD39抗原(CD39 antigen)”以及“CD39蛋白”在本发明中可互换使用。CD39也称为胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(基因：ENTPD1；蛋白质：NTPDase1，见www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/953)。CD39也曾被称为ATPD酶及SPG64。上述这些术语各自可互换使用。除非另行说明，所述术语包括由细胞天然表达或由经CD39基因转染的细胞表达的人CD39的任何变体、亚型及物种同源物。在本发明中，CD39蛋白的UniProtKB/Swiss-Prot登记号为P49961.1。

本发明的“抗体-药物偶联物”(antibody drug conjugate，ADC)指单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明抗体-细胞毒性药物偶联物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本发明抗体-药物偶联化合物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐。

术语“溶剂化合物”指本发明的抗体-药物偶联化合物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化合物。

本发明所用氨基酸单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本发明所述的抗体指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中的每类Ig都可以有κ链或λ链。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(如LCDR1-3，HCDR1-3)，或者符合chothia的编号规则。

本发明所述的单克隆抗体或mAb，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能用小鼠制备的抗人CD39的单克隆抗体。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源CD39抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体”(chimeric antibody)，是将鼠源抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再克隆到人抗体的恒定区基因，进行重组表达。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)人源化，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。

本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段，以及与人CD39结合的Fv片段scFv片段；包含本发明所述抗体的选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:6中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(scFv)。

本发明的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链氨基酸序列的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体pcDNA3.4。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。

术语“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同一的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有9个匹配或同源，那么两个序列为90％同一性。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。本领域技术人员可以判断序列同一性百分比所表示的变化的碱基数或氨基酸数量。

术语“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biologyofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。在本发明中，所述抗体轻链或重链的变体即为在轻链或重链中发生0-10个氨基酸的“保守修饰”或“保守置换或取代”，本领域技术人员可以预期该变体具有与修饰或取代前基本相同的活性。此外，本发明中所述的抗体轻链或重链的变体还包括回复突变后的结果，即将人源化抗体FR区个别人源模板的氨基酸回复突变回相应位点的鼠源氨基酸。本领域技术人员可以预期该变体具有与回复突变前的人源化抗体以及包含相同CDR的鼠源抗体类似相当或更好的活性。

“亲和性(affinity)”或“结合性”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合对象(例如抗原)之间非共价交互作用的总和强度。除非另外表明，本发明中所使用的“亲和性(binding affinity)”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1交互作用的固有结合亲和力。分子X对其结合对象Y的亲和性通常以解离常数(KD)表示。亲和性可通过本领域已知的常用方法进行测定，包括本发明所述的那些，例如可使用例如表面等离子体共振(SPR)技术诸如仪器进行测定。

“特异性结合(specific binding或specifically binds to)”、“对...具有特异性(specific for)”、“选择性结合(selectively binds)”和“对...具有选择性(selectivefor)”特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原的表位意指与非特异性或选择性交互作用有测定上不同的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合相较于对照分子的结合来测定。特异性结合亦可通过与类似于靶标的对照分子(诸如过量的未标示靶标)的竞争来测定。本发明使用的术语“kd”(sec-1)是指特定抗体-抗原交互作用的解离速率常数。此值亦称为k解离值。本发明使用的术语“ka”(M-1×sec-1)是指特定抗体-抗原交互作用的缔合速率常数。此值亦称为k缔合值。本发明使用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原交互作用的解离平衡常数。KD＝kd/ka。

“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

术语“载体”用于本发明的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。

“细胞毒素分子”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质，例如本发明中的小分子药物基团MMAE、MMAF、DM1和DM4。

“裸抗”指未连接任何毒素分子的抗体或其抗原结合片段。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。该定义还包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。

术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。

术语“键”指用“—”表示的共价键。

表示与其他基团通过共价键连接，例如，在本发明中抗体与接头、接头与毒素分子之间通过共价键连接。

“接头”指包含使抗体共价附着于药物模块的共价键或原子链的化学模块，是将抗体连接至另一接头构件或药物模块的“延伸物单元”。在有些实施方案中，接头单元可以是氨基酸单元。在一个这样的实施方案中，氨基酸单元容许蛋白酶切割接头，由此便于在暴露于胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)后从抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物释放药物。

“ADC的载荷”(药物/抗体比率DAR)可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限制药物-接头中间物或接头试剂相对于抗体的摩尔用量，(ii)限制偶联反应的时间或温度，(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原性条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序列进行工程改造，使得半胱氨酸残基的数目和位置为了控制接头-药物附着的数目和/或位置而进行改变。

制备抗体-细胞毒性药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物的某些方法。可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。

SKOV-3是一种人卵巢癌细胞系，其细胞表面不表达人CD39，用于检测抗CD39抗体-药物偶联物对阴性肿瘤细胞的体外杀伤活性作用。

DB是一种人滤泡性淋巴瘤细胞系，其细胞表面天然表达人CD39，用于检测抗CD39抗体-药物偶联物对阳性肿瘤细胞的体外杀伤活性作用。

MOLP-8是一种人多发性骨髓瘤细胞系，其细胞表面天然表达人CD39，用于检测抗CD39抗体-药物偶联物对阳性肿瘤细胞的亲和活性及内吞活性。

Mino是一种人套细胞淋巴瘤细胞系，其细胞表面天然表达人CD39，将该细胞接种到CB17/SCID小鼠上建立套细胞淋巴瘤模型，用于检测抗CD39抗体-药物偶联物的体内抗肿瘤效果。

缩写含义：

接头组件

MC结构式为

SPDB结构式为

SMCC结构式为

C4结构式为

C5结构式为

C6结构式为

细胞毒性药物：

MMAE＝单甲基澳瑞他汀E(MW 718)

MMAF＝澳瑞他汀E(MMAE)的变体，其在药物的C-末端处有苯丙氨酸(MW731.5)

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DM1＝N(2’)-脱乙酰基-N(2′)-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素

DM4＝N(2’)-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素

其他结构：

NC的结构为

PC的结构为

二、实施例

以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。

本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

本发明中涉及的编码抗CD39抗体的CDR、可变区或轻重链的DNA序列可以根据相应的氨基酸序列设计，这是本领域的常规技术。

实施例1单克隆抗体的制备

1.1本申请新抗体的制备

利用分子克隆技术，首先将本申请提供的抗体氨基酸序列(如表1所示，表中所有的抗体含有相同的抗体CDR序列)的cDNA克隆到含有信号肽的表达载体pcDNA3.4上。然后在大肠杆菌中扩增出分别含有相应抗体重链和轻链的cDNA序列的质粒，随后将含有重链和轻链的表达质粒共转染CHO-S细胞，培养后收获上清，用MabSelect PrismA纯化，得到本申请提供的单克隆抗体。经验证，所述抗体的序列与下表序列一致。

表1：本申请抗体氨基酸序列

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1.2单克隆抗体F1的制备

参照innate专利WO2019096900A1的记载制备抗体F1，其中重链氨基酸序列如该专利SEQ ID NO:37所示，轻链氨基酸序列如该专利SEQ ID NO:38所示，因现有技术尚未公开其他抗CD39的ADC，本发明将F1单抗与本发明使用的接头和毒素制备ADC作为阳性对照组。

实施例2毒素分子的获得

2.1MC-VC-PAB-MMAE

通过市场购买途径获得(货号SET0201，Levena Biopharma)。

2.2MC-MMAF

通过市场购买途径获得(货号SET0202，Levena Biopharma)。

2.3SMCC-DM1

通过市场购买途径获得(货号SET0101，Levena Biopharma)。

2.4SPDB-DM4

通过市场购买途径获得(货号SET0102，Levena Biopharma)。

2.5VC-PAB-MMAE的合成

根据专利WO 2004/010957实施例18公开的方法制备得到Fmoc-VC-PAB-MMAE。Fmoc用20％哌啶在DMF中搅拌二十分钟除去，经过HPLC制备得到VC-PAB-MMAE的纯品。

2.6NC4-VC-PAB-MMAE的合成

将VC-PAB-MMAE(0.18mmol)溶解在1毫升的无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，分别再加入DIEA(N,N-二异丙基乙胺)(0.44mmol)和丁二酸酐(0.21mmol)。反应液在室温搅拌十分钟后，加入二氯甲烷(1mL)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.89mmol)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(0.89mmol)，反应液在室温搅拌三十分钟后，减压旋干溶剂后，用HPLC纯化后得到NC4-vc-PAB-MMAE，m/z：1320.8[M+H+]。

2.7PC4-VC-PAB-MMAE的合成

将VC-PAB-MMAE(0.18mmol)溶解在1毫升的无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，分别再加入DIEA(N,N-二异丙基乙胺，0.44mmol)和丁二酸酐(0.21mmol)。反应液在室温搅拌十分钟后，加入二氯甲烷(1mL)、五氟苯酚(0.89mmol)和EDC(0.89mmol)，反应液在室温搅拌三十分钟后，减压旋干溶剂后，用HPLC纯化后得到

PC4-VC-PAB-MMAE，m/z:1389.9[M+H

2.8NC5-VC-PAB-MMAE的合成

参考实施例2.6NC4-VC-PAB-MMAE的合成，用戊二酸酐替代丁二酸酐，得到NC5-VC-PAB-MMAE，m/z：1334.8[M+H

2.9 PC5-VC-PAB-MMAE的合成

参考2.7 PC4-VC-PAB-MMAE的合成，用戊二酸酐替代丁二酸酐，得到PC5-VC-PAB-MMAE,m/z：1403.9[M+H

2.10 NC6-VC-PAB-MMAE的合成

将VC-PAB-MMAE(0.18 mmol)溶解在1毫升的无水DMF中，分别再加入DIEA(77μL,0.44 mmol)和己二酸双N-羟基琥珀酰亚胺(1 mmol)。反应液在室温搅拌二十分钟后，用HPLC纯化后得到NC6-VC-PAB-MMAE，m/z：1348.8[M+H

2.11PC6-VC-PAB-MMAE的合成

参考实施例2.10NC6-VC-PAB-MMAE的合成，用己二酸双五氟苯酯(按照文献方法合成：Liu,Yijiang；et al Biomacromolecules(2015),16(12),3995-4003)代替己二酸双N-羟基琥珀酰亚胺，得到PC6-VC-PAB-MMAE,m/z:1417.7[M+H

实施例3偶联药物的制备

以下实施例中的F314抗体的重轻链的可变区和恒定区的氨基酸序列分别见表1所示。

3.1F314-MC-VC-PAB-MMAE的制备

抗体还原：将F314抗体以1-10mg/mL的浓度溶解在PBS(pH7±0.2)缓冲溶液中，加入3-10倍摩尔当量的TCEP，将反应液置于4℃-37℃孵育2-24小时；

偶联：将毒素分子MC-VC-PAB-MMAE溶解于DMA(N,N-二甲基乙酰胺)中，浓度10mg/mL，待完全溶解后，取6-10倍摩尔当量的MC-VC-PAB-MMAE加入到还原抗体溶液中进行偶联，DMA的最终体积含量控制在5％左右，37℃反应0.5-5小时，在该时间范围内HIC-HPLC监测反应产物的DAR，待接近目标DAR约4.0时终止反应(由于产物ADC的DAR值随反应时间而变化，因此根据目标产物ADC的DAR值，通过HIC-HPLC监测反应产物，决定反应终点)；

产品纯化：往反应液中加入过量的半胱氨酸，室温放置30-60分钟；使用分子截留量50kD的超滤管对反应体系进行缓冲液置换，同时去除DMA和未反应的毒素分子；最终偶联产物保存在PBS(pH7±0.2)缓冲溶液。采用HIC-HPLC法测得偶联物F314-MC-VC-PAB-MMAE的DAR的平均值为4.0。

偶联物F314-MC-VC-PAB-MMAE的结构如下式所示：

其中，DAR的平均值n为4.0，

DAR均值计算方法为：DAR均值＝(0*DAR0面积百分比(％)+2*DAR2面积百分比(％)+4*DAR4面积百分比(％)+6*DAR6面积百分比(％)+8*DAR8面积百分比(％))/100

计算结果如下：

3.2F314-MC-MMAF的制备

参考实施例3.1F314-MC-VC-PAB-MMAE的制备，毒素分子用MC-MMAF代替MC-VC-PAB-MMAE，采用Ellman试剂测得偶联物F314-MC-MMAF的DAR的平均值为1.5(检测方法和DAR的平均值计算方法参考文献：Interaction of Nitric Oxide with 2-Thio-5-nitrobenzoic Acid:Implications for the Determination of Free SulfhydrylGroups by Ellman’s Reagent)。

偶联物F314-MC-MMAF的结构如下式所示：

/>

其中，DAR的平均值n为1.5。

3.3F314-SMCC-DM1的制备

偶联：将F314抗体以1-10mg/mL的浓度溶解在PBS(pH7±0.2)缓冲溶液中，将小分子SMCC-DM1溶解于DMA中，浓度10mg/mL，待完全溶解后，取6-10倍摩尔当量的SMCC-DM1加入到抗体溶液中进行偶联，DMA的最终体积含量控制在5％左右，室温避光反应12-24小时；

产品纯化：使用分子截留量50kD的超滤管对反应体系进行缓冲液置换，同时去除DMA和未反应的毒素分子；最终偶联产物保存在PBS(pH7±0.2)缓冲溶液。检测F314-SMCC-DM1的DAR的平均值为5.0(检测方法和DAR的平均值计算方法参考文献yan chen，Drug-to-Antibody Ratio(DAR)by UV/Vis Spectroscopy)。

偶联物F314-SMCC-DM1的结构如下式所示：

其中，DAR的平均值n为5.0。

3.4F314-SPDB-DM4的制备

参考实施例3.3F314-SMCC-DM1的制备，毒素分子用SPDB-DM4代替SMCC-DM1，检测F314-SPDB-DM4的DAR值为3.8。

偶联物F314-SPDB-DM4的结构如下式所示：

其中，DAR的平均值n为3.8。

3.5F314-C4-VC-PAB-MMAE的制备

将F314抗体以1-10mg/mL的浓度溶解在PBS(pH7±0.2)缓冲溶液中，将NC4-VC-PAB-MMAE或PC4-VC-PAB-MMAE溶解于DMA中，浓度10mg/mL，待完全溶解后，取6-10倍摩尔当量的NC4-VC-PAB-MMAE或PC4-VC-PAB-MMAE溶液加入到抗体溶液中进行偶联，DMA的最终体积含量控制在5％左右，室温避光反应2-24小时，在该时间范围内HIC-HPLC监测反应产物的DAR，待DAR接近目标DAR时终止反应(由于产物ADC的DAR值随反应时间而变化，因此根据目标产物ADC的DAR值，通过HIC-HPLC监测反应产物，决定反应终点)。使用分子截留量50kD的超滤管对反应体系进行缓冲液置换，同时去除DMA和未反应的毒素分子；最终偶联产物保存在PBS(pH7±0.2)缓冲溶液。采用HIC-HPLC法测得偶联物F314-C4-VC-PAB-MMAE的DAR的平均值为2.1。

偶联物F314-C4-VC-PAB-MMAE的结构如下式所示：

其中，DAR的平均值n为2.1。

DAR均值计算方法为：DAR均值＝(0*DAR0面积百分比(％)+1*DAR1面积百分比(％)+2*DAR2面积百分比(％)+3*DAR3面积百分比(％)+4*DAR4面积百分比(％))/100

计算结果如下：

3.6F314-C5-VC-PAB-MMAE的制备

参考实施例3.5F314-C4-VC-PAB-MMAE的制备，将毒素分子替换为NC5-VC-PAB-MMAE或PC5-VC-PAB-MMAE，同时分别取2倍、6倍、7.5倍、10倍摩尔当量的毒素分子加入到抗体溶液中进行偶联，制备得到DAR的平均值分别为0.8、1.8、2.3和3.0的产物；

偶联物F314-C5-VC-PAB-MMAE的结构如下式所示：

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其中，DAR的平均值n分别为0.8、1.8、2.3或3.0。

DAR均值计算方法为：DAR均值＝(0*DAR0面积百分比(％)+1*DAR1面积百分比(％)+2*DAR2面积百分比(％)+3*DAR3面积百分比(％)+4*DAR4面积百分比(％))/100

计算结果如下：

质谱检测结果和HIC-HPLC结果一致，质谱实测各DAR组分与裸抗(DAR0)的分子量差值如下：

3.7F314-C6-VC-PAB-MMAE的制备

参考实施例3.5F314-C4-VC-PAB-MMAE的制备，将毒素分子替换为NC6-VC-PAB-MMAE或PC6-VC-PAB-MMAE，采用HIC-HPLC法测得偶联物F314-C6-VC-PAB-MMAE的DAR的平均值为2.1。

偶联物F314-C6-VC-PAB-MMAE的结构如下式所示：

其中，DAR的平均值n为2.1。

DAR均值计算方法为：DAR均值＝(0*DAR0面积百分比(％)+1*DAR1面积百分比(％)+2*DAR2面积百分比(％)+3*DAR3面积百分比(％)+4*DAR4面积百分比(％))/100

计算结果如下：

3.8F1-SMCC-DM1的制备

参考F314-SMCC-DM1的制备，将单抗用F1代替F314，制备得到F1-SMCC-DM1，检测F1-SMCC-DM1的DAR的平均值n为5.5。

其中，DAR的平均值n为5.5。

实施例4：ADC对阳性肿瘤细胞的体外杀伤活性

将待测ADC或抗体样品分别用1640+10％FBS(Gibco)完全培养基稀释到首浓度6.67μg/mL，然后3倍梯度稀释，共5个浓度点，100μL/孔，加入到96孔细胞板中，并设置零浓度对照孔(即加入不含待测ADC或抗体样品的完全培养基)。收集处于对数生长期的DB细胞(南京科佰生物科技有限公司)，用1640+10％FBS(Gibco)完全培养基稀释到0.8-1.2×10

结果如图1所示，对于抗原表达阳性的肿瘤细胞DB，单抗F1和F314没有直接杀伤作用，偶联不同毒素的ADC均有显著程度的杀伤作用，并且F314-SMCC-DM1、F314-SPDB-DM4、F314-MC-VC-PAB-MMAE、F314-MC-MMAF的杀伤活性优于F1-SMCC-DM1。

实施例5：ADC的体内抗肿瘤活性

取Mino细胞(ATCC)5×10

实施例6ADC对阴性肿瘤细胞的体外杀伤活性

将待测ADC或抗体样品分别用McCoy,s 5A+10％FBS完全培养基稀释到首浓度6.67μg/mL，然后3倍梯度稀释，共5个浓度点，100μL/孔，加入到96孔细胞板中，并设置零浓度对照孔(即不含待测ADC或抗体样品的完全培养基)。收集处于对数生长期的SKOV-3细胞(ATCC)，用McCoy,s 5A+10％FBS完全培养基稀释到0.8-1.2×10

结果如图3所示，对于不表达人CD39的肿瘤细胞SKOV-3，F314单抗及其偶联不同毒素的ADC(F314-MC-MMAF、F314-MC-VC-PAB-MMAE、F314-C4-VC-PAB-MMAE、F314-C5-VC-PAB-MMAE和F314-C6-VC-PAB-MMAE)均没有杀伤作用，说明本发明的ADC具有良好的靶向性，并且ADC稳定，没有因为毒素分子的脱落造成非特异性杀伤。

实施例7ADC对阳性肿瘤细胞的亲和活性

用1×PBS将待测ADC或抗体样品稀释至首浓度20μg/mL，然后3倍梯度稀释，共7个浓度点，50μL/孔加入96孔V底板中，同时设置零浓度对照孔(即加入不含ADC或抗体待测样品的完全培养基)。收集MOLP-8细胞(DSMZ)，用1×PBS重悬至8.0×10

结果如图4所示，F314单抗和本发明ADC均对表达CD39的MOLP-8细胞具有亲和力，且ADC的亲和力和裸抗(即F314单抗)相比，没有显著变化。

实施例8ADC的内吞活性

用1×PBS将待测ADC或抗体样品稀释至20μg/mL，100μL/管加入1.5ml离心管中。收集MOLP-8细胞，用1×PBS重悬至1.0×10

结果如图5所示，ADC保留了裸抗的内吞活性。

实施例9不同DAR值的F314-C5-VC-PAB-MMAE对阳性肿瘤细胞的体外杀伤活性

将待测ADC或抗体样品分别用1640+10％FBS完全培养基稀释到首浓度20μg/mL，然后再稀释10倍至2μg/mL，100μL/孔，加入到96孔细胞板中，并设置零浓度对照孔(即不含ADC或抗体待测样品的完全培养基)。收集处于对数生长期的DB细胞，用完全培养基稀释到0.8-1.2×10

结果如图6所示，DAR范围0.8～3.0的F314-C5-VC-PAB-MMAE，在10μg/mL和1μg/mL作用浓度下，对阳性肿瘤细胞的杀伤活性相对裸抗体F314都有显著提高。